88 METHODEN Jede

88 METHODEN Jede Fraktion (f) wurde gewogen und die Monomerkonzentration (cf) mittels HPLC bestimmt (Kapitel 3.4.1). Die prozentuale Menge an Monomer in jeder Fraktion (yf) wurde mit den Gleichungen 3.9 und 3.10 berechnet und gegen das Elutionsvolumen aufgetragen (Abbildung 3-13). Liposomenhaltige Fraktionen wurden zunächst durch Bestimmung des Lipidgehalts mittels Bartlett-Essay ermittelt. Da der Lipidgehalt mit der sichtbaren Trübung korrelierte, konnte in den folgenden Versuchen auf die Bestimmung des Lipidgehalts verzichtet werden. Die Verkapselungseffizienz wurde durch Summieren der prozentualen Mengen an Monomer (yf) aller Liposomenfraktionen berechnet. Eine Bilanzierung erfolgte durch Vergleich der aufgegebenen mit der über alle Fraktionen eluierten Menge an Co-Monomeren (Wiederfindungsrate). Der Versuch wurde ausgewertet, wenn die Wiederfindungsrate im Bereich von 97 % bis 103 % lag. Wiederfindungsraten über 100% sind theoretisch nicht möglich, lassen sich jedoch mit geringen Ungenauigkeiten beim Pipettieren bzw. kleinen Fehlern bei der Quantifizierung erklären. n c ⋅V f = f f nf = Stoffmenge Monomer in Fraktion f [mol] cf = Monomerkonzentration in Fraktion f [mol·l -1 ] Vf = Volumen der Fraktion f [l] Gleichung 3.11 nf y f = ⋅100% Gleichung 3.12 n ∑ f yf = in Fraktion f eluierter Anteil des Monomers [%]

3.5.2 Gelzentrifugation METHODEN 89 Messprinzip: Die Gelzentrifugation beruht auf dem Prinzip der SEC. Die Trennung von liposomal verkapselter und unverkapselter Substanz wird stark beschleunigt, was die Bestimmung von schnellen Permeationsprozessen (t1/2 ≥ ca. 10 s.) ermöglicht. Der grundlegende Unterschied zur herkömmlichen SEC besteht darin, dass sich die Trennsäule in einer Zentrifuge befindet und die aufgegebene Liposomendispersion durch Zentrifugalkräfte beschleunigt durch das Gelbett gedrückt wird. Da während der Zentrifugation keine weitere mobile Phase auf die Säule gelangt, wird bei richtiger Validierung des Systems (g-Zahl, Zentrifugationszeit) nur ein Teil der Liposomenfraktion eluiert, wohingegen der unverkapselte, niedermolekulare Anteil auf der Säule verbleibt. Die Abtrennung des unverkapselten Anteils gelingt auf diese Weise innerhalb weniger Sekunden (Kimpfler 2003). Da die Liposomen während der kurzen Zetrifugationszeit nicht vollständig eluieren, wird der Quotient Stoff/Lipid - beispielsweise durch radioaktive Doppelmarkierung - vor Probenaufgabe und im Eluat ermittelt. Aus dem Quotienten kann anschließend die jeweilige Verkapselungseffizienz berechnet werden. Die Bestimmung der Permeationskinetik folgt weitgehend dem unter 3.5.1 beschriebenen Vorgehen. unverkapselter Anteil liposomal verkapselter Anteil Abbildung 3-15 Abtrennung des unverkapselten Anteils mittels Gelzentrifugation; Links: ein mit Gel gefülltes Bond-Elut Säulchen wird in einem Zentrifugenglas fixiert. Rechts: nach Probenaufgabe und Zentrifugation wird die Liposomenfraktion mitsamt verkapseltem Inhalt im Zentrifugenröhrchen aufgefangen. Der unverkapselte Anteil niedermolekularer Substanz verbleibt auf der Säule.