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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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98 METHODEN

98 METHODEN Osmolaritätsdifferenz beiträgt. Zur Einstellung der Osmolarität von extra- und intraliposomalem Kompartiment wurde Glucose verwendet. Die Aktivitätskoeffizienten aller gelösten Moleküle wurden als 1 angenommen. War intraliposomal eine höhere Osmolarität als 232 mosmol/l erforderlich, so wurde dies durch Zusatz von Glucose zur HPTS/DPX-Farbstofflösung erreicht. Die Osmolarität der mobilen Phase, bei der gelchromatographischen Abtrennung unverkapselter HPTS/DPX-Anteile, wurde ebenfalls durch Zusatz von Glucose dem intraliposomalen Kompartiment angeglichen. Alle Fluoreszenzmessungen wurden in einer auf 25 °C temperierten und permanent gerührten Glasküvette durchgeführt. Es wurden 1800 µL des Puffermediums definierter Osmolarität in der Messküvette vorgelegt, zwei Minuten bis zum Temperaturausgleich gewartet und anschließend die Fluoreszenzmessung im Time- Drive Modus gestartet. Nach 120 Sekunden wurden 100� µl der Liposomenlösung hinzupipettiert und der Anstieg der Fluoreszenzintensität verfolgt. Nach insgesamt 1000 Sekunden wurden 100 µl einer 1% (m/m) Triton X-100-lösung in HEPES-Puffer zugegeben, um die Fluoreszenzintensität bei 100% Freisetzung zu ermitteln. Der Wert für 0 % Freisetzung wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität intakter HPTS/DPX-Liposomen im jeweils isoosmolaren Puffer bestimmt. Aus den Fluoreszenzintensitäten bei 0 % Freisetzung (I0%), unmittelbar vor Tritonzugabe (I) und bei 100 % Freisetzung (I100%) wurde die prozentuale Freisetzung (R) nach Gleichung 3.15 ermittelt. I - I0% R = ⋅100% Gleichung 3.15 I - I 100% 0% R Freisetzung [%] I Fluoreszenzintensität unmittelbar vor Tritonzugabe I0% Fluoreszenzintensität bei 0 %Freisetzung I100% Fluoreszenzintensität bei 1000 %Freisetzung Die Untersuchungen wurden von Frau Michaela Koch im Rahmen eines Mitarbeiterpraktikums durchgeführt.

METHODEN 99 3.5.7 Auswirkung von DOGM auf die Permeationsgeschwindigkeit durch liposomale Membranen Durchführung: Zunächst wurde jeweils ein Film nach der Filmmethode (Kapitel 3.1.1) hergestellt. Dabei wurden die in Tabelle 3-3 angegebenen Einwaagen an EPC, DOGM und OG verwendet. Der getrocknete Film wurde in 2,00 ml Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,4; isotonisiert mit 200 mM NaCl) suspendiert und die klare, mischmizellare Lösung in das Donorkompartiment der Dialysekammer überführt. Bei 7,5 mol% DOGM entstand beim Dispergieren des Films eine leichte Trübung, die erst nach kurzzeitigem Erhitzen auf 60 °C verschwand. Die Herstellung aller Liposomenzubereitungen erfolgte mittels Detergensdialyse (Kapitel 3.1.3). Alle Zubereitungen wurden mittels Cryo-TEM (3.3.3) auf ungewöhnliche Strukturen in der Lipidmembran, eventuell verursacht durch DOGM, untersucht. Tabelle 3-3 Herstellung der Liposomendispersionen zur Untersuchung des Einfluss von DOGM auf das Permeationsverhalten von Glucose. DOGM-Gehalt in der Lipidphase [mol %] Eiwaage EPC [mg] Einwaage DOGM [mg] Einwaage OG [mg] 0 31,20 0 58,5 1,5 30,73 0,613 58,5 2,8 30,33 1,144 58,5 4,5 29,80 1,839 58,5 7,5 28,86 3,065 58,5 Die Liposomendispersionen wurden unmittelbar vor der Messung, in einem NMR- Röhrchen, 1:1 mit 400 mM Glucoselösung (in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) versetzt und durchmischt. Der steigende Anteil intraliposomaler Glucose wurde, über einen Zeitraum von 14 Stunden, mittels zeitaufgelöster Pulsed-Field-Gradient-NMR (Grundlagen s. Kapitel 1.3.2, Geräteparameter s. Kapitel 3.5.7) gemessen. Die Permeationsmessungen wurden von Frau Dipl.- Chem. Alina Leson, Arbeitskreis Prof. C. Mayer am Institut für Physikalische Chemie der Universität Duisburg-Essen durchgeführt.

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