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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

86 eluierte Stoffmenge

86 eluierte Stoffmenge pro Fraktion METHODEN Elutionsvolumen Abbildung 3-13 Typisches Elutionsprofil einer Substanz in liposomaler Zubereitung nach Größenausschlusschromatographie. Im linken Peak, bei geringem Elutionsvolumen, erscheint die liposomal verkapselte Substanz, im rechten Peak der unverkapselte Anteil. Trennt man unverkapselte Substanz mittels SEC ab und isoliert die Liposomenfraktion, so entsteht ein Konzentrationsgradient zwischen intra- und extraliposomalem Kompartiment. Die verkapselte Substanz permeiert anschließend bis zum Konzentrationsausgleich durch die Vesikelwand in den Extraliposomalraum. Zu definierten Zeitpunkten werden Proben entnommen und der verkapselte Anteil wird mittels SEC bestimmt. Trägt man den verkapselten Anteil gegen die Zeit auf, so erhält man die Permeationskinetik der entsprechenden Substanz durch die liposomale Membran (Abbildung 3-14). In aller Regel folgt diese einer Kinetik erster Ordnung (Kapitel 1.3.3). Nach Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten k dieser Kinetik kann der Permeationskoeffizient P nach Gleichung 1.15 ermittelt werden. Zur Quantifizierung wird eine sehr empfindliche Methode benötigt, da die Probe bei jedem SEC-Schritt circa 5-fach verdünnt wird. Zudem liegt die Verkapselungseffizienz im ersten Schritt unter üblichen Bedingungen nur im einstelligen Prozentbereich. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Quantifizierung ausschließlich mit HPLC-Methoden.

verkapselter Anteil METHODEN 87 Zeit Abbildung 3-14 Abnahme des liposomal verkapselten Anteils im Verlauf der Zeit (off-Kinetik) Durchführung: Zunächst wurde ein Lipidfilm nach der Filmmethode (Kapitel 3.1.1) hergestellt (25 mM EPC). Dieser wurde in einer 100 mM, gepufferten (Phosphatpuffer 5 mM, pH 7,4 bzw. HEPES-Puffer 10 mM, pH 7,4) Co- Monomerenlösung homogenisiert. dispergiert und mittels Extrusionstechnik (Kapitel 3.1.2) Die Abtrennung der freien von den liposomal verkapselten Monomeren erfolgte über Sepharose CL-4B ® . Die Füllhöhe der Säule betrug 17 cm, bei einem Innendurchmesser von 1,0 cm. Frisch gegossenes Gelmaterial wurde zunächst für einige Stunden mit mobiler Phase konditioniert und anschließend durch mehrfache Aufgabe von Leerliposomen mit Lipiden gesättigt. Als mobile Phase diente entgaster, sterilfiltrierter Puffer, dessen Osmolarität durch Zusatz von NaCl jeweils an das intraliposomale Kompartiment angepasst wurde. Das Gelbett wurde vorsichtig mit 50 bis 200 µl der liposomalen Zubereitung überschichtet. Unmittelbar nach vollständigem Eindringen der Probe in das Gel wurde mit Puffer überschichtet. Die Flussrate der mobilen Phase wurde auf konstante 1 ml pro Minute eingestellt (Kolbenhubpumpe P-500, Pharmacia Biotech). Das Eluat wurde in einem Fraktionensammler in geeigneten Fraktionsgrößen (0,3 - 1,5 ml) aufgefangen.

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