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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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94 METHODEN

94 METHODEN Untersuchungen erfolgten mit einem Avance 400 MHz NMR-Spektrometer der Firma Bruker-BioSpin GmbH, ausgestattet mit einem Diff30-Probenkopf, active shielding und Wasserkühlung (zur Vermeidung von Konvektion in der Probe). Als Gradientenverstärker kam ein B-AFPA-40 der Firma Bruker-BioSpin GmbH zu Einsatz. Es wurde jeweils ein Stimulated-Echo Experiment mit entsprechenden Gradientenpulsen durchgeführt (G = 0-4 Tesla/m, 32 steps, δ = 1,2 ms, 16 scans Δ = 50 ms - 300 ms,). Die erhaltenen Spektren wurden mit Hilfe der NMR-Software X-WIN-NMR bzw. Top-Spin ausgewertet. Die zeitaufgelösten PFG-NMR Messungen wurden von Frau Dipl.-Chem. Alina Leson, Arbeitskreis Prof. C. Mayer am Institut für Physikalische Chemie der Universität Duisburg-Essen durchgeführt. 3.5.5 Untersuchung von Membranschäden durch Co-Monomere Messprinzip der HPTS/DPX-Freisetzungsuntersuchungen: Der Fluoreszenzmarker HPTS und sein Quencher DPX werden in EPC- Liposomen verkapselt und der unverkapselte Anteil abgetrennt. Aufgrund der räumlichen Nähe von HPTS zum Quencher DPX im intraliposomalen Kompartiment ist im verkapselten Zustand nur eine geringe Fluoreszenzintensität messbar. Wird durch Zusatz von Monomerenlösung die liposomale Membran geschädigt, so können HPTS und DPX aus den Liopsomen austreten. Durch die Verdünnung im Extraliposomalraum verliert DPX an quenchender Wirkung, was eine Zunahme der Fluoreszenzintensität von HPTS zur Folge hat. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität ist ein direktes Maß für die Menge an freigesetztem HPTS. Verfolgt man die Fluoreszenz nach Monomerzugabe über einen definierten Zeitraum, so korreliert die Fluoreszenzzunahme mit dem Maß der Membranschädigung.

NaO 3 S NaO 3 S OH SO 3 Na METHODEN 95 N + Br - Abbildung 3-17 Struktur des Fluoreszenzfarbstoff HPTS (8-Hydroxypyren-1,3,6trisulfonsäure, links) und des Quencher DPX (p-Xylenbispyridiniumbromid, rechts). Beide Substanzen zeichnen sich durch eine sehr gute Wasserlöslichkeit aus und können aufgrund ihrer hohen Polarität und Ladung intakte Lipidmembranen nur sehr langsam permeieren. Durchführung: HPTS und DPX wurden nach der Literatur (van Bambeke et al. 2000) in den Konzentrationen 31,8 mM HPTS und 35,0 mM DPX verwendet. Beide Substanzen wurden in nicht-isotonisiertem 10 mM HEPES-Puffer gelöst und der pH- Wert auf 7,40 eingestellt. Mittels Filmmethode (Kapitel 3.1.1) wurde ein Lipidfilm aus reinem EPC hergestellt, in der vorbereiteten HPTS/DPX-Farbstofflösung dispergiert und drei Frier-Tau-Zyklen unterworfen. Die Lipidkonzentration der Dispersion betrug 30 mM. Anschließend folgten 21 Extrusionsschritte (Kapitel 3.1.2) durch eine Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 200 nm. Der unverkapselte Anteil an HPTS und DPX wurde mittels Größenausschlusschromatographie über Sepharose CL-4B abgetrennt. Als mobile Phase wurde 10 mM HEPES-Puffer pH 7,4 verwendet, dessen Osmolarität durch 232,2 mM Glucose dem Intraliposomalraum angeglichen wurde (im Folgenden als „isotoner“ HEPES-Puffer bezeichnet) Die Osmolarität des Intraliposomalraums, die im Wesentlichen durch 31,8 mM HPTS und 35,0 mM DPX verursacht wurde, betrug unter Berücksichtigung des jeweiligen Van´t Hoff- Faktors rechnerisch 232,2 mosmol/l. Die HEPES-Konzentration von 10 mM wurde bei der Berechnung vernachlässigt, da sie in gleicher Weise intra- wie extraliposomal vorkommt und nicht zur Osmolaritätsdifferenz beiträgt. Zur Isotonisierung des Puffers wurde Glucose statt NaCl verwendet, da NaCl in Vorversuchen einen fluoreszenzmindernden Effekt auf HPTS hatte. Eine HPTS/DPX-Freisetzung aufgrund unterschiedlicher osmotischer Drücke in Intra- und Extraliposomalraum während der Größenausschluss- N + Br -

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