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LABORWELT

Nr. 1 / 2005 - Vol. 6 Das -Themenheft

Echtzeitvisualisierung

kleiner GTPasen in

lebenden Zellen

Zelluläres Imaging

in der Arzneimittel-

Entwicklung

Zellbiologie

Neue Tools für die

Transfektion von

Stammzellen

Marktübersicht:

Equipment für die

Zellkultur

Simulation von

Blutgefäßen in

Zellkultur-Biochips

Mikrofluidische

zellbasierte Assays

Voll funktionelle

dendritische Zellinien

BIOCOM AG


TWO-COLOR WESTERN BLOTS

IN-CELL WESTERN ASSAYS

IN VIVO IMAGING

Data Courtesy J. Skoch & B. Bacskai

Massachusetts General Hospital

TISSUE IMAGING

Data Courtesy C. Kearn

University of Washington

WHAT CAN YOU SEE WITH INFRARED?

RESULTS.

The Odyssey ® System provides a flexible platform for

a variety of applications. Direct infrared detection

provides highly accurate quantification and extreme

sensitivity compared to chemiluminescence. With two

detection channels you can probe two separate targets

or increase quantification accuracy by using the second

channel for normalization.

Odyssey is a versatile platform that delivers results from

a variety of media including, membranes, gels, glass

slides, and microplates.

The superior signal to noise ratio

provided by LI-COR IRDye infrared

dyes produces results not possible

with other imaging systems.

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generating with the Odyssey System, click on

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available papers and research.

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LI-COR Biosciences Ltd. • St. John's Innovation Centre • Cowley Road

Cambridge CB4 OWS • Phone: 0044 (0) 1223 422 104 • Email: UK@licor.com

LI-COR, Odyssey and IRDye are trademarks or registered trademarks of LI-COR, Inc.



Zum Thema


Gute Förderchancen

für die Zellbiologie

Zell- und Entwicklungsbiologen können sich freuen. Das Europäische

Parlament präsentierte Ende Januar den sogenannten ITRE-Report,

der sich mit den Forschungsbudgets der künftigen Forschungsrahmenprogramme

der Europäischen Union (EU) und den entsprechenden

Förderschwerpunkten beschäftigt. In diesem stellen die Europarlamentarier

fest, daß die mit dem 7. Forschungsrahmenprogramm

(FP7) angestrebte Verdopplung des aktuellen 17,5 Mrd. a-Budgets

das absolute Minimum sei und „von den Mitgliedsländern nicht in

Frage gestellt werden dürfe“.

Zudem kündigte der neue EU-Forschungskommissar, Janez Potocnik,

an, die Forschung an humanen embryonalen Stammzellen

(hES) im vereinten Europa endlich mit Finanzmitteln auszustatten.

Dazu will er Gespräche mit bislang blockenden Ländern – darunter

Deutschland – suchen, um gemeinsam ethische Mindeststandards für

den Umgang mit hES zu etablieren.

Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter

www.biocom.de oder auf unserer Fax-Seite (S. 53). Wenn

Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen,

Name und Adresse angeben und faxen/mailen – Sie

erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.

Ein guter Teil des für die Biowissenschaften vorgesehenen FP7-

Förderkuchens dürfte in die Zellbiologie fließen, da diese einerseits

die Grundlage für die zellbasierte Produktion und das Screening

neuartiger Pharmawirkstoffe bildet (siehe dazu Beiträge Seite 15, 21,

Marktübersicht Seite 39). Zum anderen ermöglichen neue Imagingtools,

autofluoreszente Proteine und Farbstoffe (siehe Beitrag Seite 4)

– im Gegensatz zu den auf in vitro- Bedingungen beschränkten omics-

Technologien – einen immer detaillierteren Einblick in die Vorgänge

innerhalb der lebenden Zelle. Zudem können neuentwickelte Zellinien

die materielle Basis für die Entwicklung künftiger Immuntherapien

(siehe Beitrag Seite 10) bilden.

Mit derartigen Forschungsschwerpunkten ist die Zellbiologie strategisch

günstig positioniert – an der Schnittstelle von angewandter

und Grundlagenforschung. Dies ist nicht unwichtig. Denn mit dem

nächsten Rahmenprogramm ändern die Eurokraten ihre Förderstrategie

und fokussieren – statt ausschließlich auf anwendungsorientierte

Industrieprojekte – verstärkt auf die anwendungsorientierte Grundlagenforschung.

Mit Blick auf den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn

scheinen die Disziplinen Immunologie und Zellbiologie gut gerüstet

– einen kleinen Überblick finden Sie in dieser Themenausgabe.

Eine interessante Lektüre wünscht Ihnen

Thomas Gabrielczyk

Pseudocolorierte Aufnahme des bakteriellen Pathogens

Neisseria gonorrhoeae (rot) beim Eindringen in

humane Epithelzellen (grün). Die Abbildung ist derzeit

auf der Wanderausstellung „Bilder aus der Wissenschaft“

der Max-Planck-Gesellschaft zu sehen.

© Dr. Volker Brinkmann, MPI f. Infektionsbiologie, Berlin

Kennziffer 11 LW 01 · Informationen ordern? · www.biocom.de

I N T R O

INHALT �

R E P O R T

� Echtzeit-Visualisierung kleiner GTPasen 4

in lebenden Zellen

Rico Pusch und Dr. Ignacio Rubio,

Institut für Molekulare Zellbiologie, Medizinische Fakultät,

Friedrich-Schiller-Universität Jena

B L I T Z L I C H T

� Eine voll funktionsfähige humane 10

dendritische Zellinie

Dr. Hans Baumeister und Dr. Stefan Goletz,

Glycotope GmbH, Berlin

B L I T Z L I C H T

� Microfluidic Cell based Assays 15

Jude Dunne, Vy Trinh, Esther Huang, Holly Reardon,

Dr. Irina Kazakova und Dr. Javier Farinas,

Caliper Life Sciences, Mountain View, USA

B L I T Z L I C H T

� Zelluläres Imaging 21

in der Medikamentenentwicklung

John Anson, GE Healthcare, UK

W I S S E N S C H A F T

� Alterungsassoziierter Östrogenrezeptor-Verlust 24

in Brustepithelzellen

Prof. Dr. Dr. Ralf Hass, Medizinische Hochschule Hannover

B L I T Z L I C H T

� Neue Tools für die Transfektion von Stammzellen 26

Dr. Peter Buttgereit, Dr. Klaus Lun und Dr. Oliver Müller,

amaxa GmbH, Köln

B L I T Z L I C H T

� Multiparametrische DNA-Zytometrie 29

mit DRAQ5

Dr. Michael Kapinsky, Beckman Coulter GmbH, Krefeld

Dr. Johannes Fischer, Medizinische Einrichtungen

der Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf

W I S S E N S C H A F T

� 8. Joint Meeting Signal Transduction 32

Prof. Dr. Dr. Ralf Hass, Medizinische Hochschule Hannover

B L I T Z L I C H T

� Simulation von Blutgefäßen 34

in Zellkultur-Biochips

Dr. Ulf Rädler, Dr. Roman Zantl, ibidi GmbH, München

M A R K T Ü B E R S I C H T

� Equipment für die Zellkultur 39

� Stellenmarkt 47

� Verbände 50

� Produktwelt 51

� Fax-Seite 53

� Termine/Impressum 54

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 3


In vivo-Imaging


Echtzeit-Visualisierung kleiner

GTPasen in lebenden Zellen

Rico Pusch und Dr. Ignacio Rubio, Institut für Molekulare Zellbiologie,

Medizinische Fakultät, Friedrich-Schiller-Universität Jena,

Die Visualisierung zellbiologischer Prozesse in Echtzeit nimmt einen immer höheren Stellenwert

in der biomedizinischen Forschung ein. Die weitverbreitete Nutzung fluoreszierender

Proteine hat eine Flut an Daten zur Kompartimentierung zellulärer Prozesse geliefert und

führte zu Einsichten, die mit konventionellen biochemischen und molekularbiologischen

Methoden nicht oder nur schwer erhalten werden können. Neben der stetig fortschreitenden

Optimierung fluoreszenzmikroskopischer Verfahren stellt zunehmend die Entwicklung

geeigneter molekularer Detektor-Sonden für das jeweils untersuchte Zielmolekül den limitierenden

Faktor beim Entwurf einer Visualisierungsmethodik dar. Das Beispiel der kleinen

GTPasen der Ras-Familie zeigt auf beeindruckende Weise die Vielfalt möglicher Ansätze

für die Lebendzell-Visualisierung aktiver Proteine sowie die Vielfalt an Fehlerquellen und

Limitierungen der verschiedenen Verfahren.

Key Words: Visualisierung, Fluoreszenz, Echtzeit, Ras, GTPase

Zellen sind in der Lage, unterschiedliche

extra- und intrazelluläre Informationen

zu erfassen, zu integrieren und darauf mit

zellulären Prozessen zu reagieren. Für die

Weiterleitung extrazellulärer Signale sind

verschiedene gutuntersuchte Signalkaska-

R E P O R T

den etabliert. Die Verwendung mehrerer

hintereinander geschalteter Proteine ermöglicht

den „Transport“ des Signals, zum

Beispiel von der Plasmamembran in den

Zellkern, die Amplifizierung des Signals

und vor allem die Vernetzung von Signal-

Abb. 1: Subzelluläre Lokalisation von Ras-Proteinen in der Säugerzelle. Alle drei Ras-Isoformen

durchlaufen eine Reihe von post-translationalen kovalenten Modifizierungen (Prenylierung, proteolytische

Prozessierung, Methylierung, und bei H- und N-Ras Palmitoylierung) an bestimmten

Konsensus-Sequenzen im C-Terminus (abgekürzt: CAAX), welche graduell die Hydrophobizität

von Ras erhöhen und über verschiedene subzelluläre Zwischenstationen zum Einbau des fertig

prozessierten Ras-Holoproteins in die Plasmamembran führen. Während H- und N-Ras den

konventionellen sekretorischen Weg über Endoplasmatisches Retikulum und Golgi-Apparat

durchlaufen, gelangt post-translational modifiziertes K-Ras auf noch unbekannter Route an die

Plasmamembran.

kaskaden auf unterschiedlichen Ebenen.

Somit verfügt die Zelle über ein scheinbar

unübersehbares komplexes Netzwerk an

Signalproteinen, die sich auf vielfältigen

Wegen gegenseitig beeinflussen können. Für

die Funktionsfähigkeit dieses Netzwerks

ist es entscheidend, daß die einzelnen Signaltransduktions-Ereignisse

zur richtigen

Zeit und an der richtigen Stelle innerhalb

der Zelle stattfinden. Viele biochemische

Methoden, die den Aufschluß von Zellen

erfordern, sind in ihrer zeitlichen Auflösung

beschränkt und liefern in der Regel keine

räumlichen Informationen. Außerdem ergeben

sie immer nur einen Durchschnitt der

gesamten Zellpopulation. Die Entdeckung

und Optimierung fluoreszenter Proteine,

begleitet von der technischen Weiterentwicklung

mikroskopischer Methoden in den

letzten Jahren, war grundlegend für die ersten

Erfolge der räumlich-zeitlichen Analyse

intrazellulärer Prozesse. Das Grün-fluoreszierende-Protein

(GFP) wurde 1992 aus der

Qualle Aequorea victoria isoliert 1 . Ausgehend

von Wildtyp-GFP wurden inzwischen

mehrere Proteine mit höherer Fluoreszenzintensität

und auch unterschiedlichen

spektralen Eigenschaften entwickelt und

für den zellbiologischen Einsatz optimiert.

Dieses Set an Fluoreszenzmarkern erlaubte

die Entwicklung vielfältiger Methoden zur

mikroskopischen Analyse der Lokalisation,

Interaktion und Aktivierung von Proteinen

in lebenden Zellen.

Kleine GTPasen – biologische Schalter

in der Signaltransduktion

Kleine GTPasen der Ras-Familie arbeiten

als zellbiologische Schalter für eine Vielzahl

zellulärer Prozesse. Über ihren Aktivierungszustand

entscheidet die Art des gebundenen

Guaninnukleotids. In GTP-gebundener Form

sind sie aktiv und leiten Signale über sogenannte

Effektoren, welche spezifisch an die

GTP-Form binden, weiter. Die Abschaltung

des Signals erfolgt durch GTPase-aktivierende

Proteine (GAP), deren Bindung zur

Hydrolyse von GTP zu GDP führt. Guaninnukleotid-Austauschfaktoren

(GEFs) wiederum

katalysieren den Austausch von GDP zu GTP

und damit die erneute Aktivierung der GTPase.

Viele der kleinen GTPasen durchlaufen

einen post-translationalen Reifungsprozeß,

bei denen sie mit C-terminalen Lipidmodifizierungen

versehen werden. Diese sind ausschlaggebend

für die Membranverankerung

der GTPasen. In Abbildung 1 ist schematisch

die post-translationale Modifizierung von

Ras gezeigt. Die zentrale Rolle kleiner GTPasen

in der Regulation zellulärer Reaktionen

hat die Erforschung ihrer subzellulären

Aktivierungsmuster mit einer Vielzahl von

Kennziffer 12 LW 01 · www.biocom.de �

4 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


Expression Proteomics // Tools for Protein Separation and Analysis www.expressionproteomics.com

2-D gel before cleanup 2-D gel after cleanup

Problem Resolved.

Sample Preparation // Tools for Protein Sample Cleanup and Fractionation

General-Purpose Cleanup

Enhanced Resolution and Reproducibility

■ Remove contaminants

■ Ensure good resolution

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Fractionation

The Quest for Low-Abundance Proteins

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Abb. 2: Schematische Darstellung von Fluoreszenzsonden für die Visualisierung von aktivem

Ras-GTP in lebenden Zellen. Die Spezifität der Sonden für Ras-GTP beruht auf der RBD-Domäne

von Raf-1, welche selektiv mit Ras-GTP interagiert. Die Domänenstruktur von Raf-1 ist zum

Vergleich abgebildet. CR1-3: „Constant Region“ 1-3; RBD: „Ras Binding Domain“; CRD: „Cysteine

Rich Domain“; GFP: „Green Fluorescent Protein“; YFP: „Yellow Fluorescent Protein“; CFP: „Cyan

Fluorescent Protein“. PM: Plasmamembran; CAAX: C-Terminus von Ras, Zielstruktur der posttranslationalen

Modifikationen. 1 Diese Sonde wurde in dem in Abb. 3 gezeigten Versuch benutzt,

2 Diese Sonde wurde in dem in Abb. 4 gezeigten Versuch benutzt.

experimentellen Ansätzen beflügelt. Fluoreszenzsonden,

welche die Visualisierung

von aktivem Ras, Rac, Rap, Ral, Cdc42,

Rab6A und Ran (allesamt Ras-verwandte

kleine GTPasen) ermöglichen, sind bereits

beschrieben worden. Im folgenden sollen am

Beispiel von Ras die Entwicklung, Nutzung

sowie experimentelle Grenzen verschiedener

Fluoreszenzsonden zur Detektion von aktivem

Ras-GTP beschrieben werden.

Visualisierung der Ras-Aktivität

Abbildung 2 stellt schematisch die Zusammensetzung

bislang benutzter Ras-GTP

-Fluoreszenzsonden dar. Alle aufgeführten

Konstrukte sind peptidischer Natur und

0 min 10 min 40 min

R E P O R T

beinhalten als Fluoreszenzmarker verschiedene,

der jeweiligen Meßmethodik

angepaßte fluoreszierende Proteine wie etwa

GFP (grün) oder YFP (gelb). Der eigentliche

Detektor, welcher die Spezifität für die Detektion

von Ras-GTP gewährleisten soll, ist

in allen aufgeführten Sonden ein Fragment

der Raf-1-Kinase. Die Raf-1 Kinase ist ein

Effektor-Protein von Ras, welches Signale,

die von aktivem Ras-GTP ausgestrahlt

werden, in die Zelle hinein weiterleitet. Im

Einklang mit seiner Funktion wechselwirkt

Raf-1 mit Ras-GTP, jedoch nicht mit Ras-

GDP (oder zumindest mit einer im Vergleich

dazu verschwindend kleinen Affinität) über

eine N-terminale Domäne, die den Namen

RBD für „Ras Binding Domain“ trägt. Diese

Abb. 3: Aktivierung von überexprimiertem Ras in COS-7-Affennierenzellen. Ras und die in

Abb. 2 indizierte GFP-RBD-Sonde wurden gemeinsam in COS-7-Epithelzellen exprimiert. Nach

einer Hungerphase wurden die Zellen mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) stimuliert und

die Umverteilung von GFP-RBD mittels konfokaler Laser-Mikroskopie verfolgt. Beobachtet wird

eine rasche Umverteilung der Sonde zur Plasmamembran und eine zeitlich versetzte Akkumulation

am Golgi-Apparat 3 . Barren: 10 µm. Wiedergabe der Abbildung mit freundlicher Genehmigung

von Nature Cell Biology (www.nature.com/ncb) und der Autoren.

Eigenschaft wird von sämtlichen Fluoreszenzsonden

genutzt, um eine ausschließliche

Bindung an aktives, GTP-beladenes Ras

zu erreichen.

Die Bindung der Fluoreszenzsonde an

Ras-GTP kann prinzipiell auf zwei Arten

nachgewiesen werden, die entsprechend in

Rekrutierungssonden und FRET-basierte

Sonden unterschieden werden. Rekrutierungssonden

erfahren durch Bindung an

Ras-GTP eine Umverteilung innerhalb der

Zelle, so daß subzelluläre Strukturen, an

denen Ras aktiviert wird, stärker gefärbt

werden. Detektiert wird also das Signalverhältnis

von freier Sonde im Zytosol zu

Ras-assoziierter Sonde an Membranen.

FRET („Fluorescence Resonance Energy

Transfer“) ist ein strahlungsloser Transfer

der Anregungsenergie von einem zuvor

angeregtem Donor-Fluorophor auf einen

Akzeptor-Fluorophor. Die Effizienz des Energietransfers

korreliert dabei stark mit dem

Abstand beider Fluorophore, der nur wenige

Nanometer betragen darf. Im Fall von Ras

kann die Bindung YFP-markierter RBD an

CFP-markiertes Ras-GTP durch FRET nachgewiesen

werden (Abb. 2). FRET-Ansätze

sind theoretisch sensitiver als solche, die auf

der Rekrutierung/Umverteilung von GFP-

RBD-Sonden basieren. Allerdings erfordern

sie gleichzeitig auch eine Vielzahl an Kontrollversuchen,

um beispielsweise gleiche

Expressionsspiegel von Akzeptor und Donor

zu gewährleisten, direkte Donor-Anregung

sowie andere mögliche Quellen für Artefakte

auszuschließen.

Rekrutierungssonden

Daß jede Art von Sonde Vor- und Nachteile

birgt, zeigt sich eindrucksvoll am Beispiel

von Ras. Bondeva et al. stimulierten NIH3T3-

Fibroblasten mit dem Wachstumsfaktor aus

Blutplättchen (PDGF), einem bekannten

Aktivator von Ras, und beobachteten eine

Umverteilung von RBD-CRD-GFP-Sonden

(siehe Abb. 2) zur Plasmamembran 2 . Im

Einklang mit dem herkömmlichen Modell

der GEF-Rekrutierung durch Plasmamembran-ständige,

aktivierte Rezeptoren lautete

die Schlußfolgerung, daß Ras unter diesen

Bedingungen an der Plasmamembran aktiviert

wird. Philips und Mitarbeiter jedoch

machten mit einer strukturell ähnlichen

Sonde, GFP-RBD (siehe Abb. 2), eine andere

Beobachtung. Sie stimulierten COS-7-Epithelzellen

mit dem epidermalen Wachstumsfaktor

(EGF) und detektierten eine schnelle

Umverteilung der Sonde hin zur Plasmamembran,

gefolgt von einer verzögerten Anhäufung

von GFP-RBD am Golgi-Apparat 3

(Abb. 3). Des weiteren konnten die Autoren

Ras-Aktivierung an Plasmamembran und

Golgi durch verschiedene experimentelle

Manipulationen voneinander trennen und

einzeln herbeiführen und schlußfolgerten

6 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


daher, daß unterschiedliche Mechanismen

voneinander unabhängig Ras-Aktivierung

an beiden subzellulären Strukturen

vermitteln.

