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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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100 METHODEN 3.6

100 METHODEN 3.6 Untersuchungen zur Polymerverteilung und -struktur 3.6.1 Element Selective Imaging (ESI) Messprinzip: Trifft der Elektronenstrahl eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM) auf eine Probe, so kommt es zu verschiedenen Arten der Wechselwirkung. Bei der Methode des Element Selective Imaging (ESI) macht man sich zunutze, dass einige der beschleunigten Elektronen des erzeugten Stahls, Elektronen aus der Hülle der Probenatome schlagen und dabei einen bestimmten Energiebetrag verlieren. Die verlorene Energiemenge ist spezifisch für das Element, mit dem die Wechselwirkung stattfand. Die durch die Probe gelangten Elektronen ergeben in ihrer Summe ein charakteristisches Energiespektrum. Diesem Spektrum lassen sich, bei definierten Energiegehalten, elementspezifische Signale zuordnen. Mithilfe der Spaltblende des TEM können bestimmte Bereiche aus diesem Energiespektrum ausgewählt und abgebildet werden. Vergleicht man mittels Software die Helligkeitsverteilung auf fünf, in unterschiedlichen elementspezifischen Energiebereichen aufgenommenen Bildern desselben Probenausschnitts, so lässt sich die Verteilung des Elements in diesem Probenausschnitt bildlich darstellen. Durchführung: Die Herstellung der polymergefüllten Liposomen erfolgte wie unter 3.1.5 beschrieben, aber unter Vermeidung von HEPES- und Phosphatpuffer aufgrund ihres Gehalts an Schwefel und Phosphor. Es wurden pSEMA/TEGDM/DOGM- sowie pSEMA/DMAGS/DOGM-gefüllte Liposomen untersucht. Die Liposomenproben wurden auf einen Lipidgehalt von ca. 5 mM eingestellt und ca. 2 µl jeder Probe auf ein, mit Kohle bedampftes, 400x100 mesh Kupfernetz (Grid) aufgebracht und getrocknet. Nach Auswahl eines geeigneten Probenausschnitts wurde die Schwefelverteilung im ESI-Modus abgebildet. Die Verteilung der schwefelhaltigen Monomere SEMA und DMAGS ermöglichte die Lokalisation des Polymers. Die entsprechenden Probenausschnitte anschließend mit EDX (siehe 3.6) auf das Vorhandensein der Elemente Phosphor und Schwefel geprüft. Die Untersuchungen wurden unter Anleitung von Dr. R. Thomann (Makromolekulare Chemie, Universität Freiburg) an einem Transmissionselektronenmikroskop des Typs Leo 912 Ω-mega ® , unter Verwendung der Software iTEM 5.0 ® , durchgeführt.

METHODEN 101 3.6.2 Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) Messprinzip: Die Probe wird in einem TEM mit Elektronen hohen Energiegehalts bestrahlt. Bei Wechselwirkung dieser Elektronen mit den Atomen der Probe können Elektronen aus dem inneren Bereich der Elektronenhülle des Atoms herausgelöst werden. Die Elektronenlücke in der inneren Schale kann beispielsweise durch ein Elektron einer äußeren Schale des Atoms geschlossen werden. Beim Übergang des Elektrons von der äußeren auf die innere Schale wird Energie, u.a. in Form von Röntgenstrahlung freigesetzt. Jedes emittierte Röntgenphoton besitzt dabei einen, für das betreffende Element spezifischen, Energiegehalt. Die emittierte Röntgenstrahlung gibt also Aufschluss über die elementare Zusammensetzung der Probe. Durchführung: Die Herstellung der polymergefüllten Liposomen erfolgte, wie unter 3.6.1 beschrieben. Zunächst wurden Aufnahmen im ESI-Modus durchgeführt, anschließend wurde die emittierte Röntgenstrahlung im EDX-Modus detektiert. Es wurde ein Leo 912 Ω-mega ® Transmissionselektronenmikroskop verwendet, ausgestattet mit einem Link ISIS Pentafet EDX Kontroller und einem Link Germanium Detektor der Firma Oxford Instruments. 3.6.3 Ultramikrotomie Durchführung: Liposomen mit Polymerskelett wurden, wie unter 3.1.5 beschrieben, hergestellt. Die fertige Liposomendispersion wurde bei 140 000 x g für 180 Minuten ultrazentrifugiert (Festwinkelrotor 50.4 Ti, LE 80 Optima Ultrazentrifuge, Beckman) und der Überstand möglichst vollständig entnommen. Das Pellet aus Liposomen wurde mit einem Spatel in eine Silikonform (Bachhuber, Ulm) überführt und mit einer kleinen Menge Melamin-Harz innig vermischt. Das wasserlösliche Harz (Nanoplast FB 101, Bachhuber, Ulm) wurde zuvor gemäß Herstellervorschrift „medium“ vorbereitet. Das Trocknen der Probe erfolgte über Blaugel im Exsikkator, zunächst für 48 Stunden bei Raumtemperatur, dann für weitere 24 Stunden bei 40°C. Das Melamin- Harz wurde abschließend bei 60 °C über 24 Stunden gehärtet. Mit Hilfe eines Ultracut E der Firma Reichert und Jung wurden 50 nm dicke Ultradünnschnitte angefertigt. Diese wurden auf ein Kupfergrid aufgebracht und nach ausreichender Trocknung in einer abgeschlossenen Glaskammer für die Dauer von 15 Minuten mit

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