Alkohol-Dehydrogenase (ADH)

Katalysierte Reaktion:
Alkohol-Dehydrogenase (ADH)
R-CHO + NADH + H + R-CH2-OH + NAD +
ADH
allgemeine Eigenschaften:
• ca. 141 kDa (Hefe-ADH; Leber-ADH: ca. 87 kDa)
• 4 identische Untereinheiten zu je 35 kDa
• in jeder Unterheit: ein aktives Zentrum, NAD + , Zn2+ • NAD + eingelagert in „Rossmannfalte“
• pH-Bereich: 8,4-9,5; Optimum bei 8,8
• Vorkommen: Hefen, einige Bakterien, tierische Organismen (Leber)
• Spezifität: - Hefe: kleine Alkylreste (Optimum: Ethanol)
- Leber: grosse Alkylreste
• Affinität zu Ethanol: Hefe-ADH < menschl. ADH < Pferde-ADH
(K M = 5*10 -4 M)

Aktives Zentrum der ADH:
Zn 2+ ist koordinativ an die
S-Atome zweier Cystein-
Reste gebunden.
Zn 2+ polarisiert die Carbonylgruppe
des Substrats und
stabilisiert so den Übergangszustand.
Es wird stereoselektiv das
pro-R H-Atom des NADH
umgesetzt.
Der Angriff des H - erfolgt auf
der re-Seite des Aldehyds.

Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD + )

Die Rolle von NAD + als Cofaktor:
•NAD + dient als Wasserstoff-Akzeptor:
H- wird aufgenommen, der Pyridinring reduziert, das N-Atom
verliert seine positive Ladung.
•HAund HB sind diastereotop, durch 1H-NMR unterscheidbar.
•H-wird von ADH selektiv an der Pos. A angelagert.
� das Enzym ist chiral, es kann zwischen den beiden Positionen
unterscheiden!

Aktivitätstest bei NAD + -abhängigen Reaktionen:
• NADH absorbiert im Gegensatz zu NAD + Licht der Wellenlänge 340 nm
� Reaktionsverlauf kann sehr einfach spektroskopisch verfolgt werden
• Die Reduktion von NAD + wird sehr häufig als Indikator-Reaktion eingesetzt,
wenn sich eine best. Reaktion nicht direkt spektroskopisch messen
lässt � gekoppelter Test

Reaktion von NAD + mit Basen:

Reaktion von NADH mit Säuren:

Reaktion von Semicarbazid:
quantitative Verschiebung des Reaktions-Gleichgewichts
durch Semicarbazid
� Bestimmung von Substratmengen möglich
� nach Zugabe von Semicarbazid keine Kinetik-Messungen
mehr möglich

Katalysierte Reaktion:
allgemeine Eigenschaften:
Hexokinase
• wichtiges Stoffwechselenzym (1. Schritt der Glycolyse)
• ca. 96 kDa (Hefe-Hexokinase)
• Homo-Tetramer � 4 identische Untereinheiten
• Phosphatdonor: ATP
• Cofaktor: Mg2+ -Ionen

Adenosintriphosphat (ATP)

Phosphorylisierung von Glucose in 6-Position
� durch zwei Enzyme möglich:
Hexokinase:
• unspezifisch (phosphoryliert u.a. auch Fructose, Mannose, Glucosamin)
• Vorkommen: gesamter Organismus
• Inhibitor: Glucose-6-phosphat (Produktinhibition)
• niedriger K M-Wert � arbeitet schon bei geringer Glucose-Konzentration
• Reaktion ist intrazellulär irreversibel
Glucokinase:
• sehr spezifisch
• Vorkommen: nur in der Leber
• Inhibitor: Insulin
• stellt Glucose-6-phosphat für die Synthese von Glycogen bereit
• hoher K M-Wert � wird erst bei hohem Glucosespiegel aktiv
� Versorgung von Gehirn und Muskulatur sichergestellt
• Reaktion ist intrazellulär irreversibel

Die Bedeutung von Glucose-6-phosphat
Bedeutung des Pentosephosphatcyclus:
• Tiere: Bereitstellung von Ribose � Nucleinsäuren, Nucleotid-Coenzyme
• Pflanzen: Ribulose-1,5-biphosphat � CO 2-Akzeptor (Calvin-Cyklus)
• gebildetes NADPH+H + : Synthese von Fettsäuren, Cholesterin u.ä.

gekoppelter Test zur Bestimmung der Hexokinase-Aktivität

Überblick: Die Rolle der Enzyme Hexokinase und ADH

Messprinzipien:
• Enzymaktivität
Die Enzymaktivität wird aus der Zu- oder Abnahme der Reaktionsprodukte
mit der Zeit ermittelt.
Folgende Reaktionsbedingungen sollten dabei optimal sein:
- Substratkonzentration
-pH-Wert
- Ionenstärke des Puffers
- die Temperatur sollte 25°C betragen
gebräuchliche Masseinheit für die Enzymaktivität seit 1961:
Eine internationale Enzymeinheit (Unit, U) ist die Enzymmenge, die
unter obigen optimalen Bedingungen 1 µmol Substrat pro Minute
umsetzt.
Die spezifische Aktivität wird ausgedrückt in Units/mg Protein.
Sie ist ein Mass für die Reinheit des Enzyms.

Messprinzipien:
• Substratkonzentration
Zur quantitativen Bestimmung von Substratkonzentrationen gibt es
zwei Möglichkeiten:
- Endwertmethode: Man lässt die Reaktion vollständig ablaufen und
bestimmt entweder die verbrauchte Substratmenge
oder die Menge des gebildeten Produkts.
Bei dieser Methode verwendet man viel Enzym
bei rel. wenig Substrat.
- Anfangsgeschwindigkeit: wenn die Anfangsgeschwindigkeit einer
Reaktion genügend klein ist, ist sie
proportional zur Substratkonzentration.
� durch Messung der Anfangsgeschw.
ist die Bestimmung von [S] möglich.

Aufgabenstellung:
• Bei dem Enzym ADH soll bestimmt werden:
-Aktivität
- spezifische Aktivität
- Konzentration einer unbekannten Alkohollösung
- Michaelis-Konstanten K M und v max
- Gleichgewichtskonstante k und Konzentration der beteiligten Substanzen
• Bei dem Enzym Hexokinase soll bestimmt werden:
-Aktivität
- spezifische Aktivität
- Michaelis-Konstanten K M und v max