FRET-basierte Sonden

Der Befund, daß Ras potentiell an verschiedenen

Orten innerhalb der Zelle aktiviert

werden kann, erregte großes Aufsehen unter

den „Ras-Forschern“ und mehrere Arbeitsgruppen

nahmen sich folglich der Visualisierung

der Ras-Aktivierung mit alternativen

Methoden an. Jiang und Sorkin verwandten

hierzu einen FRET-basierten Ansatz 4 . Sie exprimierten

Ras und RBD, jeweils gekoppelt

an Donor- und Akzeptor-Fluorophore (Abb.

2), in A431-Epithelzellen und beobachteten

ein starkes FRET-Signal an perinukleären,

Golgi-ähnlichen Strukturen innerhalb ruhender

Zellen in Abwesenheit von stimulieren-

den Wachstumsfaktoren. Dieses FRET-Signal

ließ sich durch EGF-Zugabe nicht weiter

verstärken. Die Autoren erklärten dies damit,

daß überexprimiertes Ras sich den zellulären

Regulationsmechanismen entzieht und somit

Visualisierungsmethoden, die auf der Überexpression

von Ras beruhen, nicht geeignet

sind, um die physiologisch relevanten Ras-

Aktivierungsmechanismen zu untersuchen.

Jedoch mußten auch Philips und Mitarbeiter

Ras überexprimieren, um die beobachtete

Umverteilung der GFP-RBD-Sonde (Abb. 3)

detektieren zu können. Wie von den Autoren

selbst erwähnt, war der Grad der GFP-RBD-

Umverteilung nach Stimulation von Zellen,

welche kein Ras überexprimierten, zu gering,

um erfolgreich dokumentiert zu werden 3 . In

der Tat stellt dies ein generelles Problem bei

der Verwendung von Rekrutierungssonden

zur Lebendzellvisualisierung biochemischer

Prozesse dar. Oftmals ist das Ausmaß der

beobachteten Reaktion (hier die Menge an

Wachstumsfaktor-induziertem endogenem

Ras-GTP) zu gering, um die Fraktion an

rekrutierter Fluoreszenzsonde vor dem

Hintergrund an freier Sonde darstellen zu

R E P O R T

können. Abhilfe schafft in solchen Fällen die

Überexpression des Zielproteins (hier Ras)

was wiederum eine mögliche Quelle von

Artefakten sein kann.

Um dieses Problem zu umgehen, haben

Matsuda und Mitarbeiter einen grundsätzlich

anderen Ansatz entwickelt 5 . Sie benutzten

einen FRET-Sensor, ähnlich dem oben beschriebenen,

mit dem Unterschied, daß Ras

und RBD fl ankiert von Donor- und Akzeptor-

Fluorophor in cis auf einer Polypeptidkette

angeordnet waren. Um die korrekte subzelluläre

Lokalisation dieses tetra-chimären Konstruktes

innerhalb der Zelle zu gewährleisten,

fügten die Autoren noch die C-terminale

Sequenz von Ras (CAAX) (Abb. 2) ein, welche

für die post-translationale Prozessierung und

Membranlokalisierung von Ras zuständig ist

(Abb. 1). Mit Hilfe dieses Sensors wiesen die

Autoren ein durch EGF-induziertes FRET-

Signal an der Plasmamembran von COS-7-

0 min 5 min 30 min

Abb. 4: Ras-Aktivierung in COS-7-Affennierenzellen, visualisiert mit der in Abb. 2 angegebenen

YFP-Ras-RBD-CFP-CAAX FRET-Sonde. Nach einer Hungerphase wurden die Zellen mit epidermalem

Wachstumsfaktor (EGF) stimuliert und das FRET-Signal als Sensor für lokale Ras-Aktivierung

erfaßt. Beobachtet wird ein EGF-induziertes FRET-Signal, das sich ausgehend von der

Plasmamembran über die Zelle verteilt 5 . Wiedergabe der Abbildung mit freundlicher Genehmigung

von Nature (www.nature.com) und der Autoren.

Zellen nach (Abb. 4). Sie beobachteten kein

Signal in Kernnähe (und somit in Golgi-Nähe)

und schlußfolgerten, daß Ras ausschließlich

an der Plasmamembran aktiviert wird. Die

Eleganz dieses Ansatzes darf jedoch nicht

über dessen offensichtliche Limitierungen

hinwegtäuschen. Beispielsweise detektiert

dieser Sensor letztendlich nicht das Entstehen

von Ras-GTP, sondern zeigt vielmehr das lokal

herrschende Verhältnis von GEF- zu GAP-

Aktivität. Ob dies gleichgesetzt werden kann

mit der lokalen Aktivierung von endogenem

Ras, ist fraglich. Weiterhin ist es nicht ausgeschlossen,

daß der penta-chimäre FRET-Sensor

aufgrund seines künstlichen Aufbaus sich

innerhalb der Zelle an falschen Strukturen

anhäuft oder sich regulatorischen Prozessen

entzieht, die auf endogenes Ras wirken. Die

mit den hier aufgeführten Methodiken erzielten,

zum Teil gegensätzlichen Ergebnisse

haben eine starke Diskussion bezüglich der

physiologisch relevanten Lokalisation von

aktivem Ras entfacht. Insbesondere die mög-

Kennziffer 13 LW 01 · www.biocom.de �

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LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 7


liche Aktivierung von Ras am Golgi-Apparat

würde neue Konzepte für eine kompartimentierte

Signaltransduktion von Ras bedeuten.

Einig sind sich alle Forscher darin, daß nur

Methoden, die die Visualisierung von endogenem

Ras ermöglichen, einen Ausweg aus

dieser Kontroverse bieten können.

Visualisierung endogener

GTPase-Aktivierung

Visualisierung endogener Spiegel aktiver

GTPasen ist bisher nur mit Rab6A und Cdc42

gelungen 6,7 . Die hierzu herangezogenen, sehr

eleganten experimentellen Ansätze werden im

folgenden kurz beschrieben. Fluoreszenzsonden

zur Verfolgung kleiner GTPasen nutzen

als GTP-spezifisches Modul typischerweise

Bindedomänen entsprechender Effektoren.

Das birgt zwei Nachteile. Zum einen erkennen

derartige Bindedomänen häufig auch verwandte

GTPasen. Zum anderen konkurrieren

sie zwangsläufig auch mit endogenen Effektoren

der untersuchten GTPase. Perez und

Mitarbeitern ist es gelungen, diese Probleme

durch Entwicklung eines Einzelketten-Antikörpers,

der selektiv die GTP-beladene, aktive

Konformation von Rab6A erkennt, zu umgehen

6 . In einem Screen einer kombinatorischen

R E P O R T

Abb. 5: Schematische Darstellung zur

Erkennung der aktiven GTP-beladenen

Konformation von Rab6A durch konformationsspezifische

Einzelketten-Antikörper 6 . Einzelketten-Antikörper

können in Fusion mit YFP

in Zellen exprimiert werden und als Sensoren

für die Aktivierung der endogenen GTPase, in

diesem Fall Rab6A, dienen.

Phage-„display“ Bibliothek von Einzelketten-

Antikörpern wurden Antikörper isoliert, die

GTP-beladenes, aber nicht die GDP-beladene

Konformation von Rab6A erkannten. Das so

erhaltene Antikörperfragment AA2 kann entweder

zum immunohistologischen Nachweis

von aktivem Rab6A in fixierten Zellen oder

in YFP-markierter Form als Rab6A-Sonde

in lebenden Zellen genutzt werden (Abb. 5).

Rab6A reguliert den vesikulären Transport

zwischen Golgi-Apparat und dem Endoplasmatischem

Retikulum. Entsprechend

detektiert AA2-YFP in lebenden HeLa-Zellen

endogenes Rab6A-GTP im Golgi und an

tubulovesikulären Transportintermediaten,

die sich in Richtung Zellperipherie bewegen.

Eine vergleichbare Dynamik der Rab6A-Aktivierung

wurde auch in Zellen, die CFP-Rab6

überexprimieren, beobachtet. Allerdings

treten hier stark vergrößerte tubulovesikuläre

Strukturen auf, die offensichtlich durch die

Überexpression von Rab6A stabilisiert werden.

Dies unterstreicht einmal mehr die mit

der heterologen Expression von Zielproteinen

verbundenen Nachteile.

Solventochrome Fluoreszenz-Farbstoffe

reagieren auf Veränderung ihrer chemischen

Umgebung mit erhöhter Fluoreszenzintensität.

Durch Kopplung des solventochromen

Abb. 6: Schematische Darstellung zur Visualisierung der Cdc42-GTPase durch ein GFP- und

I-SO-markiertes Protein (eine Cdc42-Bindedomäne, in grau), das selektiv Cdc42-GTP gegenüber

Cdc42-GDP erkennt und bindet 7 . Die Bindung führt zu einer erhöhten Fluoreszenzemission des

Farbstoffes I-SO aufgrund der veränderten chemischen Umgebung im Komplex. Gemessen wird

das Verhältnis aus bindungsabhängiger I-SO-Fluoreszenz und bindungsunabhängiger

GFP-Fluoreszenz (Details siehe Text).

Farbstoffes (I-SO) an die Cdc42-Bindedomäne

des Effektors WASP ist es Hahn und Mitarbeitern

gelungen, eine Sonde zu entwickeln, deren

Fluoreszenzintensität sich nach Bindung

an Cdc42-GTP um das zwei- bis dreifache

erhöht (Abb. 6) 7 . Zusätzlich enthält die Sonde

mit GFP einen weiteren Fluoreszenzmarker,

der Cdc42-unabhängige Veränderungen der

Fluoreszenzintensität, beispielsweise durch

unterschiedliche Zelldicken, erfaßt und zur

Normalisierung des I-SO-Fluoreszenzsignals

dient. Nach Mikroinjektion der Sonde in

MEF/3T3-Zellen konnte die basale Aktivierung

von endogenem Cdc42 in Zellfortsätzen

visualisiert werden. Bemerkenswerterweise

kann die Aktivierung nur durch das I-SO /

GFP-Verhältnis, nicht aber durch Verteilung

des GFP-Signals oder des I-SO-Signals allein

nachgewiesen werden. Die Zukunft wird

zeigen, ob es gelingt, solventochrome Sonden

auch für andere GTPasen zu entwickeln. Das

größte dafür zu lösende technische Problem

ist, für jede neue Kombination von Sonde und

Zielprotein herauszufinden, welcher Farbstoff

an welcher Position plaziert werden muß, um

bei Assoziation die gewünschte Fluoreszenzänderung

hervorzurufen.

Viele zelluläre Funktionen erfordern die

streng regulierte räumliche und zeitliche Koordination

der Aktivität von kleinen GTPasen.

Diese in lebenden Zellen zu visualisieren, ist

derzeit eine der spannendsten Aufgaben der

GTPase-Forschung. Es hat sich gezeigt, daß

dabei weniger die technischen Möglichkeiten

limitierend sind, sondern daß vor allem das

Design der Sonde für die Aussagekraft der

jeweiligen Methode entscheidend ist. Die beschriebenen

Visualisierungsmethoden stellen

allerdings bereits jetzt eine unverzichtbare

Komplementierung zu traditionellen molekularbiologischen

Methoden dar.

Literatur

[1] Prasher, D.C., Eckenrode, V.K., Ward, W.W., Prendergast, F.G. and Cormier,

M.J., Gene 111 (1992), 229-233

[2] Bondeva, T., Balla, A., Varnai, P. and Balla, T., Mol Biol Cell 13 (2002), 2323-2333

[3] Chiu, V.K., Bivona, T., Hach, A., Sajous, J.B., Silletti, J., Wiener, H., Johnson,

R.L., 2nd, Cox, A.D. and Philips, M.R., Nat Cell Biol 4 (2002), 343-350

[4] Jiang, X. and Sorkin, A., Mol Biol Cell 13 (2002), 1522-1535

[5] Mochizuki, N., Yamashita, S., Kurokawa, K., Ohba, Y., Nagai, T., Miyawaki,

A. and Matsuda, M., Nature 411 (2001), 1065-1068

[6] Nizak, C., Monier, S., del Nery, E., Moutel, S., Goud, B. and Perez, F.,

Science 300 (2003), 984-987

[7] Nalbant, P., Hodgson, L., Kraynov, V., Toutchkine, A. and Hahn, K.M.,

Science 305 (2004), 1615-1619

Korrespondenzadresse

Dr. Ignacio Rubio

Institut für Molekulare Zellbiologie

Medizinische Fakultät

Friedrich-Schiller-Universität Jena

Drackendorfer Str. 1, D-07747-Jena

Tel: + 49-(0)3641-9325670, Fax: -9325652

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Immunologie


B L I T Z L I C H T

Voll funktionsfähige humane

dendritische Zellinie

Dr. Hans Baumeister und Dr. Steffen Goletz

Glycotope GmbH, Berlin

Dendritische Zellen (DC) spielen eine zentrale Rolle im Immunsystem und finden vielfältige

Anwendungen, zum Beispiel als ‚Tool‘ in vielen immunologischen Laboren oder bei der Impfstoffentwicklung.

Humane DCs werden meist aus Vorläuferzellen isoliert, welche dann in vitro

zunächst zu unreifen (i-DC), dann zu reifen DC (m-DC) differenziert werden. Diese Prozedur

ist relativ aufwendig, die Zahl der gewonnenen DC ist natürlich begrenzt, und die Qualität der

gewonnenen DCs unterliegt starken Schwankungen. Standardisierte Anwendungen sind mit

derartigen Zellen kaum möglich. Wir präsentieren hier NemodDC – eine humane Zellinie,

die ähnlich wie DC-Vorläuferzellen, aus Blutkonserven zu voll funktionsfähigen i-NMDC und

m-NMDC differenziert werden kann. Bei Differenzierung in Anwesenheit von TGF-β können

auch dendritische Zellen vom Langerhans-Typ (NMLC) erzeugt werden. Es werden Daten zum

Phänotyp und zur Fähigkeit dieser (Antigen-präsentierenden) Zellen gezeigt, native T-Zellen

Antigen-spezifisch zu stimulieren. Darüber hinaus können die dendritischen Produkte von

NemodDC ohne Aktivitätsverluste kryokonserviert werden, so daß mit diesen Zellen erstmals

standardisierte dendritische Zellen für die analytische und therapeutische Anwendung zur

Verfügung stehen.

Key Words: immunologische Assays, T-Zellepitop-Screening, Allergenität, Immunogenität,

Array-Analyse, Cross-Priming von T-Zellen

Dendritische Zellen (DC) werden heute

als zentrale Akteure im Immunsystem

angesehen. Sie entscheiden darüber, welches

Antigen erkannt wird und wie die

Immunantwort aussieht 1 (Abb. 1). Die

Vorläufer der dendritischen Zellen zirku-

lieren im Blutkreislauf, bevor sie durch

Signale einer Entzündung in das Gewebe

einwandern und zu unreifen, dendritischen

Zellen (i-DC) differenzieren. Diese i-DC

fungieren als Antigen-aufnehmende und

-prozessierende Zellen, die alles aus ihrer

Abb. 1: Lebenszyklus von dendritischen Zellen (DC). T (rot) = T-Helferzellen; T(blau)=Zytotoxische

T-Zellen; B=B-Zellen.

Umgebung – von toten Zellen bis Makromolekülen

– aufnehmen und prozessieren.

Es werden sowohl pathogene Erreger als

auch körpereigene Stoffe aufgenommen.

Zusätzliche Signale aus der Umgebung der

i-DC lösen die terminale Differenzierung zu

reifen dendritischen Zellen (m-DC) aus. Im

Zuge dieser Reifung erlangen die Zellen die

Fähigkeit, in die Lymphknoten zu wandern,

wo sie auf die Immun-Effektorzellen treffen.

Die Hauptaufgabe der m-DC ist es, durch

Präsentation der prozessierten Antigene

auf der Zelloberfläche die Effektorzellen

Antigen-spezifisch zu stimulieren oder die

Toleranz gegen körpereigene Antigene aufrechtzuerhalten.

Abhängig von den äußeren

Signalen, die zu der DC-Reifung geführt

haben, und der Qualität des prozessierten

Antigens erfolgt die Stimulation oder die

Suppression der Immunantwort, oder es

kommt zur Entwicklung einer allergischen

Reaktion 2,3 .

Aufgrund ihrer herausragenden Bedeutung

werden dendritische Zellen oder ihre

Vorläufer vielerorts zu Forschungszwecken

oder therapeutischen Ansätze aufwendig

aus humanen Blutkonserven isoliert und

– meist in vitro – differenziert 4 . Die Zellzahl

und Qualität der so erhaltenen Zellen

variieren abhängig vom jeweiligen Spender

sowie – beim einzelnen Spender – von dessen

Tagesform.

Die Anwendung dieser primären DC-Kulturen

reicht von der Grundlagenforschung

über in vitro-Tests zur Immunogenität oder

Allergenität unterschiedlichster Produkte

bis hin zur Entwicklung von, Antiinfektiva

oder Krebs-Immuntherapeutika.

Dendritische Zellen werden etwa benötigt,

um bei der Entwicklung von Impfstoffen

in vitro zu testen, ob die gewünschten T-

Zellen Antigen-spezifisch aktiviert werden

können. Nahrungsmittel- und Kosmetikzusätze

sowie Produkte der pharmazeutischen

Industrie müssen auf ihr Potential überprüft

werden, allergische Reaktionen auszulösen.

DC-basierte zelluläre Assays spielen dabei

eine wichtige Rolle. Bei der therapeutischen

Anwendung werden die DC in vitro mit dem

gewünschten Antigen beladen, um im Patienten

eine Immunreaktion gegen den Tumor

oder die Virus-infizierte Zelle zu induzieren.

Solche und andere Impfstoffe müssen in

klinischen Studien getestet werden, wobei

die immunologische Wirksamkeit durch

das „Immunomonitoring“ überprüft wird,

wozu auch DC notwendig sind.

Vor diesem Hintergrund gab es viele Versuche,

eine permanente Zellinie zu erzeugen,

die DC-Eigenschaften besitzt. Bislang gibt

es Zellinien, die aus der Maus gewonnen

werden konnten – allerdings mit Techniken,

die nicht für den menschlichen Organismus

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Abb. 2: Die humane Zellinie NemodDC hat die Eigenschaft von dendritischen Vorläuferzellen.

Durch Kultivierung der Zellinie (NemodDC oder prec-NMDC) in Anwesenheit von IL-4 und

GM-CSF differenzieren die Zellen zu unreifen, CD11c-positiven, CD83-negativen, dendritischen

Zellen (i-NMDC) und anschließend durch weitere Kultivierung mit TNF-α zu reifen, CD11c-

und CD83-positiven, dendritischen Zellen (m-NMDC). Der untere Teil der Abbildung stellt

das Ergebnis einer durchflußzytometrischen Analyse der drei Entwicklungsstadien

(prec-NMDC, i-NMDC und m-NMDC) nach Doppelfärbung mit anti CD11c- und anti CD83-Antikörpern

dar.

anwendbar sind 5 . Deshalb blieb die Herstellung

einer humanen dendritischen Zellinie

bisher erfolglos. Mit NemodDC wird diese

Lücke geschlossen. Die Zellinie besitzt die

Eigenschaften von Vorläuferzellen (prec-

NMDC), die sich in Anwesenheit von IL-4

und GM-CSF zu den unreifen dendritischen

Zellen (i-NMDC) und anschließend in Anwesenheit

von TNF-α-Konzentrationen zu

m-NMDC differenzieren lassen (Abb. 2).

