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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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102 METHODEN

102 METHODEN RuO4-Dämpfen behandelt (Positiv-Staining). Das gasförmige RuO4 entstand durch Zugabe von 10 %iger NaOCl-Lösung zu vorgelegtem RuCl3. Die Präparate wurden anschließend im Transmissionselektronenmikroskop (Leo 912 ® , Oberkochen) betrachtet. Die Arbeiten am Ultramikrotom, sowie das RuO4-Staining wurden von Dr. Ralf Thomann (Makromolekulare Chemie, Universität Freiburg) durchgeführt. 3.7 Auswirkungen eines Membranskeletts 3.7.1 Auswirkung des Polymerisationsprozesses auf die Liposomengröße Durchführung: Es wurden polymergefüllte Liposomen nach Kapitel 3.1.5 hergestellt. Die Liposomendispersion wurde jeweils vor und nach dem Polymerisationsprozess in einem ein Zetamaster S ® der Firma Malvern Instruments, unter den in 3.3.2 beschriebenen Bedingungen vermessen. Aus den ermittelten Vesikeldurchmessern und Polydispersitätsindices wurden jeweils der Mittelwert und die Standardabweichung bestimmt und verglichen. 3.7.2 Auswirkung des Polymers auf das ζ-Potential der Liposomen Messprinzip: Die ζ-Potentialbestimmung über die elektrophoretische Migrationsgeschwindigkeit ist Gegenstand zahlreicher Lehrbücher (z.B. Voigt & Fahr, 2000), daher wird an dieser Stelle nicht näher auf die theoretischen Grundlagen eingegangen. Durchführung: Es wurden SEMA/DMAGS/DOGM-haltige Liposomendispersionen, wie unter 3.1.5 beschrieben, hergestellt. Unmittelbar vor und nach der Polymerisation wurde das ζ-Potential mithilfe eines Zetamaster S ® der Fa. Malvern Instruments bestimmt. Um eine mögliche Veränderung des ζ-Potentials durch Schädigung der Membranbestandteile im Verlauf der radikalischen Polymerisation auszuschließen, wurden sowohl ankerhaltige Leerliposomen (2 mol% DOGM in der Lipidphase) als auch ankerfreie Co-Monomer-haltige Vesikel vor und nach der Bestrahlung mit UV- Licht in An- und Abwesenheit des Radikalstarters DEAP untersucht. Der Lipidgehalt

METHODEN 103 aller Proben wurde durch Zusatz von 5 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) auf 0,2 mM eingestellt. Dadurch ergab sich während der Messung eine Zählrate von ca. 2000 kcounts pro Sekunde. Der Phosphatpuffer wurde vor dem Verdünnungsschritt über einen Sterilfilter der Porenweite 0,2 µm filtriert, um störende Schwebstoffe zu entfernen. Vor den Messungen wurde die Messzelle mit Millipore ® - Wasser so lange gespült, bis die Intensität des Streulichtsignals der wassergefüllten Messzelle den Wert von 2 kcounts pro Sekunde unterschritt. Die verdünnte Liposomendispersion wurde mithilfe einer 5 ml Einmalspritze durch einen Membranfilter der Porengröße 0,45 µm (Minisart ® RC15, Sartorius, Göttingen), in die Messzelle eingebracht. Die Verwendung des 0,45 µm Membranfilters verhinderte das Auftreten von Störsignalen durch die hohe Streulichtintensität einzelner übergroßer Partikel. Störende Luftblasen in der Messzelle und im Bereich der Elektroden wurden vermieden, indem beim Ansetzen der Spritze (bzw. des Filters) zunächst die Luft mit wenigen Mikrolitern verdünnter Liposomendispersion aus dem Probeneinlass verdrängt wurde. Alle Messungen fanden bei 25 °C in der thermostatisierten Messzelle statt. Vor der Messung wurde jeweils 5 Minuten bis zum Temperaturausgleich gewartet. Die Messungen wurden bei einem elektrischen Feld von 30 V/cm (Zellspannung 150 V), einer Modulatorfrequenz von 250 Hz und einer Correlator sample time von 400 µsec durchgeführt. Der Duty Cycling Modus verhinderte ein übermäßiges Erwärmen der Probe während den Messungen. Es wurden pro Probe zehn Einzelmessungen zu je 20 Sekunden durchgeführt. Das ζ-Potential errechnete sich aus dem Mittelwert der Einzelmessungen. 3.7.3 Untersuchung der Membranintegrität nach Polymerisation 3.7.3.1 Auswirkung des Polymers auf die Vesikelform (Cryo-TEM) Durchführung: Es wurden Liposomen mit einem intraliposomalen Polymerskelett, wie in Kapitel 3.1.5 beschrieben, hergestellt. Unmittelbar vor- und nach der Bestrahlung mit UV-Licht wurde die Form der Liposomen in der Zubereitung mittels cryo-TEM (Kapitel 3.3.3) untersucht.

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