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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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104 METHODEN 3.7.3.2

104 METHODEN 3.7.3.2 Auswirkung des Polymers auf die Permeationskinetik von Glucose Durchführung: Es wurden polymergefüllte Liposomen, wie in Kapitel 3.1.5 beschrieben, hergestellt. Zur Abtrennung des unverkapselten Monomeranteils wurde eine Größenausschlusschromatographie durchgeführt. Dadurch wurde die Liposomendispersion soweit verdünnt, dass eine direkte PFG-NMR-Messung, aufgrund der zu geringen Empfindlichkeit der Methode, nicht möglich war. Die fertiggestellte Liposomendispersion wurde für 3 Stunden bei 140 000 x g zentrifugiert (Festwinkelrotor 50.4 Ti, Beckman LE 80 Optima Ultrazentrifuge), der Überstand entnommen, das Pellet in Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,4, 100 mM NaCl) aufgenommen und auf einen Lipidgehalt von ca. 25 mM eingestellt. Als Vergleich dienten Liposomen mit identischer Lipidzusammensetzung, aber ohne pSEMA/DMAGS. Statt des Polymers wurde Kochsalz in einer Konzentration von 100 mM in den Vergleichsliposomen verkapselt, um eine möglichst ähnliche Osmolarität im Intraliposomalraum der beiden Liposomenproben zu gewährleisten. Die Vergleichsliposomen wurden ebenso wie die polymergefüllten Liposomen für 60 Minuten mit UV-Licht (Kapitel 3.1.5) bestrahlt. Unmittelbar vor der PFG-NMR- Messung wurden 250 µl der jeweiligen Liposomendispersion mit 250 µl einer Glucoselösung (400 mM Glucose in Phosphatpuffer, 5 mM, pH 7,4) in einem NMR- Röhrchen gemischt. Die PFG-NMR-Messungen erfolgten mit einem Avance 400 MHz NMR-Spektrometer der Firma Bruker-BioSpin GmbH, ausgestattet mit einem Diff30-Probenkopf, active shielding (Unterdrückung von induzierten Wirbelströmen) und Wasserkühlung (zur Vermeidung von Konvektion in der Probe). Als Gradientenverstärker kam ein B- AFPA-40 der Firma Bruker-BioSpin GmbH zu Einsatz. Es wurde jeweils ein Stimulated-Echo Experiment mit entsprechenden Gradientenpulsen durchgeführt. Die erhaltenen Spektren wurden mit Hilfe der NMR-Software X-WIN-NMR bzw. Top- Spin ausgewertet. Die Parameter der zeitaufgelösten PFG-NMR-Messungen sind in Tabelle 3-4 aufgelistet.

METHODEN 105 Tabelle 3-4 Parameter der zeitaufgelösten PFG-NMR-Messungen zur Bestimmung des Permeationsverhaltens von Glucose Parameter Einstellung 90° Puls ca. 9 µs Recycle Delay d1 5 sec Gradientenpulslänge δ 1,2 ms Gradientenstärke G 81 G/cm Scans 8 Diffusionszeit ∆ 100ms Das Signal des verkapselten Glucoseanteils wurde über einen Zeitraum von ca. 12 Stunden alle 464 Sekunden gemessen und gegen die Zeit aufgetragen. Die Geschwindigkeitskonstante k des Permeationsprozesses, der einer Kinetik 1. Ordnung folgte, wurde durch Annähern der Kurve mit Gleichung 3.16 ermittelt (Software: Origin 6.0). f ( t) = ( A − x) * ( 1− e −k * t ) + x Gleichung 3.16 Die zeitaufgelösten PFG-NMR Messungen wurden von Frau Dipl.-Chem. Alina Leson, Arbeitskreis Prof. C. Mayer am Institut für Physikalische Chemie der Universität Duisburg-Essen durchgeführt. 3.7.4 Bestimmung der Membran-Stabilität gegenüber Natriumcholat Durchführung: Es wurden zwei unterschiedliche Typen von Vesikeln hergestellt, polymergefüllte Liposomen sowie Liposomen ohne Polymer. Beide Präparationen enthielten 2 mol% (bezogen auf EPC) DOGM als Ankerkomponente. Die Lipidkomponente wurde mit dem Betastrahler L-α-Dipalmitoyl-(dipalmitoyl-1- 14 C)phosphatidylcholin ([ 14 C]-DPPC) markiert. In die Liposomen wurde der Betastrahler 3 H-Inulin, mit der mittleren Molekularmasse von 5 kDa, verkapselt. Beide Vesikel-

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