Unter veränderten Differenzierungs- und

Reifungsbedingungen können zudem die

DC-Subtypen DC1 (IL-12-sekretierend),

DC2 (IL-10-sekretierend) und NMLC (Langerin-exprimierende

Langerhans-Zellen)

erzeugt werden. Langerhans-Zellen kommen

insbesondere in der Haut vor und sind

wesentlich schwieriger zu isolieren als DC

Abb. 3: Analyse von Zelloberflächenmarkern, die charakteristisch für die unterschiedlichen Differenzierungsstadien

von dendritischen Zellen sind. Die Zellen wurden durchflußzytometrisch analysiert,

wobei der prozentuale Anteil der für den jeweiligen CD-Marker positiven Zellen angegeben

ist. Es wurden die Zellinie (prec-NMDC, blau), die differenzierten, aber unreifen DC (i-NMDC,

grün) und die daraus gewonnenen reifen DC (m-NMDC, rot) analysiert. Die i-NMDC wurden nach

Differenzierung kryokonserviert und für die Analyse und die Reifung zu m-NMDC aufgetaut.

aus Blutkonserven. Mit der Herstellung von

NMLC aus NemodDC stehen deshalb erstmals

Langerhans-Zellen in größeren Mengen

zur Verfügung, was für die klinische

Anwendung und für Forschungszwecke

sehr nützlich erscheint. Die aus NemodDC

gewonnenen m-NMDC haben die für reife

dendritische Zellen typische Morphologie

(Abb. 4) und sind in allen Belangen voll

funktionsfähig.

Phänotypische Charakterisierung

von NemodDC

Die immunzytologischen Analysen von

Oberflächenmarkern, die typisch für dendritische

Zellen sind, ergaben, daß der

Phänotyp der i-NMDC und m-NMDC

dem Phänotyp von dendritischen Zellen

entspricht, die aus Blutkonserven gewonnen

wurden (Abb. 3). Die Vorläufer-Zellinie

(prec-NMDC), die ursprünglich von

einem AML-Patienten gewonnen wurde,

ist CD11c-, CD34- und CD14-positiv und

entspricht damit dem Phänotyp von myeloid-monozytären

Stammzellen. Durch

Differenzierung zu i-NMDC und Reifung

zu m-NMDC (oder m-NMLC) nimmt die

CD34- und CD14-Expression ab, und die

für dendritische Zellen charakteristischen

Proteine erscheinen auf der Zelloberfläche

(Abb. 3). So wird die Expression der

Antigen-präsentierenden Moleküle (z.B.

CD1a und CD1d), der co-stimulatorischen

Moleküle (z.B. CD40, CD80 und CD86) und

von Rezeptoren für die Erkennung von

Pathogenen (z.B. CD209) stimuliert. Der

für die vollständige DC-Reifung wichtige

Marker CD83 ist nicht auf der Zellinie,

kaum auf den i-NMDC, dagegen auf den

m-NMDC vorhanden (Abb. 3). Eine einzige

Abweichung stellt die Expression der

Antigen-präsentierenden MHC I- und II-

Komplexe dar, die während der gesamten

Zelldifferenzierung von der Zellinie bis zu

den m-NMDC in hohem Maße auf der Zelloberfläche

nachgewiesen werden können.

Die molekularbiologische HLA-Typisierung

hat ergeben, daß die Zellen A2, A3, B44,

B56, Cw4, Cw7 (MHCI) und DR10, DR11,

DR52, DQ5, DQ7, DPw3, DPw4 (MHC II)

positiv sind.

Die Expression der für die DC-Migration

wichtigen Chemokin-Rezeptor CCR5,

CCR6 CXCR4 und CCR7 wurde molekularbiologisch

nach der Differenzierung

oder nach der Reifung nachgewiesen. Für

die Pathogen-Erkennung und Reifung der

DC ist die Familie der Toll-like Rezeptoren

(TLR) wichtig 6 , deren Vorhandensein wir

in bezug auf 10 Rezeptoren (TLR1-10) mittels

RT-PCR analysiert haben. NemodDC

synthetisiert zumindest die mRNA für die

TLR1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 und 10. Die TLR1, 2 und

4 sind charakteristisch für die häufigsten

dendritischen Zellen vom myeloiden Typ,

12 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


wogegen die Expression von TLR9 typisch

für die wesentlich selteneren plasmocytoiden

DC ist 7 .

Charakterisierung der

DC-Aktivitäten

Entscheidend für die DC-Eigenschaft einer

Zelle ist die Fähigkeit native T-Zellen, die

noch keine Stimulation erfahren haben, Antigen-spezifisch

zu aktivieren. Dies wurde

in zahlreichen T-Zellassays erfolgreich für

die m-NMDC getestet. Das in Abbildung

5 gezeigte Beispiel einer ELISPOT-Analyse

verdeutlicht, daß m-NMDC in der Lage sind,

native CD8 + T-Zellen Antigen-spezifisch zu

stimulieren. In anderen ELISPOT-Analysen

und Proliferationsassays wurde deutlich,

daß neben nativen CD8 + -T-Zellen auch „memory“

CD8 + - und native sowie „memory“

CD4 + - T-Zellen und regulatorische NKT-

Zellen (‚natural killer‘-T-Zellen) aktiviert

werden können.

Für die Anwendung von NemodDC als

DC-Quelle ist zudem die Fähigkeit entscheidend,

Antigene zu prozessieren und

diese anschließend T-Zellen zu präsentieren.

In zahlreichen ELISPOT-Analysen

und Zytotoxizitäts-Assays wurden Peptide

durch m-NMDC effizient präsentiert sowie

Proteine, Zellysate und DNA-Vakzine durch

die i-NMDC prozessiert, um anschließend

von den m-NMDC in Form von Peptiden

erfolgreich T-Zellen präsentiert zu werden.

In diesem Zusammenhang konnte auch

ein effizientes Cross-Priming beobachtet

werden. Auch die Fusion der m-NMDC mit

Tumorzellen ist ein vielversprechender Weg,

Antigene auf m-NMDC zu präsentieren.

Diese Ergebnisse machen deutlich, daß die

bekannten Möglichkeiten von dendritischen

Zellen, Antigene zu präsentieren und

T-Zellen (über MHC I-, MHC II- und CD1-

Komplexe) zu stimulieren, bei NemodDC

weitgehend zur Verfügung stehen. Am Rande

sei erwähnt, daß die stimulierten CD8 + -

T-Zellen in der Lage sind, ihre zytotoxische

Aktivität Antigen-spezifisch an Tumorzellen

zu entfalten, daß sehr erfolgreich T-Zellklone

erzeugt werden konnten, und – wichtig

für eine therapeutische Anwendung von

NemodDC– auch bestrahlte m-NMDC in

der Lage sind, auf CCR7-spezifische Chemokine

chemotaktisch durch Zellmigration

zu reagieren.

‚Ready-to-use‘ dendritische Zellen

und passende T-Zellen

Um NemodDC zur Verfügung stellen zu

können, haben wir die Möglichkeit getestet,

die differenzierten, unreifen i-NMDC und

die reifen m-NMDC ohne Verlust der dendritischen

Eigenschaften einzufrieren und

auf Trockeneis zu verschicken. Werden die

in einem DMSO-haltigen Einfriermedium

B L I T Z L I C H T

eingefrorenen i-NMDC und m-NMDC in

einem sehr schonenden Verfahren aufgetaut,

ist kaum eine Beeinträchtigung der Zellvitalität

zu beobachten (80% ± 10% vs. 85% ±

7% für i-NMDC und 50% ± 10% vs. 40% ±

10% für m-NMDC jeweils vor und nach dem

Einfrieren/Auftauen). Eine grundlegende

Veränderung des dendritischen Phänotyps

konnte nicht beobachtet werden (vgl. Abb. 3).

Schließlich wurde der kritischste Punkt überprüft:

sind die aufgetauten Zellen noch in der

Lage, Antigene zu präsentieren und T-Zellen

zu stimulieren? Zu diesem Zweck wurde eine

ELISPOT-Analyse mit Antigen-präsentierenden

m-NMDC durchgeführt, die entweder

aus kryokonservierten i-NMDC gewonnen

oder „frisch“ produziert wurden. Die Ergebnisse

dieser Analysen sind in Abbildung 5

Abb. 4: Morphologie reifer dendritischer Zellen

(m-NMDC), die aus der Zellinie NemodDC

durch Differenzierung und Reifung gewonnen

wurden. Zur Herstellung der m-NMDC siehe

Text und Abbildung 2.

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LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 13


dargestellt und zeigen, daß keine gravierenden

Einbußen in der T-Zellaktivierung

zu beobachten sind, wenn die i-NMDC

einmal eingefroren und aufgetaut wurden.

Vergleichbare ELISPOT-Analysen ergaben,

daß auch die m-NMDC kryokonserviert

werden können, ohne daß die Fähigkeit,

T-Zellen zu stimulieren, größere Einbußen

erfahren hätte. Die mögliche Dauer der

Lagerung der eingefrorenen Zellen hängt

von deren Art ab, wobei die Lagerung im

flüssigen Stickstoff am günstigsten ist und

mindestens ein Jahr ohne größere Veränderungen

der Zellen möglich ist.

Für einige Anwendungen der dendritischen

Zellen (siehe unten) werden neben

den DC auch T-Zellen benötigt. In vielen

Labors werden T-Zellen und DCs aus

demselben Spender gewonnen, um einen

identischen HLA-Typ von T-Zellen und DCs

zu garantieren. Für NemodDC wurde dieses

Problem gelöst, indem T-Zellen von zahlreichen

HLA-A2 + -Spendern in ELISPOT-Analysen

getestet getestet wurden. Aufgrund

dieser Analysen können nun T-Zellen

bereitsgestellt werden, die funktionell gut

zu NemodDC passen. Diese können auch

kryokonserviert als PBMC, isolierte CD8 + -

oder CD4 + -T-Zellen verschickt werden.

Fazit

NemodDC und die davon abgeleiteten dendritischen

Produkte DC-Tools sind geeignet,

humane DC aus Blutkonserven in DC-basierten

in vitro-Assays zu ersetzen. Bei Verwendung

der passenden T-Zellen kann bei

in vitro-T-Zellassays ganz auf Blutkonserven

B L I T Z L I C H T

verzichtet werden. Die konstante Qualität

und nahezu unbegrenzte Zellzahl der aus

NemodDC gewonnenen i-NMDC und

m-NMDC ermöglichen erstmals die notwendige

Standardisierung dieser Assays.

Dazu gehören etwa die in vitro-Analysen

zur Wirksamkeit von Impfstoffen und des

Allergie-Potentials von Nahrungsmitteln

und Kosmetikzusätzen sowie von pharmazeutischen

Produkten (Abb. 6).

Methoden, die bisher nicht möglich

oder nur unter großen Schwierigkeiten

durchführbar waren, weil humane DC nur

in sehr variabler Qualität und Zellzahl zur

Verfügung standen, können jetzt etabliert

werden. Dazu gehören die Entwicklung

Abb. 6: In vitro-Assays unter Verwendung von dendritischen Zellen (DC). NemodDC erlaubt die

Standardisierung dieser Assays, da Qualitätsschwankungen entfallen, die bei aus Blutkonserven

isolierten DCs zu beobachten sind.

Abb. 5: Ergebnis eines repräsentativen T-

Zellassays (ELISPOT-Analyse). Die m-NMDC

wurden durch Differenzierung und Reifung

(s. Abb. 2) aus der Zellinie NemodDC gewonnen,

mit einem bekannten HLA-A2-Peptid

aus dem MART-1 Protein beladen und zur

ersten Stimulation (Prime) von isolierten

HLA-A2 + -, CD8 + -T-Zellen verwendet. Die

T-Zellantwort wurde durch Bestimmung der

Zahl der aktivierten (IFN-γ-sekretierenden)

CD8 + -T-Zellen quantifiziert. Der Antigen (MART-

1)-spezifische Anteil dieser T-Zellantwort wird

dadurch deutlich, daß die auf das MART-1

Peptid ‚geprimten‘ T-Zellen (i) mit MART-1

Peptid-präsentierenden Zellen restimuliert

wurden, (ii) mit Zellen, die ein irrelavantes

HLA-A2 + - Peptid (aus dem HIVgag-Protein) oder

(iii) kein Peptid präsentierten. Schließlich wird

die Qualität von m-NMDC, die aus aufgetauten

i-NMDC (grün) bzw. „frischen“ i-NMDC (blau)

gewonnen wurden, miteinander verglichen.

von Screening-Techniken (Abb. 6), um

immunmodulierende Eigenschaften einer

Substanzgruppe zu identifizieren oder zu

optimieren, und die Möglichkeit der Identifizierung

neuer T-Zellepitope beispielsweise

von Tumormarkern oder die Optimierung

solcher Epitope.

Eine ganz neue Perspektive bietet die

Möglichkeit auch Langerhans-Zellen im

Labor in ausreichender Menge und standardisierter

Qualität zur Verfügung herstellen

zu können. Eine klinische Anwendung von

NemodDC erscheint sehr vielversprechend,

zumal die Zellinie Virus-frei ist und inzwischen

Serum-frei kultiviert wird.

Literatur

[1] J. Banchereau et al., Immunbiology of dendritic cells, Annu. Rev. Immunol.

18, 767-811 (2000)

[2] M. Lutz und G. Schuller, Immature, semimature and fully mature dendritic

cells: which signals induce tolerance or immunity?, Trends Immunol. 23,

445-449 (2002)

[3] S.C. Eisenbarth et al., The master regulators of allergic inflammation:

dendritic cells in Th2 sensitization, Curr. Opin. Immunol. 15, 620-626

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[4] G. Schuler und N. Romani, Generation of mature dendritic cells from

human blood. An improved method with special regard to clinical applicability,

Adv. Exp. Med. Biol. 417, 7-13 (1997)

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ability established from transgenic mice harboring the temperaturesensitive

SV40 large T-antigen gene, J. Biochem. (Tokyo) 136, 321-328

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patterns by TLR family, Immunol. Letters 85, 85-95 (2003)

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mRNA in cellular subsets of human peripheral blood mononuclear cells

and sensitivity to CpG oligodeoxynucleotides, J. Immunol. 168, 4531-4537

(2002)

Korrespondenzadresse

Dr. Hans Baumeister

GLYCOTOPE GmbH

Robert-Rössle-Str. 10, D-13125 Berlin

Tel.: +49-30-941084-207

Fax: +49-30-941084-188

eMail: hans.baumeister@glycotope.com

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14 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


Drug Discovery


B L I T Z L I C H T

Microfluidic Cell Based Assays

Jude Dunne, Vy Trinh, Esther Huang, Holly Reardon, Irina Kazakova and Javier Farinas

Caliper Life Sciences, Mountain View, USA

Zellbasierte Assays finden in der Wirkstoffsuche eine immer breiter werdende Anwendung.

Einerseits sind sie oft aussagekräftiger als Assays, die lediglich mit isolierten Enzymen

arbeiten. Andererseits sind einige Targets in isolierter Form nicht zu bearbeiten. Im Bereich

der zellbasierten Assays stellen die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) besonders

attraktive Targets dar, da sie im Bereich der ZNS-Erkrankungen und Schmerztherapie eine

wichtige Funktion einnehmen. Der bevorzugte Assay für GPCRs ist die Messung des Kalzium-

Transportes (Ca-Flux) durch GPCR-Aktivierung. Bisherige Methoden, die den Ca-Flux messen,

führen zu einem hohen Substrat- und Zellverbrauch, sind schwierig zu automatisieren und

liefern Daten von relativ niedriger Qualität.

Dieser Artikel beschreibt einen Ca-Flux-Assay,

der auf Basis der innovativen Mikrofluidik-

Technologie entwickelt wurde und frei von

allen Nachteilen der bisherigen Ca-Flux-Technologien

ist. Der auf dem Caliper LabChip

3000 etablierte Assay verwendet verschiedene

Zellinien, die direkt auf den mikrofluidischen

Chip gegeben werden. Die Reaktion selbst

läuft dann auf dem Chip ab, wobei nur

geringste Mengen an Zellen, Substrat und








Testsubstanzen verbraucht werden. Darüber

hinaus werden Daten in höchster Qualität

und Aussagekraft generiert. Für diese Art der

Bearbeitung werden lediglich der Chip, die

LabChip 3000-Hardware, -Software sowie die

Auswerte-Software benötigt.

Die LabChip ® -Technologie entnimmt die

Testsubstanzen aus einer Mikroplatte und

mischt diese in Mikrokanälen des Chips mit

den kontinuierlich fließenden Zellen und Rea-

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Neurodegenerative Diseases

Abb. 1: Der LabChip 3000 ® für mikrofluidische

Calcium Flux-Assays

genzien. Die Aufnahme der Substanzen erfolgt

über kleine Kapillaren, sogenannte „Sipper“,

die sich an der Unterseite des Chips befinden

und die in die Kavitäten der 384er- Mikroplatte

hineintauchen. Die Dimension der Kanäle sind

in Quarzglas geätzt und betragen ca. 35µm x

10µm. Die Bewegung der Flüssigkeiten in dem

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LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 15


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Abb. 2: rechts: Antagonisten-Chip. links: Kavitäten des Chips

Kanalsystem des Chips erfolgt durch geringfügigen

Unterdruck. Ähnlich wie in einem

Durchfluß-Zytometer wird die Fluoreszenz

individueller Zellen gemessen, die an dem

Detektor vorbeifließen. Das LabChip-System

3000 ® benötigt für eine Messung 30 bis 100

Zellen und verwendet dabei nur 50nl Substanz

und 15nl des Agonisten.

Eine Reihe von verschiedenen Zellinien,

wie HEK, CHO, Jurkat und THP-1, wurden

in dem Caliper LabChip-System 3000 ® eingesetzt.

CHO-m1 and HEK wurden als Modell

verwendet, um den Assay auf dem System

zu validieren.

Zell-Präparation

CHO-m1-Zellen von ATCC (CRL-1985)

wurden als Monolayer bei einer Konfluenz

< 80% kultiviert. Das Wachstumsmedium

enthielt Ham’s 12 Medium mit 1,5 g/L Natriumbicarbonat

mit 100 U/ml Penicillin und

0,1 mg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamat,

0,1 mg/ml Geneticin G418, 1mM Natrium-

Pyruvat, 10mM HEPES und 10% Fetal Bovine

Serum. HEK293-Zellen von ATCC (CRL-1573)

wurden als Monolayer bei einer Konfluenz

< 80% kultiviert. Das Waschstumsmedium

enthielt DMEM-Medium mit 0,1 mM NEAA,

1mM Natrium-Pyruvat, 100 U/ml Penicillin

und 0,1 mg/ml Streptomycin, 2mM L-

Glutamin und 10% Fetal Bovine Serum.Das

Beladen der Zellen mit Farbstoff erfolgte

B L I T Z L I C H T

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bei 6 x 10 6 Zellen mit 6 ml physiologischem

Puffer mit 1 µM Fluo4 und 1 µM Fura Red

mit Probenicid zur Verhinderung von Ca 2+ -

Indikator-Export.

Geräte

Das LabChip-System 3000 ® setzt sich zusammen

aus einem Quarzglas-Chip mit Mikrokanälen,

die mit feinen Sipper verbunden sind,

und dem LabChip 3000 ® -Gerät (Abb. 1). Das

LabChip 3000 ® besteht aus einem Roboter,

einem Plattenstacker, einem Fluoreszenz-Reader,

einer Vakuumpumpe und einem Computer

mit System- und Auswertungs-Software.

Fluoreszenz wird durch einen Laser mit einer

Wellenlänge von 488nm angeregt und über ein

Objektiv bei Aufspaltung in 525nm und 685nm

von CCD-Arrays detektiert. Die Messungen

werden mit bis zu 200 Hz aufgezeichnet.

