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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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96 METHODEN

96 METHODEN chomatographie und der Fluoreszenzmessung, konnte durch Isotonisierung der mobilen Phase vermieden werden (siehe dazu auch Kapitel 4.1.5). Die Liposomenfraktion wurde anschließend mit isotonem HEPES-Puffer ca. 1:20 verdünnt, so dass die maximale Fluoreszenzintensität nach Versuchsdurchführung möglichst nah an den Wert 1000 heranreichte, diesen aber keinesfalls überstieg. Da die Fluoreszenzintensität von HPTS abhängig vom pH-Wert und der Temperatur der wässrigen Lösung ist, wurden alle Versuche in HEPES-Puffer bei einem pH-Wert von 7,40 und 25,0 ±1,0 °C Probentemperatur durchgeführt. Es wurde darauf geachtet, dass sich der intra- und extraliposomale pH-Wert nicht unterschieden. Herstellung der Monomerenlösungen: TEGDM: Der membranschädigende Einfluss von TEGDM wurde im Konzentrationsbereich von 0,5 mM bis 40 mM untersucht. Zunächst wurden Lösungen von TEGDM in Ethanol mit Konzentrationen von 760 mM, 380 mM, 190 mM, 95 mM, 38 mM, 19 mM sowie 9,5 mM hergestellt. Die Herstellung der TEGDM-Lösungen erfolgte in Ethanol, da die Löslichkeit von TEGDM in Wasser zu gering ist. Die TEGDM-Konzentrationen in der Messküvette lagen nach Verdünnung von 1:19 demnach bei 40 mM, 20 mM, 10 mM, 5 mM, 2 mM, 1 mM und 0,5 mM. DMAGS: Der membranschädigende Einfluss von DMAGS wurde im Konzentrationsbereich von 0,5 mM bis 10 mM untersucht. Dazu wurden Lösungen von DMAGS in Millipore® Wasser mit Konzentrationen von 190 mM, 95 mM, 38 mM, 19 mM sowie 9,5 mM hergestellt. Die DMAGS-Konzentrationen in der Messküvette lagen nach Verdünnung von 1:19 bei 10 mM, 5 mM, 2 mM, 1 mM und 0,5 mM. SEMA und PEG 400 MMEMMA: Mögliche Membranschäden durch SEMA bzw. PEG 400 MMEMMA wurden bei den Konzentrationen von 10 mM und 100 mM untersucht. Dazu wurden Lösungen des jeweiligen Monomers in Millipore ® Wasser mit Konzentrationen von 480 mM und 48 mM hergestellt, die nach 4,8-facher Verdünnung in der Messküvette die gewünschten Konzentrationen ergaben. Durchführung der Fluoreszenz-Messung: Die Messung erfolgte in einer auf 25 °C temperierten und permanent gerührten Küvette. Es wurden jeweils 1700 μl (bei TEGDM und DMAGS) bzw. 1800 µl (bei PEG 400 MMEMMA und SEMA) isotonisierter HEPES-Puffer vorgelegt und 100 μl (bei TEGDM und DMAGS) bzw. 500µl (bei PEG 400 MMEMMA und SEMA) der jeweiligen Monomeren-Lösung

METHODEN 97 hinzugegeben. Anschließend wurde zwei Minuten bis zum Temperaturausgleich gewartet und 100 μl der verdünnten Liposomenfraktion hinzupipettiert Die Erfassung der Fluoreszenzintensität erfolgte im Time-Drive Modus. Während der anschließenden Zeitspanne wurde beobachtet, ob die Fluoreszenzintensität aufgrund von Membrandefekten zunahm. Nach weiteren 400 bis 600 Sekunden wurden die Liposomen durch Zusatz von 100 μl einer 1 %igen (m/m) Triton X-100 Lösung in HEPES-Puffer zerstört, um die Fluoreszenzintensität bei 100 % Freisetzung zu ermitteln. Die erhaltenen Freisetzungskurven wurden in Excel normiert, indem die höchste, nach Triton X-100 Zugabe aufgetretene, Fluoreszenzintensität jeder Messung als 100 % gesetzt wurde. Der ab Liposomenzugabe bis unmittelbar vor Zerstörung der Liposomen mittels Triton freigesetzte prozentuale Anteil wurde ausgewertet. Die leichte Eigenfluoreszenz der Monomere SEMA und DMAGS wurde in die Berechnung einbezogen. Die Untersuchungen an TEGDM und DMAGS wurden von Herrn Christian Widua im Rahmen eines Mitarbeiterpraktikums durchgeführt. Als Fluoreszenzspektrometer kam ein Perkin Elmer LS 50 B mit Software FL WinLab Version 4.00.02 zum Einsatz. Die Anregungswellenlänge wurde auf 403 nm, die Emissionswellenlänge auf 510 nm eingestellt (Spaltbreiten der Blenden: Exc. 5 nm, Em. 5 nm). Die Probe wurde in einer thermostatisierbaren Küvettenhalterung mittels Wasserzirkulation auf 25 ± 1,0 °C temperiert und mit einem Magnetrührer (Stufe high) während der Messung durchmischt. 3.5.6 Auswirkung eines Osmolaritätsgradienten auf die Freisetzung liposomal verkapselter Substanzen Messprinzip: Die Freisetzung verkapselter Substanz wurde fluorimetrisch, unter Verwendung des Fluoreszenzmarkers HPTS und seinem Quencher DPX als Modelsubstanzen (siehe Kapitel 3.5.5), erfasst. Durchführung: Die Herstellung der liposomalen HPTS/DPX Zubereitungen erfolgte, mit kleinen Änderungen, auf gleiche Weise wie unter 3.5.5 beschrieben. Die durch 31,8 mM HPTS und 35,0 mM DPX verursachte Osmolarität des Intraliposomalraums betrug unter Berücksichtigung der Van´t Hoff-Faktoren rechnerisch 232,2 mosmol/l. Die HEPES-Konzentration von 10 mM wurde bei den Berechnungen der Osmolarität vernachlässigt, da sie intra- und extraliposomal stets identisch ist und damit nicht zur

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