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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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92 METHODEN dieses

92 METHODEN dieses Teilprozesses soll letztlich ermittelt werden. Die zweite Barriere ist der Durchtritt durch die Dialysemembran. Unverkapselte Moleküle erscheinen unter den gewählten Bedingungen, einer Kinetik erster Ordnung folgend, mit der Halbwertszeit t1/2 (frei) im Akzeptormedium. t1/2 (frei) ist in einem Vorversuch zu ermitteln. Entscheidend für die Durchführbarkeit der Methode ist, dass der Durchtritt des verkapselten Moleküls durch die Lipidmembran geschwindigkeitsbestimmend ist. Langsame Permeationsprozesse durch liposomale Membranen mit Halbwertszeiten im Bereich einiger Stunden lassen sich mit dieser Methode zuverlässig bestimmen. Durchführung: Die Dialysemembran, mit einem cutoff von 10 kDa (very high permeability, Diachema), war durchlässig für freigesetzte Monomermoleküle, hielt gleichzeitig aber Liposomen im Donorkompartiment zurück. Zur Bestimmung der Permeationsgeschwindigkeiten der Monomere SEMA und DMAGS wurden 95 mM SEMA, bzw. 30 mM DMAGS in Liposomen verkapselt. Vor Dialysebeginn wurde der unverkapselte Anteil an Co-Monomer gelchromatographisch abgetrennt und die Liposomenfraktion in das 2,4 ml fassende Donorkompartiment der Dialysezelle überführt. Durch die gelchromatographische Abtrennung der unverkapselten Substanz wurde die liposomale Zubereitung verdünnt, sodass die Lipidkonzentration im Donorkompartiment bei ca. 5 mM lag. Im Probenentnahmegefäß sowie auf Donor- (D) und Akzeptorseite (A) der Dialysekammer wurde durch Einsatz eines Magnetrührers (100 U/min) eine gleichmäßige Verteilung der Co-Monomeren gewährleistet. Der Freisetzungsversuch erfolgte unter Luft- und Lichtausschluss, um eine mögliche Zersetzung reaktiver Methacrylat-Monomere zu vermeiden. Das Akzeptormedium wurde durch eine Schlauchpumpe mit einer Flussrate von 8,8 ml/min umgewälzt. Im Akzeptormedium wurde durch Zusatz von NaCl die Tonizität des Intraliposomalraums eingestellt. Das Volumen des Akzeptorkompartiments (incl. Probenentnahmegefäß) wurde mit 20 ml ausreichend groß gewählt, um eine störende Verringerung des Volumens durch Entnahme geringer Probenmengen zu vermeiden. Unverkapselte Moleküle erschienen unter den gewählten Bedingungen, einer Kinetik 1. Ordnung folgend, mit der Halbwertszeit t1/2 (frei) im Akzeptormedium. Die Halbwertszeiten für unverkapseltes SEMA und DMAGS wurde jeweils im Vorversuch ermittelt. Liposomal verkapselte Monomere erschienen mit einer Halbwertszeit t1/2 (gesamt) im Akzeptorkompartiment. Ist t1/2 (gesamt) sehr viel größer als t1/2 (frei), dann ist

METHODEN 93 die Permeationshalbwertszeit durch die Lipidmembran t1/2 (lipid) geschwindigkeitsbestimmend und es gilt näherungsweise: t1/2(lipid) ≈ t1/2(gesamt) Gleichung 3.13 t1/2 (lipid) Permeationshalbwertszeit durch die Lipidmembran [s] t1/2 (gesamt) Halbwertszeit, mit der verkapselte Co-Monomere im Akzeptorkompartiment erscheinen [s] Aus t1/2 (lipid) errechnet sich die Geschwindigkeitskonstante k der zugrunde liegenden Kinetik erster Ordnung nach Gleichung 3.14. ln 2 k = Gleichung 3.14 t 1/2(lipid) k Geschwindigkeitskonstante des Permeationsprozesses 1. Ordnung [s -1 ] 3.5.4 PFG-NMR Das Messprinzip der PFG-NMR ist Gegenstand von Kapitel 1.3.1. Durchführung: Mittels PFG-NMR wurde das Permeationsverhalten der Co-Monomere TEGDM und PEG 400 MMEMMA bestimmt. Mit der Methode der Detergensdialyse (Kapitel 3.1.3) wurden jeweils 1,5 ml einer Liposomendispersion (25 mM EPC in 100 mM Phosphatpuffer pH 7,4) hergestellt. Anschließend wurden 60 mg PEG 400 MMEMMA in den 3,0 ml gelöst und für ca. 3 Tage gelagert. Das Vernetzer- Molekül TEGDM konnte in dieser Konzentration nicht gelöst werden, also wurde eine mit TEGDM gesättigte Liposomendispersion hergestellt und ebenfalls für ca. 3 Tage gelagert. Zur eigentlichen Messung wurden 750 µl der Monomer-haltigen Liposomendispersionen in ein Standard-NMR-Röhrchen überführt. Die PFG-NMR-

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