Der XYZ-Roboter entnimmt die Mikroplatten

dem Stacker und positioniert sie so, daß die

Sipper des Chips in alle Kavitäten einer 96er-

und 384er-Platte reichen. Die Mikroplatten

befinden sich dabei in einer Einhausung mit

regulierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit,

um Evaporationseffekte zu vermeiden.

Chip-Design

Zwei Multidetektions-Zonen-Chips wurden

für den Antagonisten- und Agonisten-Assay

entwickelt. Für jeden Zelltyp kann ein Quarz-

Abb. 3: Emissionsrate bei 530 und 685 nm gegen die Inkubationszeit bei CHO-m1- (rechts) und

HEK293-Zellen (links), mit verschiedenen Carbachol-Konzentrationen induziert.

Chip mit und ohne Polymerbeschichtung zur

Vermeidung von Zelladhäsion verwendet

werden. Testsubstanzen werden durch die

Sipper aufgenommen und in dem Chip mit

den kontinuierlich aus den Zell-Kavitäten

fließenden Zellen gemischt. Im Agonisten-

Chip werden die Zellen mit der Testsubstanz

am Sipper-Ende gemischt und fließen anschließend

durch den Reaktionsbereich zur

Detektionszone. Der Chip sieht aus, wie der

Antagonisten-Chip, lediglich die Wells mit

Agonist sind nicht aktiv. Im Antagonisten-

Chip werden die Zellen ebenfalls mit der

Testsubstanz gemischt, aber nach kurzer Inkubation

wird zusätzlich der Agonist aus der

Agonisten-Kavität zugemischt. Anschließend

wird nach kurzer Inkubation in der Detektionszone

die Fluoreszenz detektiert (Abb. 2).

In beiden Chips wird die Mischung in einem

schlaufenförmigen Verlauf dreimal am Laser

vorbeigeführt, um so drei Detektionspunkte

zu ermöglichen. Dadurch läßt sich anhand

von starken, mittelstarken und schwachen

Referenz-Agonisten der optimale Detektionspunkt

ermitteln. Im eigentlichen Screening

ist eine Beschränkung auf einen Meßpunkt

dann völlig ausreichend. Des weiteren sind

durch Änderung des Druckes unterschiedliche

Fließgeschwindigkeiten möglich, und

damit kann die Zeit der Zellantwort auf

den Agonisten oder potentiellen Agonisten

zwischen 10 und 100 Sekunden eingestellt

werden. Diese Variationen erlauben es, den

Assay sehr genau auf spezifische Zellinien

einzustellen.

Ergebnisse und Diskussion

Der Zeitpunkt der Messung der Kalzium-Antwort

der Zellen nach Zugabe eines Agonisten

kann – abhängig vom eingestellten Vakuum

(Geschwindigkeit der Zellen im Mikrokanal)

und dem Detektionspunkt (Laufstrecke) – variiert

und optimiert werden. Für diesen Assay

wurde der Detektionspunkt für die CHO-1m-

Zellen bei 15 Sekunden (s) und bei HEK293-

Zellen bei 30 s festgelegt (Abb. 3). Dieser Punkt

gewährleistet die Detektion der maximalen

Zellantwort eines schwachen Agonisten und

gleichzeitig ein noch immer intensives Signal

eines starken Agonisten. Die Zellantwort des

endogenen Rezeptors in den HEK293-Zellen

ist schwach, aber klar zu detektieren.

Datenqualität

Datenqualität kann definiert werden als

Assay-Signal gegen Hintergrund-Signal

und anhand der falsch-positiven und

falsch-negativen Hitraten. Im Caliper-Assay

ist der Hintergrund im wesentlichen

abhängig von der Anzahl der Zellen, die

pro Messung analysiert werden, während

Kennziffer 18 LW 01 · www.biocom.de �

16 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


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Abb. 4: Berechnung des Z‘-Wertes als Funktion

der durchschnittlich analysierten Zellzahl

pro Messung beim CHO-m1-Agonisten-Assay.

Assay-Parameter waren, Zelldichte = 5.5 x

10 6 Zellen/ml, Zone 1 Druck = -2 psi und 12s

Proben-Ansaugzeit. Die gepunktete Linie repräsentiert

eine nichtlineare Regression der

Daten der Gleichung Z’ = 1- A/ N1/2 mit N als

Zellzahl pro Messung und A als Konstante.

das Signal durch die potentielle Zellantwort

der Zellen auf einen Agonisten bestimmt

wird. Die größte Varianz zwischen den verschiedenen

Meßpunkten resultiert aus der

Variabilität der Reaktion einzelner Zellen.

Diese Variabilität kann aus biologischen

Unterschieden innerhalb einer Zellpopulation

resultieren und/oder aufgrund von

unterschiedlicher Beladung der Zellen mit

Farbstoff. Unabhängig von der Ursache kann

diese Variabilität durch Mitteln des Signals

möglichst vieler Zellen pro Meßpunkt ausgeglichen

werden. Abbildung 4 zeigt, daß

die Variabilität der Ergebnisse, gemessen am

Z’-Faktor, bei 1- 1/(Anzahl der analysierten

Zellen) ½ fällt. Die Datenqualität ändert sich

dabei nur noch geringfügig, wenn mehr als

200 Zellen pro Analyse eingesetzt werden,

fällt aber stark ab, wenn die Zellzahl auf

weniger als 30 sinkt. Während der tatsächliche

Z’-Faktor bei verschiedenen Zellinien

schwanken kann, bleibt die Abhängigkeit

von der Zellzahl grundsätzlich gleich. Es

muß aber in Betracht gezogen werden, daß

die Zellzahl pro Meßpunkt über die Zeit

A B

B L I T Z L I C H T

leicht abnimmt. Aus diesem Grund sind

die Assays so zugeschnitten, daß am Ende

eines ununterbrochenen Laufs die Zellzahl

pro Analyse immer noch ausreichend ist, um

eine hohe Datenqualität zu gewährleisten.

Aufgrund der Berechnung (Abb. 4) ist es

ratsam, die Zellzahl oberhalb von 50 Zellen

pro Meßpunkt zu halten. Es ließ sich feststellen,

daß die Zellzahl in den beschriebenen

Läufen bei den HEK293-Zellen über fünf

Stunden von etwa 140 auf 90 und bei den

CHO-m1-Zellen von rund 160 auf 140 Zellen

pro Meßpunkt abfiel. Daher lag der Z’-Wert

bei den Experimenten über 0,7, oder 0,6 bei

HEK293. Die Daten für die CHO-m1-Zellinie

zeigten im Vergleich bei unterschiedlichen

Substanz-Ansaugzeiten höhere Z’-Werte,

wenn die Ansaugzeiten und damit auch die

Zellzahl höher war.

Durchsatz/Verwendung von Zellen

Die Optimierung des Durchsatzes wird bestimmt

durch das Sammeln der Daten einer

genügend großen Zahl an Zellen für jede

Substanz auf der getesteten 384er-Mikroplatte

und die genügend lange Puffer-Ansaugzeit,

die notwendig ist, um die Überlagerungen

und Schmiereffekte von Messung

zu Messung zu minimieren und andererseits

zu verhindern, daß es im Chip zu einem

Ausgasen der Flüssigkeiten kommt. Proben-

Ansaugzeiten von 5 s und 12 s haben sich für

eine gute Statistik bei CHO- and HEK-Zellen

mit Puffer-Ansaugzeiten von 3 s und 5 s als

ausreichend erwiesen und resultierten in

guten Z’-Ergebnissen.

Dieser Durchsatz wird wiederum die

notwendige Zellmenge pro Meßpunkt

beeinflussen (inklusive alle Zellen, die

auf den Chip geladen, aber als Totvolumen

nicht genutzt werden). Es ist also

notwendig unter Berücksichtigung der

Ansaugzeiten, der gewünschten Zellen

pro Meßpunkt und dem maximalen Well-

Volumen die notwendige Zelldichte in der

Zellsuspension auf den Chip zu laden. Für

Abb, 5: A. Carbachol EC50 für HEK293 als Funktion der Assay-Laufzeit von HEK293 bei 1,2, 2,5

und 3,7 Stunden mit 27 ± 4, 18 ± 4, 13 ± 2 µM, und (n= 4). Assay-Bedingungen waren: Zelldichte

= 1 x 10 6 Zellen/ml, Zone 2 Druck = -2 psi und 12s Proben-Ansaugzeit. 5B: Carbachol EC50 für

CHO-m1 als Funktion der Assay-Laufzeit. Jeder Punkt repräsentiert den Durchschnittswert aller

gewonnenen Daten aus drei unterschiedlichen Läufen. Assay-Bedingungen waren: Zelldichte =

5,5 x 10 6 Zellen/ml, Zone 1 Druck = -2 psi und 12s Proben-Ansaugzeit. = 5,5 x 10 6 Zellen/ml.

einen 8-Stunden-Lauf sollten in der Regel

ca. 2ml Zellsuspension ausreichend sein.

Assay-Stabilität

Die Stabilität eines Assays wird anhand der

EC50 als Funktion gegen die Zeit bestimmt.

Als Daten werden die Reaktionen gegenüber

Agonisten und Antagonisten bei der jeweiligen

Zellinie verwendet. Abbildung 5a zeigt

die EC50-Werte bei HEK293-Zellen mit dem

Agonisten Carbachol über eine typische

Laufzeit. Abbildung 5b zeigt die Veränderung

der EC50-Werte bei CHO-m1-Zellen über

mehrere Stunden und mehrere verschiedenen

Zellchargen.

Zusammenfassung

Auf dem Caliper-Microfluidik-System Lab-

Chip 3000 ® wurde ein Calcium-Flux-Assay

entwickelt, der in der Wirkstoffsuche und

für das Screening eingesetzt werden kann.

Für die Validierung wurden adhärente

HEK293- und CHO-m1-Zellinien verwendet.

Es sind aber auch andere Zellinien und sogar

Primärzellen einsetzbar.

Die Ergebnisse zeigten eine hohe Datenqualität

bei sehr guter Reproduzierbarkeit.

Die Zahl an falsch-positiven Hits ist sehr

gering, ein Punkt der im Vergleich zu anderen

Ca-Flux-Technologien besonders hervorzuheben

ist. Dadurch entfällt die aufwendige

Selektion der wirklichen Hits im Anschluß

an ein Screening. Besonders die Bereitstellung

von Zellsuspension verlangt einer

Screeningabteilung heutzutage ein hohes

Maß an Organisation sowie technischem,

personellem und finanziellem Aufwand ab.

Dieser Bereich der Assaylogistik ist bei einem

Verbrauch von wenigen ml-Zellsuspension

nicht länger notwendig.

Es ist abschließend festzustellen, daß die

Verwendung des LabChip 3000 ® und der

dazugehörenden LabChips ® zu einem sehr

geringen Verbrauch an Reagenzien und

Zellsuspension führen und damit ein hohes

Einsparpotential beim Screening größerer Substanzbibliotheken

oder der Evaluierung von

Hits im Sekundär-Screening ermöglichen.

Literatur

[1] Birkos, J. S. et. al.; Comparison of FLIPR and Caliper Cell-based Assay

Formats by Evaluating Agonists of Muscarinic Receptor-1 Identified in

HTS; Society of Biomolecular Screening Poster-Session, Orlando, USA

2004

[2] Rarinas et.al.; A Calcium Flux Assay for Drug Screening In The Lab Chip

System; Poster, SBS, Den Haag 2001

Korrespondenzadresse

Caliper Life Sciences GmbH

Eisenstr. 9 c, D-65428 Rüsselsheim

Tel.: +49-6142 -83493-11

Fax: +49-6142-162821

eMail: claudia.dymaszewski@caliperls.com

18 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


Imaging


B L I T Z L I C H T

Zelluläres Imaging in der

Medikamentenentwicklung

John Anson, GE Healthcare, Cardiff, UK

Angesichts technologischer Fortschritte, mit denen die Bildqualität, Durchsatzraten sowie die

Datenanalyse optimiert werden konnten, wird das Verfahren des zellulären Imaging in die

frühesten Forschungsphasen der Identifizierung neuer Wirkstoffmoleküle (‚Drug discovery‘)

verlagert. Motor für diese Fortschritte ist der Versuch der pharmazeutischen Industrie, Target-Verbindungen

mit klinischem Nutzen möglichst frühzeitig im Drug Discovery-Prozeß zu

identifizieren. In dieser Hinsicht besitzt das zelluläre Imaging eine Reihe von Vorzügen. An

lebenden Zellen können die Wirkungen von Substanzen mit arzneimittelartigen Eigenschaften

untersucht und potentielle Probleme bezüglich Toxizität und Verstoffwechselung identifiziert

werden. Hinzu kommt, daß ein weiterreichendes Verständnis des Targeting und der Funktion

pharmazeutischer Wirkstoffkandidaten gewonnen werden kann. Im Gegensatz zu früher können

Forscher mit Hilfe des Zell-Imaging zu einem wesentlich früheren Stadium im Prozeß der

Wirkstoffentwicklung Substanzen identifizieren, die unerwünschte Wirkungen zeigen.

Key Words: Drug Discovery, zelluläres Imaging, High Content Screening, HCS

Subzelluläre fluoreszenzmikroskopische

Imaging-Systeme nutzen Licht-emittierende,

fluoreszierende Sonden für die

Untersuchung zellulärer Prozesse und

erfassen darüber hinaus Veränderungen in

der Zellmorphologie und der Struktur der

Zellorganellen. Mit der Einführung subzellulärer

Imaging-Technologien mit mittlerem

und hohem Durchsatz (‚Medium‘ und ‚High

Throughput‘) können ‚High Content‘-Analysen

jetzt in einem Umfang und mit einer

Geschwindigkeit durchgeführt werden, die

für pharmazeutische Entwicklungsarbeiten

angemessen sind. Neue, durch hohen Durchsatz

und High Content gekennzeichnete

Geräte für die subzelluläre Bildverarbeitung,

wie beispielsweise der IN Cell Analyzer

TM 3000 von GE Healthcare (ehemals

Amersham Biosciences), können pro Tag

Screeningraten in einer Größenordnung von

bis zu 35.000 Wells bei einer Belegungszahl

von 300 bis 400 Zellen pro Well erreichen.

Online-Datenausgabe und Probenkammern

mit Kontrolle der Umgebungsbedingungen

gestatten den Einsatz von Assays an lebenden

Zellen ebenso wie die Echtzeitanalyse

zellulärer Ereignisse.

Mit fortschrittlichen Imagingverfahren

lassen sich sogar die Reaktionen einzelner

Zellen auf die Behandlung mit einem potentiellen

therapeutischen Wirkstoff verfolgen.

Dies gestattet den Einsatz heterogener

Zellpopulationen ohne jenes Quenching des

Signals, das im Fall der Bestimmung des

Durchschnittswertes mehrerer Zellreaktionen

auftreten würde. Außerdem können

mit der Zellanalyse die verschiedenartigen

biologischen Effekte in einem definierten

Zellzyklus bestimmt werden. Einige Imaging-

Systeme wie der IN Cell 3000 ermöglichen

die zeitgleiche Untersuchung verschiedener

Wirkstoffkandidaten an unterschiedlichen

Zelloberflächenrezeptoren (Multiplexing).

Hierfür werden drei gesonderte Kameras

eingesetzt, mit denen die roten, blauen und

grünen Emissionen von häufig eingesetzten

Fluoreszenzsonden simultan erfaßt werden.

Diese Multiplexing-Einrichtung leistet einen

unschätzbaren Beitrag, weil sie gleichzeitige

Auswertungen der unterschiedlichen, mit einem

Reporter versehenen Sonden gestattet.

Zelluläre Imaging-Systeme repräsentieren

eine Kombination vieler unterschiedlicher

Technologien. Damit maximaler Durchsatz

mit maximaler Aussagekraft erreicht wird,

ist eine Optimierung des Systems erforderlich

– von der Assay-Entwicklung bis hin zur

Speicherung von Daten. Diese Umsetzung

der Integration von Biologie, Hardware,

Software und Informatik wurde dadurch

enorm erleichtert, daß sich Anbieter von

„Komplettlösungen“ etabliert haben, die

ganzheitlich konzipierte biologische und

Instrumentierungssysteme bereitstellen.

Bereits heute ist die Palette der Anwendungen

für die subzelluläre Imaging-

Technologie ungemein vielseitig. So kann

beispielsweise das subzelluläre Fluoreszenz-

Imaging Informationen über die Rezeptor-

Internalisierung auf der Zelloberfläche,

über die Proteintranslokation innerhalb der

zellulären Matrix und die Genexpression im

Nukleus bereitstellen. Mit der Entwicklung

zusätzlicher Assays und Analyse-Pakete

wird diese Vielseitigkeit wahrscheinlich

noch weiter erhöht.

Rezeptorinternalisierung

Ein wesentlicher Bestandteil der Arzneimittelentwicklung

ist das bei hohem Durchsatz

ablaufende Screening nach potentiellen Wirkstoff-Zielstrukturen.

Eine Schlüsselstellung

nimmt dabei die Untersuchung der Rezeptoraktivierung

ein. Insbesondere werden dabei

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs)

untersucht. GPCRs machen ungefähr ein

Drittel aller Targets beim High Throughput

Screening (HTS) aus. In Kombination mit

neuartigen Färbe-Technologien hilft das

High Content Screening (HCS) der pharmazeutischen

Forschung, in diesem wichtigen

Bereich neue Erkenntnisse zu gewinnen.

In der Regel resultiert die agonistische

Aktivierung von Zelloberflächenrezeptoren

in der Internalisierung des Rezeptors von der

Abb. 1: Mit CypHer-markiertem Antikörper inkubierte HEK 293-Zellen exprimieren den mit

VSV-G Epitop-Tag versehenen β2-adrenergen Rezeptor. Anfärbung der Nuklei erfolgte mit

Hoechst-Dye (blau), und für das Imaging wurde der IN Cell Analyzer 3000 eingesetzt. Die Abbildung

links zeigt unbehandelte Zellen, die Zellen auf der rechten Seite wurden mit Isoproterenol,

100 nM, stimuliert. Der CypHer-markierte Antikörper erscheint rot, was die Rezeptor-Internalisierung

anzeigt.

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 21


B L I T Z L I C H T

Abb. 2: Als Serin/Threonin-Kinase vermittelt AKT1 eine Reihe intrazellulärer Wege, einschließlich

des Überlebens der Zelle und der Insulin-Signaltransduktion. Mit Hilfe von GFP kann die

AKT1-Bewegung und -Lokation direkt beobachtet werden. In den nicht stimulierten Zellen (links)

ist der überwiegende Teil von AKT1 im zytoplasmatischen Raum angeordnet. Nach der Stimulation

kommt es zur Neuverteilung von AKT1 hin zur Plasmamembran.

Plasmamembran in den endosomalen Weg in

der Zelle. Mit CypHer5E (GE Healthcare)

und dem IN Cell Analyzer 3000 erhält die

Forschung effiziente Werkzeuge für das

durchsatzintensive Screening der durch Agonisten

induzierten Rezeptorinternalisierung.

Als empfindlicher Farbstoff ist CypHer5E bei

basischem pH-Wert nicht fluoreszierend und

zeigt bei saurem pH maximale Fluoreszenz.

Die Verwendung von CypHer5E als Reporter-Farbstoff

ermöglicht das Monitoring von

Zelloberflächen-Rezeptoren bei der Internalisierung

in saure endosomale Vesikel im

Anschluß an die Stimulation durch Agonisten

(Abb. 1).

