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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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90 METHODEN

90 METHODEN Durchführung: Die liposomalen Zubereitungen wurden mittels Detergensdialyse, Extrusion sowie bei der Untersuchung von PEG 400 MMEMMA mittels Phasenumkehr durch Lösungsmittelverdampfung (Kapitel 3.1.4) hergestellt. Die Co- Monomerkonzentration in der Zubereitung wurde auf 200 mM eingestellt. Die Abtrennung der freien von den liposomal verkapselten Co-Monomeren erfolgte mittels Gelzentrifugation über Sephadex G50 fine befüllte 5 ml Bond Elut Säulchen. Das Gelmaterial wurde in HEPES-Puffer suspendiert (7 % m/m), für 14 Stunden quellen gelassen und zuletzt durch schonendes Rühren mit einem Radrührmagnet bei 50 mbar entgast. Die Trennsäulchen wurden mit dieser Suspension vollständig befüllt, in 10 ml Zentrifugenröhrchen gestellt und für 5 Sekunden bei 50 x g (580 U/min, Zentrifuge Universal 32, Rotor 1624/1369 Hettich) zentrifugiert. Das komprimierte Gelbett wurde mit 7 %iger Gelsuspension aufgefüllt. Nach erneutem Zentrifugieren, für 40 Sekunden bei 50 x g, war die Säule für die Probenaufgabe vorbereitet. Der in beiden Zentrifugationsschritten eluierte Puffer wurde verworfen. Nach Aufbringen von 100 µl Liposomendispersion auf die vorbereitete Säule wurde für 30 Sekunden bei 500 x g zentrifugiert. Zur Kontrolle, wie viel unverkapseltes Monomer die Säule passieren konnte, wurde parallel zu jeder Liposomenaufgabe auf einem zweiten Säulchen eine liposomenfreie Co-Monomerlösung gleicher Konzentration aufgegeben. Im Gelbett wurde neben dem gesamten freien Monomer auch ein Teil des liposomal verkapselten Monomers zurückgehalten. Durch Gelzentrifugation erfolgte eine Verdünnung der Proben um Faktor 5 bis 6. Der Monomergehalt im Eluat wurde mittels HPLC (Kapitel 3.4.1), der Lipidgehalt mittels Bartlett-Essay (Kapitel 3.3.1), bestimmt. 3.5.3 Gleichgewichtsdialyse Messprinzip: Die zur Herstellung von Liposomen verwendeten Lipide stören in einigen Fällen die Analytik auf freigesetzte (bzw. verkapselte) Substanzen. Liposomen können aufgrund ihrer Abmessungen Dialysemembranen mit einem cutoff von 10 kDa nicht passieren. Aus diesem Grund erscheint bei der Dialyse nur die freigesetzte Substanz, nicht aber das störende Membranlipid im Akzeptormedium. Der Versuchsaufbau ist schematisch in Abbildung 3-16 dargestellt.

D A P Dialysekammer METHODEN 91 Abbildung 3-16: Schematischer Versuchsaufbau zur Bestimmung von Permeationskoeffizienten mittels Dialyseapparatur; Im Probenentnahmegefäß (P) sowie auf Donor- (D) und Akzeptorseite (A) der Dialysekammer wird mittels Magnetrührer eine gleichmäßige Verteilung der Substanz gewährleistet. Der Freisetzungsversuch kann unter Luft- und Lichtausschluss erfolgen um eine mögliche Zersetzung reaktiver Substanzen (z.B. Methacrylat-Monomere) zu vermeiden. Das Akzeptormedium wird mittels Schlauchpumpe umgewälzt. Vor Dialysebeginn wird der unverkapselte Anteil an Substanz gelchromatographisch abgetrennt und die Liposomenfraktion in das Donorkompartiment der Dialysezelle überführt. Die liposomal verkapselte Substanz kann aufgrund der Liposomengröße die Dialysemembran nicht passieren. Verlassen niedermolekulare Substanzen durch Permeation den liposomalen Innenraum, so diffundieren sie anschließend nahezu ungehindert durch die Dialysemembran ins Akzeptorkompartiment und können im Probenentnahmegefäß nachgewiesen werden. Liposomal verkapselte Moleküle müssen zwei Barrieren überwinden, ehe sie mit der Halbwertszeit t1/2 (gesamt) im Akzeptorkompartiment erscheinen. Zunächst wird die Lipidmembran durch Permeation überwunden. Die Permeationshalbwertszeit t1/2 (lipid) SP P Probenentnahmegefäß D Donorseite mit Liposomen A Akzeptorseite P Probenentnahmegefäß SP Schlauchpumpe

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