Proteintranslokation

Intrazelluläre Prozesse werden durch Proteine

gesteuert und können Aufschlüsse über

zelluläre Stoffwechselwege geben, die für

das Drug Discovery von Interesse sind. Das

Verständnis der dynamischen intrazellulären

Verteilung eines Proteins kann erste Hinweise

auf seine Funktion geben. „Biosensor-Proteine“

können dahingehend verändert werden,

daß sie ihren Aktivitätsstatus anhand

der Translokation zu diskreten zellulären

Kompartimenten hin durch Fluoreszenz

anzeigen. An lebenden Zellen durchgeführte

Translokationsassays unter Verwendung von

„Biosensor-Proteinen“, die ihrerseits auf dem

grün fluoreszierenden Protein GFP (Green

Fluorescent Protein) basieren, werden in der

Arzneimittelforschung für die Entwicklung

pharmazeutischer Screenings immer attraktiver.

Diese Assays können dazu eingesetzt

werden, Proteinbewegungen innerhalb der

intrazellulären Stoffwechselwege nachzuverfolgen

und sämtliche Wirkungen zu erfassen,

die durch potentielle Wirkstoffkandidaten

hervorgerufen werden. (Abb. 2)

Die Bewegung eines Target-Proteins kann

in vivo schnell erfolgen und lediglich vorübergehend

sein, so daß diese sich in einem

traditionellen, an fixierten Zellen durchgeführten

Assay nur mit Schwierigkeiten oder

überhaupt nicht nachweisen läßt. Mit Hilfe

von bei hohen Geschwindigkeiten und mit

lebenden Zellen arbeitenden Fluoreszenz-

Geräten, wie dem IN Cell Analyzer, können

bislang nicht nachweisbare Targets gemessen

werden, indem nach der Behandlung mit

den zu untersuchenden Verbindungen die

in Echtzeit erhobene Neuverteilung der mit

einem GFP-Tag versehenen Proteine quantifiziert

wird.

Auf spezifische Target-Regionen der Zelle

ausgerichtete GFP-Fusionsproteine können

außerdem als dynamische Marker der gene-

rellen Zellform oder Organellenmorphologie

genutzt werden. Mittels der Bildanalyse

lassen sich durch Agonisten induzierte Veränderungen

der Morphologie quantifizieren.

GFP-Reporter können Formveränderungen

sichtbar machen, die ihrerseits wichtige Zellprozesse

anzeigen – etwa den als Apoptose

bezeichneten programmierten Zelltod, die

Proliferation, Adhäsion und das Wachstum

von Neuriten.

Signaltransduktion und Genexpression

Für das Monitoring der mit der Signaltransduktion

und der Genexpression zusammenhängenden

zellulären Ereignisse wird in

erheblichem Umfang die Reportergen-Technologie

eingesetzt. Als Reportergene werden

Gene bezeichnet, die einen relativ leicht

meßbaren Phänotyp besitzen, der sich ohne

Probleme vor einem Hintergrund endogener

Proteine ermitteln läßt. Ein Reportergen-

Konstrukt besteht aus einem induzierbaren

Transkriptionskontrollelement, das die

Expression eines Reportergens vorantreibt.

Viele Reportergen-Systeme erfordern für

die Messung der Genexpression die Zerstörung

der Zelle oder besitzen nur begrenzte

Sensitivität. Unterdessen werden aber neue

Systeme mit lebenden Zellen entwickelt. So

besteht etwa das vor kurzem eingeführte Nitroreduktase

(NTR)-Genreporter-System von

GE Healthcare aus einem Enzym-Gen-Konstrukt

sowie einem zellmembrangängigen

Farbstoff (CytoCy5S) als Enzymsubstrat. Die

Genaktivierung führt zur Enzymaktivierung

Abb. 3: Schematische Darstellung des NTR-Genreporter-Assays. Die Aktivierung eines

intrazellulären Signalwegs führt letztendlich zur Genexpression des Reportergens.

22 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


und zur Reduktion des Substrats, wodurch

dieses eine rotverschobene Fluoreszenz

zeigt (Abb. 3). Das fluoreszierende Endprodukt

wird in der Zelle zurückgehalten, so

daß ein einfacher Signalanstieg-Assay der

Genexpression ermöglicht wird. Der Assay

nutzt rotverschobene Anregungs- und Emissionswellenlängen

für das Reporterenzym-

Substrat, um auf diese Weise die Nutzung

zusammen mit weiteren fluoreszierenden

Reportern (z. B. EGFP) in der gleichen Zelle

zu ermöglichen.

Die Analyse der NTR-Genreporter-Assays

auf dem IN Cell Analyzer 1000 und

dem IN Cell Analyzer 3000 ermöglicht

die Visualisierung der Genexpression in

einzelnen lebenden Zellen. Folglich besitzt

dieser Assay mit lebenden Zellen bei Genreporter-Assays

viele potentielle Vorteile.

NTR bietet nicht nur ein nicht-destruktives

Verfahren, sondern zudem die Möglichkeit,

beim Screening nicht ansprechende Zellen

auszusondern, Reaktionen individueller

Zellen zu analysieren und ein innerhalb

der gleichen Zellen auftretendes zweites

Fluoreszenzereignis zu messen.

Zelluläres Imaging im Hochdurchsatz

Extrem hohe Durchsatzraten bei zellulären

bildgebenden Verfahren lassen sich in Fällen

realisieren, in denen eine Auflösung auf

subzellulärem Niveau nicht erforderlich ist.

So kann beispielsweise mit LEADseeker TM

(GE Healthcare) pro Tag das Screening von

mehr als 1,4 Millionen Verbindungen abgearbeitet

werden, wofür lumineszierende,

fluoreszierende und radiometrische Proximity-Assays

eingesetzt werden. Daß sich

diese enormen Durchsatz-Raten realisieren

ließen, basiert auf Entwicklungsfortschritten

beim formatfreien Imaging, bei der Datenerfassung

und der Datenauswahl.

Wertschöpfung – in allen Stadien der

Medikamentenentwicklung

Das zelluläre Imaging gestattet die Durchführung

von High Content-Assays innerhalb

kürzester Zeit und in einem Umfang, was

seinen Einsatz während des gesamten Drug

Discovery-Prozesses ermöglicht.

Mit dem Einzug der Genomik in Drug

Discovery-Programme hat die Identifizierung

potentieller Arzneimittel-Targets einen

als „explosiv“ zu bezeichnenden Verlauf

genommen. Allerdings stellen die Auswahl

und Validierung von Targets immer noch

eine erhebliche Herausforderung dar. Selbst

bei Systemen mit mittleren Durchsatzraten

ist das subzelluläre Imaging häufig ein zusätzliches

Werkzeug, das etablierte Verfahren

ergänzt. Beispielsweise werden die Kenntnisse

über den Effekt des gezielten Ausschalten

eines spezifischen Gens dann erheblich

erweitert, wenn die Abfrage im zellulären

B L I T Z L I C H T

Kontext mit Hilfe eines funktionellen Assays

durchgeführt wird.

Die Bestände der von pharmazeutischen

Unternehmen unterhaltenen Substanzbibliotheken

sind dank der kombinatorischen

Chemie auf Millionen von Verbindungen

angewachsen. Das High Throughput Screening

dieser Substanzen unter Nutzung

biochemischer Tests kann – selbst wenn das

Screening schnell abläuft – nur beschränkte

Informationen bereitstellen. Die Verfügbarkeit

des High Throughput, High Content

Imaging auf zellulärer Ebene ermöglicht die

Bewertung komplexer biologischer Prozesse in

einem früheren Stadium des Drug Discovery.

Zudem können bildgebende Verfahren auch

während des sekundären Screenings eingesetzt

werden, wenn die Validierung besonders

starker Reaktion, der sogenannten Hits, und

die Entwicklung zusätzlicher Tests erfolgt.

Dies läßt sich – abhängig von der Spezifizität

der Assays und der Anzahl der untersuchten

Verbindungen – mit Systemen mit mittlerem

oder hohem Durchsatz realisieren.

Im Stadium der Auswahl der „vielversprechendsten“

Kandidaten, bei dem möglicherweise

10 bis 100 Verbindungen übrig

geblieben sind, ermöglicht das High Content-

Imaging die Durchführung zytotoxischer Untersuchungen.

Künftig wird es möglich sein,

derzeit noch manuell durchgeführte Tests in

vollautomatisierte Systeme zu überführen.

Einige dieser Assays müssen gegenwärtig

bereits angesichts zulassungsbehördlicher

Auflagen durchgeführt werden, und ihre

Automatisierung würde wertvolle Zeit für

Forschungaufgaben gewinnen. Der Gewinn

von Informationen über metabolische Prozesse

und über die Toxizität gestattet das

frühzeitige Aussondern ungeeigneter Wirkstoffkandidaten.

Auf diese Weise lassen sich

die äußerst hohen Kosten für einen Abbruch

der Untersuchungen während der Phase

tierexperimenteller Untersuchungen oder

klinischer Prüfungen begrenzen.

Zusammenfassend kann festgehalten

werden, daß zelluläre HCS-Assays in der

Drug Discovery aussagekräftigere Antworten

liefern als die Kategorien „Treffer“ oder

„Fehlschlag“. Die mit dem zellulären High

Content-Imaging erhaltenen Antworten

maximieren in Kombination mit den unterdessen

verfügbaren High Throughput-

Kapazitäten das Potential für die frühzeitige

Auswahl von Wirkstoffen, die zur klinischen

Anwendung kommen werden.

Korrespondenzadresse

John Anson

VP Development, Cellular Assays

GE Healthcare

eMail: john.anson@ge.com

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LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 23


Signaltransduktion


W I S S E N S C H A F T

Alterungsassoziierter

Östrogenrezeptor-Verlust in

Brustepithelzellen

Prof. Dr. Dr. Ralf Hass, Medizinische Hochschule Hannover

Es gibt zahlreiche Diskussionen über die Vor- oder Nachteile einer Hormonersatztherapie

(HRT) etwa bei postmenopausalen Frauen zur Reduktion des Mammakarzinomrisikos 1 .

Unabhängig davon wird eine Hormontherapie teilweise auch direkt bei der Brustkrebsbehandlung

eingesetzt. Brustkrebs – eine maligne Entartung in der Brustdrüse – ist die mit

Abstand häufigste Krebserkrankung bei Frauen und aufgrund diversifizierter Progression bei

nur sehr beschränkten Therapiemöglichkeiten auch eine der häufigsten krankheitsbedingten

Todesursachen 2 . Bei Patientinnen mit früher Menarche, später erster Schwangerschaft und

später Menopause ist das Brustkrebsrisiko erhöht. Dagegen spielt der durch genetische Prädispositionen

erworbene familiäre Brustkrebs statistisch nur eine untergeordnete Bedeutung,

da diese ererbten Mutationen in bestimmten Genen, insbesondere in den Brustkrebsgenen

BRCA1 und BRCA2, nur ca. 5% der Brustkrebserkrankungen bedingen. In einigen großen

Studien wurden bei postmenopausalen Frauen, bei welchen später die Diagnose eines

Mammakarzinoms gestellt wurde, höhere freie Östradiolspiegel gemessen als bei gesundgebliebenen

Frauen. Eine derartige Hormon-Überexposition, so wird vermutet, könnte eine

Kaskade normales Wachstum - Hyperplasie - Neoplasie initiieren 3 . In diesem Zusammenhang

wird die Wirksamkeit antagonistischer Faktoren wie die von Östrogenen und Antiöstrogenen

zur medikamentösen Brustkrebsprophylaxe untersucht 4 .

In einer Reihe von wissenschaftlichen Untersuchungen

konnte gezeigt werden, daß

bei Brustkrebs häufig eine Hormon- (Östrogen-)Abhängigkeit

besteht. Östrogen wird

dabei über ein komplexes regulatorisches

Hormonsystem im Körper gebildet. Im Gehirn

befinden sich der Hypothalamus und

die Hirnanhangsdrüse (Hypophyse), die

großen Einfluß auf die Hormonproduktion

im Organismus haben. Sie steuern die Östrogenausschüttung

über einen endokrinen Regelmechanismus.

Durch Ausschüttung sogenannter

„Releasing-Hormone“ (zum Beispiel

Gonadotropin-RH) aus dem Hypothalamus

wird die Hypophyse stimuliert, Hormone

(Gonadotropine) zu synthetisieren und auszuschütten.

Diese wiederum stimulieren die

Eierstöcke. Es kommt zur Produktion von

Östrogenen. Hohe Östrogenspiegel bewirken

jedoch eine negative Rückkopplung, das

heißt, die übergeordneten Hormone werden

weniger ausgeschüttet, und es kommt demzufolge

auch wieder zu einer geringeren

Östrogenbildung.

Bei den meisten Brustkrebspatientinnen

wird nach der Operation eine adjuvante

medikamentöse Therapie mit Zytostatika

und/oder Hormonen (bzw. Antihormonen)

durchgeführt, insbesondere wenn die

Untersuchung der parallel dazu entfernten

Achsellymphknoten einen Tumorbefall ergeben

hat. Dadurch sollen das Rezidivrisiko

beziehungsweise das Auftreten von Metastasen

gesenkt werden. Die Behandlung mit

(Anti)hormonen kommt vorzugsweise beim

Nachweis entsprechender Hormonrezeptoren

im Tumorgewebe sowie bei Frauen nach

den Wechseljahren in Betracht. Die adjuvante

Chemotherapie dauert drei bis sechs Monate,

die Hormontherapie drei bis fünf Jahre 3,4 . Das

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P H A R M A Z E U T I S C H E R O H S T O F F E

heißt, bei entsprechender Hormonabhängigkeit

kann das Tumorwachstum durch Gabe

von Hormonen oder den entsprechenden

Antihormonen beeinflußt werden. Durch die

Veränderung des Hormonhaushaltes könnte

damit entsprechend die Metastasierung von

Brustkrebs reduziert werden oder bei bereits

bestehender Metastasierung eine Remission

erreicht werden. Es gibt dabei verschiedene

Möglichkeiten und Ansätze einer Hormontherapie:

– GnRH-Analoga: Unterdrückung der Bildung

von Östrogen in den Eierstöcken.

– Antiöstrogene: Bestimmte Tumorzellen

besitzen Rezeptoren, die auf Östrogene

reagieren und mit dem Zellwachstum

beginnen. Antiöstrogene hemmen diese

Rezeptoren. Die Wachstumsstimulation

für die Tumorzelle wird somit inhibiert.

– Aromatasehemmer: Die Aromatase ist ein

Enzym in den Eierstöcken, der Muskulatur,

dem Fettgewebe, aber auch in den Brustkrebszellen.

Die Aromatase metabolisiert

Vorstufen für die Östrogen-Produktion.

Wird das Enzym inhibiert, so führt dies

zu einer starken Senkung des Östrogen-

Spiegels im Blut.

– Gestagene: Hormone mit anti-östrogenem

Effekt. Sie bewirken eine verminderte

Östrogenbildung und eine Reduktion der

Östrogenrezeptoren auf den Tumorzellen.

Bei der Applikation im Rahmen einer Hormontherapie

gibt es allerdings insbesondere

hinsichtlich der Hormondosis, der Kombination

verschiedener Hormongruppen und

ihrer Derivate (Östrogene, Gestagene, Androgene)

sowie dem Applikationszeitpunkt

(Alter der Patientinnen, pharmakokinetische

und chronobiologische Unterschiede) noch

eine Reihe ungeklärter Fragen.

Die Komplexität dieses Systems beginnt

bereits bei den Hormonrezeptoren, wobei

sowohl für Östrogene, als auch für Gestagene

oder etwa Androgene jeweils zwei

Typen von Rezeptoren aus der Familie

der nukleären Steroidhormon-Rezeptoren

bekannt sind. Mindestens ebenso wichtig

sind in diesem Zusammenhang auch Fragen

nach der Hormonrezeptor-Expression,

zum Beispiel inwieweit sich während des

Alterungsprozesses die Anzahl der Hormonrezeptoren

verändert. Obwohl die verschiedenen

Rezeptoren gewebsspezifisch verteilt

sein können, bewirkt die Co-Expression im

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24 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


W I S S E N S C H A F T

Abb. 1: Durch die östrogenvermittelte Phosphorylierung und Aktivierung von P53 kann nachfolgend

der Zellzyklusinhibitor P21 sdi-1 induziert werden mit der Konsequenz der Inhibition von

Cyclinen und cyclinabhängigen Kinasen, was der Zelle einen Zellzyklusarrest vermittelt. Parallel

zu dieser Wachstumsinhibition werden mit der Aktivierung des ATM/ATR-Kinasesystem und

weiter der Chk-1-Kinase und/oder Chk-2-Kinase Reparaturvorgänge eingeleitet. Bei unzureichender

Reparatur führt dies zur Apoptose und damit zur Eliminierung der entsprechenden

Zelle, wogegen eine ausreichende Reparatur einen Apoptoseschutz und ein Überleben der Zelle

gewährleistet 15 .

gleichen Zelltyp häufig synergistische oder

antagonistische Effekte 5 . Eine hormoninduzierte

Rezeptordimerisierung induziert

eine Transkriptionsmaschinerie, deren

Aktivierungsform von weiteren Interaktionspartnern

wie spezifischen Aktivatoren

und Repressoren beeinflußt wird. Nachfolgende

Rezeptormodifikationen in Form von

Methylierung, Acetylierung oder Phosphorylierung

können direkt oder auch indirekt

über eine Chromatinmodifikation die Transkriptions-Aktivität

der Hormonrezeptoren

beeinflussen 6 oder in die Regulation der

Zellzyklusprogression eingreifen 7 .

Bei den Rezeptoren des Östrogens (ER)

etwa unterscheidet man plasmamembranassoziierte

cytoplasmatische Östrogenrezeptoren

(mERs) und nukleäre Rezeptoren

(nERs). Unterschiede zwischen beiden Rezeptorformen

beinhalten alternative Splice-

Varianten 8 , Aminosäuresubstitutionen 9 und

unterschiedliche Acylierungen 10 .

Neben diesen rezeptorassoziierten und

rezeptorvermittelten Aktivierungen sind

vor kurzem auch alternative Signalwege des

Östrogens charakterisiert worden, die keine

unmittelbare Verbindung zwischen dem Hormon

und seinem Rezeptor voraussetzen. So

konnte in vivo gezeigt werden, daß die Hormonproduktion

und die Rezeptoraktivierung

entwicklungsabhängig funktionieren. Diese

Studien des aktivierten Östrogenrezeptors

haben ergeben, daß entwicklungsbedingt

eine hormonunabhängige Rezeptoraktivierung

erfolgen kann 11 .

Unabhängig davon konnte vor kurzem

auch eine rezeptorunabhängige Hormonwirkung

gezeigt werden. So wurde in

alternden Brustepithelzellen nachgewiesen,

daß sich die Anzahl der Östrogenrezptoren

mit zunehmendem Alterungsprozeß bis

zur Nachweisgrenze drastisch verringert.

Trotzdem zeigten diese alternden Brustepihtelzellen

eine deutliche Resonanz auf

eine Stimulation mit Östrogen in Form

einer spezifischen Ser-15-Phosphorylierung

des Tumorsuppressorproteins P53. Da die

Stärke des P53-Phosphorylierungssignals

in einer Konzentrationsabhängigkeit zum

Östrogen steht, wirkt hier offenbar ein sehr

spezifischer Östrogenrezeptor-unabhängiger

Mechanismus 12 . Die östrogenvermittelte Signalkaskade

läuft dabei möglicherweise auch

über intrazelluläre Östrogenmetabolite wie

Hydroxyöstrone, Semichinone und Chinone

ab, die über DNA-Schädigung die DNA-

Proteinkinase (DNA-PK) aktivieren, mit der

Konsequenz der Ser15-Phosphorylierung von

P53. Initiale Östrogenrezeptor-unabhängige

Signale sind auch in Brustkrebszellinien ohne

Östrogenrezeptor identifiziert worden, wobei

das Phosphoinositol-3/Akt-Kinase-System

aktiviert wird 13 . Des weiteren konnten eine

Aktivierung des MAP-Kinasesystems durch

Östrogen und ein Apoptoseschutz im cerebralen

Cortex von Östrogenrezeptor-knock-out

Mäusen nachgewiesen werden 14 . Die Komplexität

einer derartigen östrogenvermittelten

rezeptorunabhängigen Signalkaskade ist der

Übersicht halber im folgenden schematisch

skizziert (Abb. 1).

Durch die Charakterisierung dieser Östrogenrezeptor-unabhängigen

Prozesse (Abb. 1)

läßt sich ein dualer Signaltransduktionsweg

für Östrogen beschreiben:

– ein Östrogenrezeptor-abhängiger schneller

Prozeß mit transkriptioneller Aktivierungskaskade

– ein Östrogenrezeptor-unabhängiger langanhaltender

Prozeß mit metabolischen

Veränderungen.

Im Rahmen einer klinischen Anwendung

haben diese aktuellen Ergebnisse natürlich

auch einen Einfluß insbesondere auf die

Hormonersatztherapie. Sofern sich während

des Alterungsprozesses die Östrogenrezeptoren

auf bestimmten Zellpopulationen

signifikant reduzieren, können hier

bei einer Hormonbehandlung verstärkt

alternative, also Östrogenrezeptor-unabhängige

Signalwege aktiviert werden.

Dies bedeutet dann für die Funktionalität

der Zielzellen eine Verschiebung von einer

transkriptionellen Aktivierungskaskade zu

primär metabolischen Veränderungen. Aufgrund

dieser neuesten Daten muß daher

auch in vivo davon ausgegangen werden,

daß Östrogen und sehr wahrscheinlich

auch andere Steroidhormone eine multiple

Kaskade von Signalen induzieren können,

die in Abhängigkeit von den assoziierten

Interaktionspartnern eine unterschiedliche

metabolische Wirkung und einen Einfluß

auf die Zellzyklusprogression entfalten

können. Weitere Parameter verkomplizieren

dieses System, wie etwa die Abhängigkeit

vom Entwicklungs- und Differenzierungsstadium

und vom jeweiligen Zelltyp.

Literatur

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Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Dr. Ralf Hass

Medizinische Hochschule Hannover

AG Biochemie und Tumorbiologie

Carl-Neuberg-Str. 1, D-30625 Hannover

Tel.: +49-511-532-6070

Fax: +49-511-532-6071

eMail: hass.ralf@mh-hannover.de

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 25


Entwicklungsbiologie


Neue Tools für die Transfektion

von Stammzellen

Dr. Peter Buttgereit, Dr. Klaus Lun und Dr. Oliver Müller, amaxa GmbH, Köln

Stammzellen sind ein heißdiskutiertes Forschungsthema. Mediziner erhoffen sich von der

Stammzelltechnologie viele neue Therapieansätze. Grundlagenforscher wollen durch Untersuchungen

an Stammzellen Einblicke in die Entwicklung von Zellen und Geweben gewinnen.

Nicht nur die ethischen Bedenken insbesondere im Zusammenhang mit menschlichen

embryonalen Stammzellen haben bisher die Forschung mit Stammzellen eingeschränkt,

sondern auch die limitierten Möglichkeiten, diese Zellen zu manipulieren, zum Beispiel

genetisch zu verändern. Doch gerade hier zeichnen sich in jüngster Zeit große Fortschritte

ab. Neue Verfahren ermöglichen jetzt den effizienten Gentransfer in Stammzellen sowie in

andere Primärzellen und könnten wesentlich dazu beitragen, das Potential von Stammzellen

besser auszuschöpfen. Nach einer kurzen Einführung in die Stammzellthematik sollen hier

vor allem diese neuen Methoden und Werkzeuge beleuchtet werden.

Key Words: Stammzellen, Primärzellen, Gentransfer, Transfektion, Nucleofection

Die Bezeichnung ‚Stammzellen‘ faßt eine uneinheitliche

Gruppe von Zellen zusammen.

Sie haben mindestens zwei Eigenschaften

gemeinsam:

– Stammzellen sind Vorläuferzellen von

hochdifferenzierten Zellen und

– nach einer Teilung der Stammzellen können

die Tochterzellen entweder wieder

zu Stammzellen werden oder sich gewebespezifisch

differenzieren, zum Beispiel

zu Zellen, die charakteristische Oberflächenmarker

von Herz-, Nerven-, Blut-,

Haut- oder Muskelzellen exprimieren.

Stammzellen treten zuerst in der frühen Embryonalentwicklung

auf. Bereits die befruchtete

Eizelle stellt eine totipotente Stammzelle dar,

aus der sich später alle Gewebe des menschlichen

Körpers bilden. Je weiter die Spezialisierung

der Tochterzellen einer Stammzelle

voranschreitet, desto stärker wird das Spektrum

ihrer Differenzierungsmöglichkeiten in

verschiedene Gewebe eingeschränkt.

a b

B L I T Z L I C H T

In vielen Geweben des erwachsenen Menschen

existieren zeitlebens Stammzellen,

die wichtige Aufgaben bei der Geweberegeneration

und -reparatur erfüllen. Sie liefern

differenzierte Zellen nach und ersetzen beschädigte

oder abgestorbene Zellen.

Im allgemeinen Sprachgebrauch hat sich

die Unterscheidung zwischen adulten und

embryonalen Stammzellen (ES) etabliert.

Embryonale Stammzellen

Embryonale Stammzellen sind sowohl für die

Grundlagenforschung als auch für die klinische

Forschung von großem Interesse. Da sich

die Zellen unbegrenzt teilen und vermehren

können, sehen Wissenschaftler in ihnen eine

möglicherweise unerschöpfliche Quelle zur

Gewinnung von Zell- und Gewebeersatz. In

der Grundlagenforschung steht die Aufklärung

verschiedener molekularer Mechanismen im

Vordergrund. Untersucht werden vor allem die

Abb. 1: Effiziente Transfektion von Stammzellen mit Hilfe von Nucleofection.

Humane mesenchymale Stammzellen wurden mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) als

Reportergen transfiziert und 24 Stunden nach Gentransfer im Lichtmikroskop (a) und Fluoreszenz-Mikroskop

(b) analysiert.

Spezialisierung und Differenzierung einzelner

Zellen sowie die Regulation dieser Vorgänge.

Aber auch die Organisation von Zellen im Gewebeverband

und in Organen ist ein wichtiges

Thema. Ein etabliertes und häufig verwendetes

System für diese Fragestellungen sind hier

unter anderem embryonale Stammzellen (ES-

Zellen) der Maus.

Mit der klinischen Forschung verbindet

sich die Hoffnung, aus embryonalen Stammzellen

künftig Gewebeersatz züchten zu

können, besonders im Hinblick auf solche

Gewebe, die nur ein geringes oder gar kein

Regenerationsvermögen aufweisen, wie etwa

Nervengewebe. Diskutiert wird die Anwendung

von humanen embryonalen Stammzellen

(hES) zur Behandlung von verschiedenen

Krankheiten wie Morbus Parkinson, Typ 1-

Diabetes sowie Krankheiten des Herz-Kreislaufsystems.

Es erscheint ebenfalls denkbar,

daß embryonale Stammzellen genetisch

manipuliert werden und so im Rahmen einer

Gentherapie etwa zur Wiederherstellung

eines zerstörten Immunsystems eingesetzt

werden könnten. Aber auch der Einsatz von

ES-Zellen in zellbasierten Assays in der Wirkstoffentwicklung

gewinnt an Bedeutung 1 .

Adulte Stammzellen

Eine wichtige Alternative für die Forschung

an embryonalen Stammzellen sind die gewebespezifischen,

adulten Stammzellen. Sie

werden auch als somatische Stammzellen

bezeichnet und nicht aus Embryonen, sondern

aus fetalem oder erwachsenem Körpergewebe

gewonnen. Dazu gehören auch

Stammzellen aus Nabelschnurblut.

Auf dem Gebiet des Gewebeersatzes

wurden bis heute mit adulten Stammzellen

einige therapeutische Verfahren entwickelt,

die in der Klinik zum Teil schon seit langem

eingesetzt werden, so etwa die Knochenmarktransplantation

nach einer Strahlentherapie

(blutbildende Stammzellen, wie zum

Beispiel CD34 + -Zellen).

Offene Fragen und Probleme

Die Forschung an Stammzellen steht noch am

Anfang. Es stellen sich noch viele Fragen in der

Grundlagenforschung. Antworten darauf sind

eine Voraussetzung für ihre Anwendbarkeit

in der regenerativen Medizin. Wie können

Stammzellen effizient gewonnen werden?

Wie wird die Differenzierung der Tochterzellen

von Stammzellen reguliert? Wie können

Stammzellen genetisch verändert werden?

Insbesondere die genetische Veränderung,

also das Einführen sowie das Ein- und das

Ausschalten von Genen in Stammzellen, ist

eine entscheidende Methode. Dies gilt sowohl

für die Stammzellforschung und -anwendung

als auch für die Arbeit mit anderen

Primärzellen. Letztere stellen oft wichtige

experimentelle Modelle dar, da sie dem le-

26 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


enden Organismus sehr nahekommen und

daher für medizinische Fragestellungen

relevant sind.

Die aktuellen Möglichkeiten und neuesten

Entwicklungen auf dem Gebiet des Gentransfers

in Stammzellen sollen im folgenden

näher betrachtet werden.

Genetische Modifikationen von

Stammzellen

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um fremde

Gene in Zellen einzubringen. Für den Gentransfer

in Zellinien (immortalisierte Zellen)

wurde eine Reihe von Methoden etabliert,

die hohe Transfektionseffizienzen erbringen.

Beim Gentransfer in primäre Zellen oder

Stammzellen sind einige dieser Methoden

jedoch sehr ineffizient. Entweder kann das

Fremdgen nur in einen sehr geringen Teil der

Zellen eingebracht werden, oder die Methode

ist zu toxisch, und ein großer Anteil der

Zellen stirbt durch die Behandlung.

Viraler Gentransfer

Man unterscheidet virale und nicht-virale

Gentransfermethoden. Bei den viralen Methoden

werden – wie der Name schon sagt

– Viren als Vektoren eingesetzt. Sie sind so

B L I T Z L I C H T

modifiziert, daß sie zu einer starken Expression

des eingebrachten Gens führen, sich in der

Zelle jedoch nicht weiter vermehren können.

Virale Vektoren sind meist sehr zelltypspezifisch

und benötigen für die Aufnahme in

die Zelle entsprechende Rezeptoren. Falls

diese auf den Zielzellen nicht vorhanden

sind, ist die Gentransfer-Effizienz oft sehr

gering. Zum Beispiel eignen sich veränderte

Adenoviren nicht, um CD34 + -blutbildende

Stammzellen zu transfizieren. Im Gegensatz

dazu konnte in humanen mesenchymalen

Stammzellen die Expression eines Reportergens

nach Infektion mit Adenoviren in 30%

bis 40% der Zellen gezeigt werden 2 .

Neben einer relativ aufwendigen Herstellung

und arbeitsintensiven Aufreinigung

stellen Sicherheitsaspekte ein Hindernis für

die Anwendung von viralen Vektoren dar.

Zum einen ist die Arbeit mit modifizierten

Vektoren nur in S-2-Sicherheitslabors erlaubt,

zum anderen besteht die Möglichkeit, daß es

zu einer Immunreaktion im Patienten kommt

oder das Virus zum infektiösen Wildtyp

rekombiniert. Weitere Probleme in diesem

Zusammenhang sind eine mögliche Integration

der Fremd-DNA in das Genom der Zellen

oder Dosis-Effekte bei der Applikation. 1999

gab es einen Todesfall während einer Gen-

Therapie-Studie mit modifizierten Adeno-

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201

Ulrike Riedel SELBSTBESTIMMUNG AM LEBENSENDE DURCH PATIENTENVERFÜGUNG 211

Günter Stock WAS IST UNS DIE GESUNDHEIT WERT? 219

WIEVIEL GESUNDHEIT KÖNNEN, WIEVIEL MÜSSEN WIR UNS LEISTEN?

Karl-Friedrich Sewing PATIENTENRECHTE AM ANFANG DES LEBENS 229

Markus Schwertfeger GENDIAGNOSTIKGESETZ UND WISSENSCHAFTLICHE FORSCHUNG 237

Birgit Baum / INNOVATIONSTRANSFER ZWISCHEN WISSENSCHAFT 241

Stefan Müllner UND WIRTSCHAFT IN DEN LIFE SCIENCES

Corinna Werwigk- „HEIMLICHE“ VATERSCHAFTSTESTS – 249

Hertneck et al RECHTLICHE ZULÄSSIGKEIT UND GRENZEN

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viren. Eine Studie mit retroviral veränderten

CD34 + -Stammzellen zeigte, daß es durch Insertion

des viralen Vektors zu Störungen der

Blutbildung kommen kann. Zwei Patienten

entwickelten eine Leukämie 3 .

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Aus diesen Gründen werden zunehmend

nicht-virale Methoden zur Transfektion

eingesetzt, insbesondere um die Sicherheit

von genetisch veränderten Stammzellen im

Hinblick auf eine therapeutische Anwendung

zu erhöhen.

Eine dieser nicht-viralen Methoden ist die

Lipofektion. Die in die Zelle einzubringende,

negativ geladene DNA bindet dabei an positiv

geladene Lipide. Diese DNA-Lipid-Komplexe

werden dann von der Zelle über Endozytose

aufgenommen.

Weitere nicht-virale Gentransfermethoden

sind physikalische Methoden wie die Elektroporation

(elektrischer Impuls zur Öffnung der

Zellmembran), der ballistische Gentransfer

(Beschuß von Zellen, z.B. mit Gold-DNA-

Partikeln) und die Mikroinjektion (direktes

Einbringen von DNA über Kapillaren).

Die bisher erwähnten nicht-viralen Methoden

liefern aber oft keine befriedigenden

Ergebnisse in primären Zellen. Ein Vergleich

Das interdisziplinäre

Forum für Biopolitik

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 27


verschiedener Transfektionsreagenzien ergab

nach der Optimierung der Protokolle eine

maximale Effizienz von 1% transfizierten

mesenchymalen Stammzellen 2 . Liposomale

Reagenzien zeigen auch bei anderen

Stammzellen, wie humanen CD34 + -Zellen

oder Maus-ES-Zellen, keine nennenswerten

Gentransferraten. Sie liegen meist niedriger

als 5% 4 .

Elektroporation oder ballistischer Gentransfer

zeigen eine akzeptable Effizienz,

die aber oft mit einem hohen Zellverlust

verbunden ist. Bei der Mikroinjektion ist

die Toxizität gering, und die Effizienz liegt

bei nahezu 100%, da aber jede Zelle einzeln

injiziert wird, ist die Menge der bearbeitbaren

Zellen äußerst gering.

Nucleofection

Eine neue, nicht-virale Technologie ist die

Nucleofection. Hierbei handelt es sich um eine

Weiterentwicklung der Elektroporation. Sie

basiert auf der Kombination von optimierten

Elektroporations-Parametern mit zelltypspezifischen

Reagenzien. Mit dieser Methode kön-

Tab. 1: Beispiele für virale und nicht-virale Transfektion von Stammzellen

B L I T Z L I C H T

cleofection konnten jedoch mehr als 70% der

CD34 + -Stammzellen erfolgreich transfiziert

werden 8,9 . Als ein möglicher therapeutischer

Ansatz, um zerstörtes Nervengewebe von

Patienten zu ersetzen, werden modifizierte

neuronale Stammzellen diskutiert. Die

Transfektionseffizienz bei der Nucleofection

von neuronalen Stammzellen (NSC) aus der

Maus liegt bei ca. 55% 10 . Diese modifizierten

Maus-Zellen können dann sogar zu Oligodendrozyten

differenziert werden 10 . Ähnliche

Ergebnisse wurden beim Gentransfer mittels

Nucleofection in neuronale Stammzellen aus

Ratten 11,12 und Mäusen 13 erreicht.

Mit der Nucleofector-Technologie konnten

mit hoher Effizienz besonders schwer zu

transfizierende adulte Stammzellen – wie

etwa humane Knochenmarkszellen und multipotente

adulte Stammzellen (multipotent

adult progenitor cells, MAPCs) aus Mensch,

Maus oder Ratte – transfiziert werden sowie

embryonale Stammzellen – wie etwa Maus-

ES-Zellen 4,14 . Die Maus-ES-Zellen wurden

sowohl transient als auch stabil transfiziert,

mit einer fast 10mal höheren Rate als mit anderen

Transfektionsmethoden 4 . Sie konnten

Zelltyp viraler Gentransfer nicht-viraler Gentransfer

(Transfektionseffizienz) (Transfektionseffizienz)

humane mesenchymale Adenoviren (30-40%) 2 Lipofektion (1%) 2

Stammzellen Nucleofection (bis 80%) 2

humane CD34 + -Stammzellen Lentiviren (ca. 50%) 15 Elektroporation (15%) 7

8, 9, 16

Nucleofection (70%)

Maus neuronale Stammzellen Retroviren (bis 90%) 17 Nucleofection (55%) 10

Maus embryonale Stammzellen Adenoviren, Adeno Lipofektion (6%) 19

assozierte Viren (AAV) Nucleofection (60%; nach

(weniger als 5% AAV, nur in Selektion 10fach mehr

differenzierten ES-Zellen) 18 ES-Zell-Klone) 4

nen erstmals auch Primär- und Stammzellen

mit sehr hoher Effizienz transfiziert werden.

Gleichzeitig wird durch den Einsatz der

spezifischen Reagenzien eine weitaus höhere

Zell-Überlebensrate erreicht als bei anderen

Elektroporationsverfahren. Für die Nucleofection

humaner mesenchymaler Stammzellen

wurden Transfektionseffizienzen von bis zu

80% beschrieben 2 . Durch Nucleofection genetisch

modifizierte humane mesenchymale

Stammzellen wurden als Herzschrittmacher in

vitro und in Tierherzen in vivo getestet 5 . Ebenso

wurden humane mesenchymale Stammzellen

und Nucleofection in Studien zur Knochen-

und Knorpelbildung eingesetzt 6 . Abbildung

1 zeigt ein Beispiel für die Transfektion von

humanen mesenchymalen Stammzellen mit

dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) als

Reporter.

Auch in humanen blutbildenden CD34 + -

Stammzellen konnten mit Nucleofection

sehr hohe Gentransferraten bei einem sehr

geringen Zellverlust realisiert werden. Arbeiten

mit anderen Elektroporationsmethoden

zeigen eine Effizienz von ca. 15% 7 . Mit Nu-

auch zu Herzmuskelzellen differenziert und

erfolgreich zur Erzeugung transgener Mäuse

eingesetzt werden 4 .

Tabelle 1 faßt die unterschiedlichen Methoden

mit Beispielen zur Transfektionseffizienz

in verschiedenen Stammzellen zusammen.

Anwendungen mit genetisch

modifizierten Stammzellen

In zahlreichen klinischen Studien wird gegenwärtig

eine Vielzahl von Ansätzen mit

genetisch modifizierten Stammzellen getestet,

die zum Teil bereits vielversprechende

Ergebnisse liefern (siehe www.gemcris.od.nih.

gov/). Die potentiellen therapeutischen Anwendungen

im Menschen stehen in der

Öffentlichkeit im Vordergrund, jedoch gibt

es noch weitere, bedeutende Anwendungen

von genetisch modifizierten Stammzellen.

So können Stammzellen durch gezielte genetische

Modifikationen, die zum Beispiel

zur Expression eines Differenzierungsfaktors

führt, ihr Differenzierungspotential bereits in

vitro entfalten, und dadurch bestimmte Zellen

bilden 10 . Diese können dann wiederum zu Forschungszwecken

eingesetzt werden. So lassen

sich Zellen gewinnen, deren Verfügbarkeit ansonsten

limitiert wäre, da sie im differenzierten

Zustand ihre Teilungsfähigkeit verloren haben

– wie beispielsweise Nervenzellen. Wie bereits

erwähnt, finden insbesondere mesenchymale

Stammzellen großes Interesse in der Forschergemeinschaft,

da diese unter reproduzierbaren

Bedingungen zum Beispiel in Knorpelzellen

differenziert werden können.

Ausblick

Für die Transfektion von Stammzellen sind

– speziell im Hinblick auf die Sicherheit bei

einer therapeutischen Verwendung im Menschen

– nicht-virale Transfektionsmethoden

eine wichtige Alternative zu den viralen Methoden.

Insbesondere durch die neue Technologie

der Nucleofection lassen sich sowohl

adulte als auch embryonale Stammzellen

nun effizient und nicht-viral transfizieren und

dadurch genetisch verändern. Damit steht ein

neues und leistungsfähiges Werkzeug zur

Verfügung, welches der Stammzellforschung

neue Möglichkeiten eröffnet.

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28 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT

h


Zellbiologie


B L I T Z L I C H T

Multiparametrische

DNA-Zytometrie mit DRAQ5

Dr. Michael Kapinsky, Beckman Coulter GmbH, Krefeld

Dr. Johannes Fischer, Institut für Transplantationsdiagnostik und Zelltherapeutika,

Medizinische Einrichtungen der Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf

Die durchflußzytometrische Analyse des zellulären DNA-Gehalts gilt als Methode der Wahl zur

Bestimmung der Ploidie und proliferativen Aktivität. Im Gegensatz zu immunhistochemischen

Methoden ist die Durchflußzytometrie für die Einzelzell-Analyse einer großen Zahl von Zellen

(10 5 -10 6 ) in sehr kurzer Zeit geeignet und gestattet die simultane multiparametrische Analyse

von Oberflächenantigenen aus unterschiedlichsten Zellmaterialien wie peripherem Blut,

Knochenmark-Aspiraten, vereinzelten Zellen aus solidem Gewebe, Zellen aus Kulturansätzen

etc. Die durchflußzytometrische DNA-Analyse beruht auf der im Idealfall stöchiometrischen

Anfärbung von Nukleinsäuren, in einigen Fällen spezifisch der DNA-Doppelhelix. In den

Pioniertagen der Methode, welche als Pioniertage der Zytometrie überhaupt anzusehen sind,

kamen mit UV- oder blauen 488-nm-Argon-Lasern anregbare Farbstoffe wie Hoechst 33342

oder das unvermindert populäre Propidiumiodid (PI) zum Einsatz. Während der Einsatz UVanregbarer

Farbstoffe häufig an der Lichtquellenausstattung üblicher Zytometer scheitert,

limitiert das sehr breite Emissionsspektrum des bei 488 nm anregbaren PI (EMmax617 nm)

den simultanen Einsatz nicht grün fluoreszierender Farbstoffe massiv und erfordert zudem eine

Permeabilisierung der Zellen. Die Verwendung anderer Farbstoffe mit günstigeren spektralen

Eigenschaften wie etwa 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, EMmax648 nm) resultiert zum Teil in

nicht stöchiometrischen DNA-Färbungen, welche zu unscharfen Phasendarstellungen und zu

einer falschen Beurteilung der zellulären Ploidie führen können * . Viele dieser Probleme der

multiparametrischen DNA-Zytometrie können durch Verwendung des erst seit kurzer Zeit

kommerziell erhältlichen DNA-Farbstoffs DRAQ5 elegant gelöst werden.

Einer der jüngeren Vertreter aus der Gruppe

der DNA-Farbstoffe ist das Membran-permeante

Anthrachinon DRAQ5 (Alexis Biochemicals),

das eine mit PI vergleichbare Qualität

der DNA-Färbung ermöglicht, im Gegensatz

zu diesem aber mit fixierenden, nicht permeabilisierenden

Färbeprotokollen kompatibel

ist 2,3 . Unter Erhaltung der Oberflächenanti-

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gene und der Lichtstreuungscharakteristik

können kernhaltige Zellen identifiziert und

deren proliferative Aktivität bestimmt werden.

Mit einer Emission von >670 nm bis ins

Nah-Infrarot bei einem Exzitationsmaximum

von 647 nm (Exzitation aber auch bei 488 nm

möglich!) kann DRAQ5 ohne Korrektur der

spektralen Übersprechung neben Fluorescin-

Isothiocyanat (FITC, EMmax519 nm) oder

dem Produkt des Markergens Green Fluorescent

Protein (GFP, EMmax509 nm) eingesetzt

werden. DRAQ5 kann darüber hinaus

– im Gegensatz zu PI – leicht mit typischen

Antikörperlabeln wie Phycoerythrin (PE,

EMmax576 nm) und PE-Texas Red/Energy

Coupled Dye (ECD, EMmax613 nm) sowie

mit nicht grün fluoreszenten Expressionsreporterproteinen

kombiniert werden. Auf nur

mit einem 488-nm-Argonlaser ausgestatteten

Benchtop-Zytometer wird dadurch die simultane

vierparametrische Analyse der DNA

und Antigen-Expression möglich 4,5 .

Multiparametrische Analysen mit

DRAQ5 – Applikationsbeispiele

Beispiel 1 (Knochenmark): Die multiparametrische

DNA-Messung verbessert die Diagnostik

lymphoproliferativer Erkrankungen

dergestalt, daß auch kleine, immunologisch

definierte Lymphom-Populationen einer

Proliferationsanalytik unterzogen und kernhaltige

CD45-negative Zellen identifiziert

werden können. Aneuploidien weisen auch

bei unklarem oder untypischem Expressionsmuster

auf aberrante Zellen hin. Es

konnte gezeigt werden, daß die proliferative

Aktivität von Lymphomzellen einen unabhängigen,

adversen prognostischen Faktor

darstellt 6 . Therapie-Antwort und Überleben

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 29

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B L I T Z L I C H T

Abb. 1: Knochenmark; CD34-FITC/CD38-PE/CD45RA-ECD/DRAQ5;

türkis: Nukleierte Zellen, DRAQ5+; blau: Mononukleäre Zellen, SSC low CD45RA+und+/-DRAQ5+;

rot: CD45RA+CD34+CD38+DRAQ5+; grün: CD45RA+/-CD34+ CD38+/-DRAQ5+

der Patienten korrelieren scharf mit der Größe

der S-Phasen-Fraktion von Lymphomzellen 7,8.

Das Cytomics FC 500 (Beckman Coulter)

ermöglicht die simultane Akquisition von

DRAQ5 auf logarithmischer und linearer

Skalierung. Dadurch können zunächst

nukleierte Zellen auf dem logarithmischen

Parameter identifiziert werden (Abb. 1a,

NC, türkis). Das weitere Gating verknüpft

die Bedingungen SSCvsCD45RA (Abb. 1b,

Region MNC, blau), SSCvsCD34 (Abb. 1c,

Region CD34 + , rot) und CD34vsCD38 (Abb.

1d, Region CD38dim, grün), wodurch zwei

CD34-positive Populationen gefunden

werden: CD45RA + CD34 + CD38 + (rot) und

CD45RA ± CD34 + CD38 ± (grün). Der gleichzeitig

aufgenommene lineare DRAQ5-Parameter

zeigt eine gut erkennbare S-Phasenfraktion

in CD45RA + CD34 + CD38 + (rot) an,

nicht aber in CD45RA ± CD34 + CD38 ± (grün)

(Abb. 1e).

Beispiel 2 (Knochenmark): Unspezifische

Bindungen durch tote Zellen und Debris

erschweren die Beurteilung der Spezifität

einer Antigendetektion. Die Aspiration des

hier untersuchten Materials liegt mehr als 12

Stunden zurück. Anhand einer Färbung mit

PI und DRAQ5 kann die sichere Diskriminierung

toter Zellen und nicht kernhaltiger

Ereignisse erreicht werden. Über lineare

Regionen werden kernhaltige (DRAQ5 + ),

tote (PI + ) und leukozytäre (CD45-FITC + ) Ereignisse

definiert (Abb. 2a-c). Die Darstellung

ungated-SSCvsFSC (Abb. 2d) kann somit als

Überlagerung nukleierter Zellen –lebend

(blau) und tot (türkis) – sowie CD45-positiver

Zellen – lebend (rot) und tot (pink) – aufgelöst

werden (Abb. 2e-h).

Beispiel 3 (NK-Zellen aus Zellkultur unmittelbar

nach GFP-Transfektion): Auch im

zellbiologischen Umfeld kann die Doppelfärbung

PI/DRAQ5 ein wertvolles Werkzeug

Abb. 2: Knochenmark; CD45-FITC/PI/DRAQ5; blau: lebende nukleierte Zellen, DRAQ5+PI-CD45-;

türkis: tote nukleierte Zellen, DRAQ5+PI+CD45-; rot: lebende Leukozyten, DRAQ5+PI-CD45+;

pink: tote Leukozyten, DRAQ5+PI+CD45+

sein. Die Fehlinterpretation unspezifischer

Fluoreszenzen als Reportersignal oder

Indikator einer hochregulierten Antigenexpression

kann vermieden werden, wenn

nicht nukleierte Ereignisse und tote Zellen

diskriminiert werden. Die Gating-Strategie

folgt klaren, Scatter-unabhängigen Kriterien

dergestalt, daß eine Standardisierung

möglich und somit eine automatisierte Verarbeitung

von Proben mit hohem Durchsatz

auch aus 96-well-Platten mit dem Cytomics

FC 500 Multi Plate Loader (MPL) umsetzbar

ist. Über lineare Regionen werden kernhaltige

(DRAQ5 + ) und tote (PI + ) Ereignisse

identifiziert (vgl. Abb. 2a,b). Das Tomogram

DRAQ5vsPIvsFITC illustriert, daß es sich

bei allen FITC-positiven Ereignissen um tote

Zellen oder Debris handelt (Abb 3a, b).

Standardisierung von

multiparametrischen DRAQ5-Assays

Die in den vorangegangenen Beispielen

beschriebenen Applikationen stellen keine

durchflußzytometrischen Standardanwendungen

dar. Um in einer Studien- oder

klinisch-diagnostischen Umgebung einen

Stellenwert erhalten zu können, ist eine

Standardisierung solcher Assays unerläßlich.

Mit der für klinische Applikationen

konzipierten Cytomics-FC-500-Akqisitionssoftware

CXP2.0 können derartige Assays

Abb. 3: NK-Zellen aus Zellkultur unmittelbar

nach GFP-Transfektion; GFP/PI/DRAQ5;

blau: lebende nukleierte Zellen, PI-DRAQ5+;

türkis: tote nukleierte Zellen, PI+DRAQ5+;

pink: FITC-positive Ereignisse

standardisiert und auch im Rahmen von

Multicenter-Studien zwischen verschiedenen

Cytomics-FC-500-Einheiten transferiert

werden. Kernstück der Standardisierung mit

CXP2.0 ist das automatisierte Advanced-Digital-Compensation(ADC)-Modul,

welches

anwenderfreundlich die Erzeugung von

applikationsbezogenen Auto-Setups ermöglicht.

Bei den so erstellten Auto-Setups können

authentisches Probenmaterial und die

im Assay eingesetzten Antikörperkonjugate

oder Farbstoffe für die Standardisierung verwendet

und dokumentiert werden. Hierbei

beruht das resultierende Instrument-Setting

auf einer inversen Matrixkompensation, mit

der auch sehr komplexe Übersprechmuster

beherrscht werden können. Somit wird die

Beschreibung eines komplexen Assays in

Form von SOPs ermöglicht. Die Durchfüh-

30 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


ung komplexer Assays ist objektivierbar und vom Know-how des

Anwenders unabhängig.

Die multiparametrische Analyse mit DRAQ5 überwindet die

Limitationen bisheriger simultaner Analysen von Phänotyp und zellulärem

DNA-Gehalt. Ein Fortschritt ergibt sich insbesondere für die

Diagnostik lymphoproliferativer Erkrankungen und die Identifikation

kernhaltiger Zellen in komplexer Matrix. Mit dem Beckman Coulter

Cytomics FC 500 und der klinischen Software CXP2.0 steht eine

Abb. 4: Durchflußzytometer Cytomics FC 500 von Beckman Coulter

zur Durchführung von standardisierten durchflußzytometrischen

Assays

Zytometrielösung mit optimalem Zuschnitt zur Verfügung: simultane

Akquisition von logarithmischem und linearem DRAQ5-Parameter,

drei DRAQ5-kompatible Parameter für Phänotypisierung und die

Software CXP2.0 mit offenem Standardisierungsmodul und automatisierter

Qualitätskontrolle.

Literatur

[1] Bauer KD, Duque RE, Shankey V. 1993. Clinical Flow Cytometry – Principles and Applications. Baltimore: Williams and

Wilkins. p 117-142.

[2] Smith PJ, Wiltshire M, Davies S, Patterson LH, Hoy T. A Novel Cell Permeant and Far Red-Fluorescing DNA Probe,

DRAQ5, for Blood Cell Discrimination by Flow Cytometry. J Immunol Methods 1999;229:131-139.

[3] Smith PJ, Blunt N, Wiltshire M, Hoy T, Teesdale-Spittle P, Craven MR, Watson JV, Amos WB, Errington RJ, Patterson LH.

Characteristics of a Novel Deep Red/Infrared Fluorescent Cell Permeant DNA Probe, DRAQ5, in Intact Human Cells

Analyzed by Flow Cytometry, Confocal and Multiphoton Microscopy. Cytometry 2000;40:280-291.

[4] Yuan CM, Douglas-Nikitin VK, Ahrens KP, Luchetta GR, Braylan RC, Yang L. DRAQ5-Based DNA Content Analysis of

Hematolymphoid Cell Subpopulations Discriminated by Surface Antigens and Light Scatter Properties. Cytometry B Clin

Cytom. 2004;58:47-52.

[5] Plander M, Brockhoff G, Barlage S, Schwarz S, Rothe G, Knuechel R. Optimization of Three- and Four-Color Multiparameter

DNA Analysis in Lymphoma Specimens. Cytometry A. 2003;54:66-74.

[6] Braylan CR. Flow cytometric DNA Analysis in the Diagnosis and Prognosis of Lymphoma. Hematopathol 1993;99:374-

380.

[7] Joensuu H, Ristamaki R, Soderstrom KO, Jalkanen S. Effect of Treatment on the Prognostic Value of S-Phase Fraction in

Non-Hodgkin´s Lymphoma. J Clin Oncol 1994;12:2167-2175.

[8] Holte H, Zhenhe S, Smeland EB, Kvaloy S, Langholm R, Stokke T. Prognostic Value of Lymphoma-Specific S-Phase

Fraction Compared with That of Other Cell Proliferation Markers. Acta Oncol 1999;38:495-503.

Fußnote

* Das Gelingen einer stöchiometrischen DNA-Färbung hängt neben dem Molekulargewicht und der Struktur des verwendeten

Farbstoff auch vom Grad der Chromatinkondensation und der Präparationsmethode ab [1].

Korrespondenzadresse

Beckman Coulter

Dr. Markus Kaymer (Produktmanager Durchflußzytometrie)

Europark Fichtenhain B13, D-47807 Krefeld

Tel.: +49-(0)2151-333-729, Fax: +49-(0)2151-333-631

eMail: mkaymer@beckman.com

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LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 31


STS-Meeting-Report


8. Joint Meeting ‘Signal

Transduction: Receptors,

Mediators and Genes’

Das Hilton Hotel in Weimar war vom 4. bis 6. November 2004 Schauplatz des internationalen

„Joint Meeting Signal Transduction: Receptors, Mediators and Genes“. Erneut wählte die Signal

Transduction Society (STS) die Klassikerstadt als Veranstaltungsort für ihre traditionelle,

inzwischen achte Jahrestagung, bei der Wissenschaftler aus den verschiedendsten biomedizinischen

Forschungsrichtungen ihre neuesten Ergebnisse diskutierten. Die STS-Meetings

waren ursprünglich 1997 in recht kleinem Rahmen begründet worden mit der Zielsetzung, in

einer informellen und betont kommunikativen Atmosphäre Forscher miteinander ins Gespräch

zu bringen, die üblicherweise in unterschiedlichen wissenschaftlichen Zirkeln ‚zu Hause‘ sind.

Der stetige Erfolg und die lebendige Weiterentwicklung dieses Konzepts gab den Initiatoren

recht. Die Signal Transduction Society hat inzwischen mehr als 350 Mitglieder, und für viele

von ihnen ist das herbstliche Zusammentreffen beim STS-Meeting zu einem „Highlight“ im

Jahreslauf geworden.

Etwa 250 internationale Wissenschaftler aus

Forschung, Klinik und Industrie diskutierten

in Weimar gewohnt intensiv neue Erkenntnisse

aus dem weiten Feld der Signaltransduktion.

Das Programm gliederte sich in sieben

„Workshops“, die sich auf jeweils einen

spannenden Aspekt aktueller Forschung

konzentrierten. Daneben gab es zwei Poster-

Sessions mit der beliebten Besonderheit, daß

vor Besprechung der Daten an den Postern

alle Autoren ihre Beiträge dem Plenum mit

einem einminütigen Kurzvortrag vorstellen

konnten. Die Organisation des STS-Meetings

trug in bewährter Weise der Tatsache

Rechnung, daß erfolgreiche Kollaborationen

besonders leicht beim geselligen Treffen der

Wissenschaftler zustandekommen, und das

bezog gemeinsame festliche Abendessen in

die Tagung mit ein.

Workshops

Die sieben Workshops wurden in den meisten

Fällen vom Vortrag eines international

renommierten ‚Keynote-Speakers‘ eingeleitet

und durch Beiträge vervollständigt, die aus

dem Fundus der eingereichten Abstracts

ausgewählt worden waren. Einige Aspekte

aus dem wissenschaftlichen Programm sollen

einen Eindruck davon geben, wie interessant

es war, beim 8. STS-Meeting die dynamische

Entwicklung der Forschung auf dem Gebiet

der Signaltransduktion zu verfolgen.

Eine Hauptmotivation für die Entschlüsselung

molekularer Mechanismen bei der

intrazellulären Signalweiterleitung liegt in

dem Bestreben, spezifischere neue Pharmaka

W I S S E N S C H A F T

Karlheinz Friedrich, Jena; Ottmar Janssen, Kiel; Ralf Hass, Hannover

zu entwickeln. Ein interessanter Beitrag aus

diesem Feld kam von Peter Schmidt, Universität

Magdeburg, der im Workshop ‚Disease

and Therapy‘ zeigte, wie ein neuartiger

Wirkstoff lösliche NO-abhängige, Häm-enthaltende

Guanylatcyclasen aktivieren kann,

indem er das Häm funktionell ersetzt. Weil

die Funktion der Guanylatcyclasen wichtig

250 Teilnehmer auf dem 8. STS Meeting

für die Kontrolle von Gefäß-Widerstand und

Herzleistung ist, sind derartige Moleküle von

großem klinischen Interesse für die Behandlung

kardiovaskulärer Erkrankungen.

Im folgenden Workshop ‚Adhesion, Cell

Motility and the Cytoskeleton‘ zeigte Yolanda

Calle vom King’s College in London, daß die

intrazelluläre calciumabhängige Cysteinprotease

Calpain eine entscheidende Rolle für die

Beweglichkeit von dendritischen Zellen besitzt.

Diese wichtigen antigenpräsentierenden

Zellen, die auch in der Haut patrouillieren,

adhärieren und bewegen sich mit Hilfe sogenannter

Podosomen. Sowohl biochemische

als auch morphologische Analysen bewiesen,

daß eine spezifische Inhibition von Calpain

die Ausbildung und Funktion dieser Strukturen

blockiert.

Frank-D. Böhmer von der Universität

Jena leitete mit einem Keynote-Vortrag den

Workshop ‚Kinases and Phosphatases‘ ein

und zeigte anhand vieler Beispiele die Bedeutung

der Regulation des Wechselspiels

von Phosphorylierung und Dephosphorylierung

auf. Eine bisher unbekannte Funktion

von Phosphotyrosin-Phosphatasen (PTPs)

besteht offenbar in ihrem Beitrag zur Reifung

von Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs). FLT-3

ist eine RTK, die an der Entstehung einer

bestimmten Form von Leukämie beteiligt ist

und wird durch Tyrosinphosphorylierung

im endoplasmatischen Retikulum zurückgehalten.

Böhmers Gruppe fand erstmals, daß

die Aktivität von PTPs nötig ist, damit reifes

FLT-3 effizient in die Cytoplasma-Membran

eingebaut werden kann.

Im Workshop ‚Chemokines, Cytokines,

Growth Factors and their Receptors‘ berichtete

Peter C. Heinrich von der Technischen

Hochschule Aachen in einem Übersichtsvortrag

über die eindrucksvollen Fortschritte

im Verständnis der Funktion des Rezeptorkomplexes

für Interleukin-6 und verwandte

Cytokine. Mit fluoreszenzmarkierten Mediatoren

der Signalprozesse wurde unter

anderem erschlossen, daß Janus-Kinasen

einen wichtigen Beitrag für die Reifung und

Oberflächenpräsentation der Rezeptormoleküle

leisten. Laserscanning-Mikroskopie

ermöglichte auch die neue Beobachtung, daß

die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren

mit einer Akkumulation in charakteristischen

Kernstrukturen einhergeht.

Die Koordination von Signaltransduktion

beruht auf einem komplexen und flexiblen

Netzwerk der Interaktion zwischen Signalproteinen.

Bekanntermaßen wird die Vielfalt

dieser Wechselwirkungen durch reversible

Kontakte zwischen relativ kleinen Proteinmodulen

bestimmt, welche die Thematik des

Workshops ‚Interaction Domains and Signalling

Complexes‘ darstellten. Hier präsentierte

Reza Ahmadian vom Max-Planck-Institut für

molekulare Physiologie in Dortmund neue

Befunde zum Zusammenspiel der kleinen

GTPase Rho mit ihren Bindungspartnern.

Rho kontrolliert das Cytoskelett und wird

wie alle Proteine der Familie von inhibitorischen

und aktivierenden Regulatoren (GDIs,

GEFs, GAPs) in seiner Aktivität beeinflußt.

Wesentlich weniger gut verstanden sind die

Wechselwirkungen kleiner G-Proteine mit

Effektorproteinen, und hier trug die Dortmunder

Gruppe neue Einsichten bei, indem

sie mittels Kristallstruktur-Analyse und

Fluoreszenzspektroskopie die Modalitäten

des Kontaktes von RhoA mit der Rho-Kinase

präzise beschreiben konnte.

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32 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


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Vorläufiges Endergebnis intrazellulärer Signalprozesse

ist die spezifische Modulation

der Genexpression. Den zugrundeliegenden

Mechanismen widmete sich ein weiterer

Workshop mit dem Titel ‚Chromatin Modifications

and Transcription‘. Edgar Serfling

von der Universität Würzburg stellte hier

die Transkriptionsfaktoren NFAT (Nuclear

Factor of Activated T Cells) und NF-κB

einander gegenüber, die beide wichtige Vermittlerfunktionen

bei der Aktivierung und

Differenzierung von Lymphocyten ausüben.

Interessanterweise kann die anti-apoptotische

Aktivität von NF-κB in pathologischen

Situationen zur Oncogenese beitragen,

während der pro-apoptotische Faktor NFAT

in lymphoiden Zellen als Tumorsuppressor

wirken kann.

Zellen des Immunsystems stellen traditionell

besonders intensiv bearbeitete Modellsysteme

für die Signaltransduktion dar.

Konsequenterweise wurde das STS-Meeting

von einem speziellen Workshop ‚Signal

Transduction in Immune Cells‘ beschlossen.

In diesem Kontext entführte Jules Hoffmann

vom Institut für Molekular- und Zellbiologie

des CNRS in Strasbourg das Auditorium in

die faszinierende Welt der Drosophila-Forschung.

Die genetisch seit vielen Jahrzehnten

studierte Fliege weist ein einfaches Immunsystem

mit aufschlußreichen Parallelen zur ‚angeborenen‘

Immunreaktion von Säugern auf.

Im Mittelpunkt dieser Homologie, die sich

auf viele beteiligte Signalproteine erstreckt,

steht das Toll-Rezeptorsystem, das beim

Säuger Reaktionen auf Lipopolysaccharide

(LPS) vermittelt, bei Drosophila jedoch für

die Expression hochpotenter antimikrobieller

Peptide sorgt.

Alle auf dem 8. STS-Meeting vorgestellten

wissenschaftlichen Beiträge wurden auch

in einer Sonderausgabe des Journals SIGNAL

TRANSDUCTION - RECEPTORS, MEDIATORS AND GE-

NES publiziert. In dieser neuen, von der STS

initiierten Zeitschrift können Orginalarbeiten

über Signaltransduktion, aber auch Short

Communications, Reviews und Minireviews

auf besonders schnelle und effiziente Weise

veröffentlicht werden (siehe www3.inter

science.wiley.com/cgi-bin/jhome/75500490).

Schon jetzt laufen die Vorbereitungen für

das kommende 9. STS-Meeting. Es wird vom

10. bis 12. November 2005 erneut in Weimar

stattfinden. Informationen auch hierzu unter

www.sigtrans.de

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Dr. Ralf Hass

Medizinische Hochschule Hannover

AG Biochemie und Tumorbiologie

Carl-Neuberg-Str. 1

30625 Hannover

Tel.: +49-511-532-6070

Fax: +49-511-532-6071

eMail: hass.ralf@mh-hannover.de

B L I T Z L I C H T

Biomimetik


Simulation von Blutgefäßen in

Zellkultur-Biochips

Dr. Ulf Rädler, Dr. Roman Zantl. ibidi GmbH, München

Gefäßerkrankungen wie etwa Arteriosklerose gehören in der Wohlstandsgesellschaft zu den

häufigsten Todesursachen. Die Wechselwirkung von Blutbestandteilen mit den Gefäßwänden

erzeugen nicht nur ungewünschte Ablagerungen, sondern spielen auch eine entscheidende

Rolle bei vielen Stoffwechselvorgängen. Die Gefäßwände sind mit einer aktiven Zellmonoschicht

aus Endothelzellen ausgekleidet, so daß Wechselwirkungen mit der Gefäßwand und

dem Endothelium gleichzusetzen sind.

So ist die Anreicherung von aktivierten Leukozyten

an lokalen Entzündungsherden ohne

die Adhäsion an Endothelzellen unmöglich.

Tumorzellen finden im vaskulären System

eine ungewollte Infrastruktur für die Metastasierung,

wobei das Endothelium in diesem

Fall als natürliche Barriere dient.

Blutbestandteile werden in der Blutbahn

relativ zur Endothelzelloberfläche durch

den Blutstrom bewegt. Diese Bewegung hat

zum Beispiel entscheidenden Einfluß auf

die Interaktion zwischen Endothelium und

Blutzellen und unterscheidet sich grundlegend

von der Interaktion zwischen relativ

zueinander ruhenden Zelloberflächen. So

beginnen einige Blutzellen, die Bindungsrezeptoren

für Endothelzellen präsentieren,

die Adhäsion mit einem leichten Kontakt,

bei dem die Zellen vom Blutstrom entlang

der Oberfläche gerollt werden. Diesen

Vorgang bezeichnet man als „rolling“ 1 . In

dem Moment, in dem die Zelle zur Ruhe

kommt, spricht man von sticking und

Adhäsion.

Es kann davon ausgegangen werden, daß der

Kontakt zwischen Zelle und Endothelium

durch den Fluß – und damit die Scherkraft –

des Blutes im Blutgefäß maßgeblich beeinflußt

wird. So ist naheliegend, daß für die Anhaftung

einer kleinen Kugel unter Flußbedingungen

stärkere Adhäsionskräfte nötig sind, als für die

Anhaftung einer Kugel, die in einer Petrischale

auf der Adhäsionsoberflächefläche ruht. Aber

auch gegenteilige Effekte wurden beobachtet.

So zeigten Burdick und Konstantopoulos, daß

Tumorzellen in Anwesenheit von Blutplättchen

unter Fluß deutlich besser am Endothelium

adhärieren als unter statischen Bedingungen 2 .

Eine andere Gruppe zeigte, daß flußinduzierte

Rotation von Leukozyten am Endothelium die

schwachen Bindungen in feste Verankerungen

umwandelt 3 .

Interaktionsstudien

Bisher werden Interaktionen zwischen Endothelium

und Substanzen oder anderen Zellen

meist in Petrischalen durchgeführt, die von

Tab. 1: Zusammenstellung typischer Werte für einige humane Gefäßtypen 5 .

Gefäß Mittlerer Mittlerer Fluß Scherkraft in [dyn/cm 2 ] Fluß zur

Gefäßradius in [ml/min] Simulation im

in [cm] µ-Slide I in

Im Mittel maximal [ml/min]

Aorta 1,25 5890 - > 15 12

Arterie 0,2 60,32 - 5 - 10 4 - 8

Kleine Vene 0,1 1,88 0,40 - 0,32

Mittlere Vene 0,25 58,90 0,80 - 0,64

Tab. 2: Auswirkung von angelegtem Fluß auf das Zellwachstum von HUVEC im Kanal des

µ-Slide I. + bezeichnet gutes Zellwachstum. Auf Collagen IV und Fibronectin lösen sich die Zellen

selbst unter dem leichtesten Fluß von der Oberfläche ab (–). Auf der plasmabehandelten Oberfläche

proliferieren die Zellen unter Fluß besser als im statischen Fall.

Statisch 0,5 ml/min 1 ml/min 5 ml/min

Scherkraft 0 0,6 dyn/cm 2 1,3 dyn/cm 2 6,3 dyn/cm 2

Collagen IV + - - -

Fibronectin + - - -

Plasma + + + +

34 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


Abb. 1: Schematische Darstellung von Flußprofilen in runden und rechteckigen Kanälen. In beiden

Fällen resultiert ein parabolisches Flußprofil, wobei dies im rechteckigen Kanalquerschnitt

nur für die vertikale Richtung gilt. In horizontaler Richtung ist das Flußprofil, abgesehen von

Randeffekten, konstant.

Abb. 2: Phasenkontrastaufnahmen von HUVEC auf der Plasmaoberfläche nach 24 Stunden

unter Fluß von 5 ml/min (A) im Vergleich zu einer statischen Kultur (B), ebenfalls im Kanal des

µ-Slide I. Unter Flußbedingungen sind die Zellen nach gleicher Zeit etwas dichter gewachsen. In

beiden Fällen zeigen die HUVEC die für sie unter Zellkulturbedingungen typische Morphologie.

der Geometrie her jedoch keine Rückschlüsse

auf ein Gefäßsystem und zusätzlich keine

optimale optische Auswertung der Vorgänge

zulassen. Dabei bieten aber gerade neueste

Entwicklungen der Fluoreszenzmethoden

und der konfokalen Mikroskopie optimale

Möglichkeiten der Analyse von Prozessen in

lebenden Zellen.

Hier beschreiben wir ein biomimetisches

System zur Simulation von Blutgefäßen, das

auf einmalverwendbaren Kunststoff-Flußkammern

basiert. Es ermöglicht, Endothelzellen

unter einstellbaren Flußbedingungen

zu kultivieren und hochauflösend zu mikroskopieren.

Im Gegensatz zum runden

Querschnitt natürlicher Blutgefäße, ist für

mikroskopische Anwendungen ein rechtekkiger

Querschnitt vorteilhaft. Entsprechende

Flußkammern sind bereits in der Literatur

beschrieben und wurden erfolgreich für

entsprechende Experimente eingesetzt 4 .

Allerdings mit dem Nachteil, daß die meist

in Handarbeit hergestellten Kammern aus

verschiedenen Kunststoff-, Metallteilen und

Deckgläschen zusammengesetzt werden und

entsprechend kompliziert in der Handhabung

sind, zum Beispiel bei der Reinigung.

Die Kraft, die auf die Zelle entlang der

Oberfläche wirkt, ist die sogenannte Scherkraft.

Die Bodenfläche des rechteckigen

Kanals ist vergleichbar mit einem der Länge

nach aufgeschnittenen Blutgefäß, das aufgerollt

wurde (Abb. 1). Da Blutgefäße typischerweise

rund sind, hängt die Scherkraft

ausschließlich vom Durchmesser des Gefäßes

ab. Im Falle des rechteckigen Kanals, der

wesentlich breiter als hoch ist, beeinflußt lediglich

die Höhe, also der Abstand zwischen

Boden und Decke des Kanals, die Scherkraft

an der Oberfläche. Der Einfluß der unterschiedlichen

Geometrien ist in Abbildung 1

schematisch dargestellt.

Die Gefäßdurchmesser beim Menschen variieren

zwischen 2 bis 2,5 cm für Hohlvenen und

die abdominale Aorta und wenigen µm im Fall

der kleinsten Kapillaren. Ebenso unterscheiden

sich die Flußraten und die Flußcharakteristika.

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BERTHOLD TECHNOLOGIES GmbH & Co. KG


Kennziffer 25 LW 01 · www.biocom.de P.O. Box 100 163

75312 Bad Wildbad, Germany

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LABORWELT E-mail:Bio@Berthold.com

6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 35

Internet:www.Berthold.com/Bio


In der Aorta erzeugt das Herz einen stark gepulsten

Fluß, der zu maximalen Scherkräften

von über 15 dyn/cm² für etwa 0,2 Sekunden

führt. In den Venen dagegen ist der Einfluß

des Pulses stark abgeschwächt und muskuläre

Kontraktionen dienen im Zusammenspiel

mit den Venenklappen zum Bluttransport.

Als Folge sind in mittleren Venen mit einem

Radius von 0,25 cm vergleichsweise konstante

Scherkräfte von etwa 0,8 bis 1 dyn/cm² zu

beobachten. In Tabelle 1 sind charakteristische

Werte für einige humane Gefäßtypen

zusammengestellt.

Zellen, die unter Flußbedingungen untersucht

werden, müssen stabil an der Oberfläche

adhärieren, da sie durch den Fluß bzw.

die dadurch verursachte Scherkraft von der

Oberfläche heruntergezogen werden. Die

Stabilität der Adhäsion hängt vor allem von

der Oberflächenbeschichtung ab.

In der vorliegenden Arbeit wurden alle

Experimente im µ-Slide I, ibidi, durchgeführt.

Der Flußkanal ist 50mm lang, 5 mm breit

und 0,4 mm hoch. Der Boden des µ-Slide I

eignet sich zur Untersuchung mittels hochauflösender

Mikroskopie mit inversen Mikroskopen.

In der rechten Spalte von Tabelle 1

sind die Flußraten dargestellt, mit denen die

Scherkräfte in den entsprechenden Gefäßen

simuliert werden können.

Die Adhäsionsstabilität von HUVECS

wurde bei verschiedenen Flüssen auf drei

verschiedenen Oberflächen untersucht. Dabei

handelt es sich um Biopolymerbeschichtungen

mit Collagen IV und Fibronectin sowie

um eine physikalische Oberflächenbehandlung

mit Niederdruckplasma.

3x10 4 Zellen wurden in den vorbeschichteten

Kanal des µ-Slide I befüllt und für 2 Stunden

ohne Fluß inkubiert. Danach wurde das Slide

mit dem µ-Slide I Flow through kit (ibidi) mit

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einer Peristaltikpumpe (Ismatec, Deutschland)

verbunden. Der Zustand der Zellen wurde im

Anschluß nach zwei Stunden und dann im

Abstand von 24 Stunden mittels Phasenkontrastmikroskopie

hinsichtlich Zellzahl und

Zellmorphologie bestimmt. Als Referenzmessung

dienten gleichzeitig entsprechende Experimente

unter statischen Bedingungen.

Die Ergebnisse des Zellwachstums unter

verschiedenen Flußraten sind in Tabelle 2

zusammengefaßt. Auf allen drei getesteten

Oberflächen zeigten die Zellen unter

statischen Kultivierungsbedingungen das

erwartete Verhalten bezüglich Proliferation

und Morphologie.

Ebenfalls auf allen drei Oberflächen hafteten

die Zellen unter Flußbedingungen

bis zu zwei Stunden fest an. 24 Stunden

nach Anlegen des Flusses fanden wir keine

Zellen mehr auf den polymerbeschichteten

Oberflächen – unabhängig von der angelegten

Flußrate. Auf der plasmabehandelten

Oberfläche dagegen war das Zellwachstum

unter Flußbedingungen über drei Tage

stabil. Tatsächlich entwickelte sich die HU-

VEC-Kultur unter Flußbedingungen bezüglich

der Zellzahl besser als im statistischen

Vergleichsexperiment. Interessant ist auch,

daß die Zellen selbst bei dem höchsten angelegten

Fluß von 5 ml/min also bei einer

Scherkraft von 6,2 dyn/cm² stabil an der

Oberfläche adhärierten.

Die Instabilität der Zellen auf den Polymerbeschichtungen

gegenüber leichtestem

Fluß überrascht, insbesondere da über kurze

Zeiten die Zellen auch auf diesen Oberflächen

Scherkräften von bis zu 30 dyn/cm 2

standhielten. Die Frage bleibt offen, was

zum Ablösen der Zellen führt. Im Falle

der plasmafunktionalisierten Oberflächen

adhärieren die Zellen stabil genug, um

Flußexperimente durchzuführen, die sogar

Scherkräfte im gepulsten Fluß der Aorta

imitieren.

Die hier vorgestellten Flußkammern sollen

die Arbeit bei Flußexperimenten erleichtern,

und aufwendige Reinigungsschritte vor dem

Zusammenbau etwa einer selbstgebauten

Lösung ersparen. Die geringen Kosten der

Abb. 3: Das µ-Slide I (links) ermöglicht mikroskopische Untersuchungen unter Flußbedingungen. µ-Slide y-shaped (rechts) erlaubt zusätzlich Untersuchungen

an Kanalgabelungen, die zu Inhomogenitäten im Fluß führen.

einmalverwendbaren µ-Slides ermöglichen

es, mehrere Flußexperimente parallel zueinander

durchzuführen, was einige Ergebnisse

besser miteinander vergleichbar machen sollte.

Die Verwendung von Kunststoff ermöglicht

auch komplexere Formen herzustellen,

für die das bereits bestehende µ-Slide yshaped

ein Beispiel ist. Je nach Fließrichtung

kann darin der Einfluß eines inhomogenen

Strömungsfeldes unter verschiedenen Gabelungswinkeln

(Abb. 3) auf das verwendete

System untersucht werden.

Literatur

[1] Atherton, A., Born, G. V., J. Physiol. 231 (1973), 35-36.

[2] Burdick, MM., Konstantopoulos, K., Am J Physiol Cell Physiol. 287(2) C

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[3] Dwir, O., Solomon A., Mangan S., Kansas G.S., Schwarz U.S., Alon R. J Cell

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[4] Rainger, G.E., Stone, P., Morland, C.M., Nash, G.B., J Immun Methods 255

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[5] Witzleb, E., Funktionen des Gefäßsystems, in SCHMIDT R.F., THEWS G.

(Hrsg.), Physiologie des Menschen, Springer, Berlin, New York (1990).

Korrespondenzadresse

Dr. Roman Zantl

ibidi GmbH

Schellingstr. 4

D-80799 München

Tel.: +49-(0)89-2180-6419

Fax: +49-(0)89-2180-13539

eMail: rzantl@ibidi.de

www.ibidi.de

36 | 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 LABORWELT


LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 1/2005 | 39

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Marktübersicht: Equipment für die Zellkultur

Zellkulturverfahren zählen zu den Basismethoden der zellbiologischen Grundlagenforschung, bei der Entwicklung und Produktion von Biophar-

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