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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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106 METHODEN Tabelle 3-5

106 METHODEN Tabelle 3-5 Herstellung der Lipidkomponente Bestandteil Anker- und Polymerliposomen EPC 9,556 mg DOGM 0,255 mg [ 14 C]-DPPC 35 kBq Einwaagen zur Herstellung von jeweils 500 µl Vesikelzubereitung; Die Substanzen wurden zusammen in einen 50 ml Rundkolben gegeben, in THF gelöst und ein Lipidfilm nach der Filmmethode hergestellt. Tabelle 3-6 Herstellung der wässrigen Lösung zum Dispergieren des Films Komponente Ankerliposomen Polymerliposomen Na-Phosphatpuffer 5 mM pH 7,4 isotonisiert mit 100 mM NaCl SEMA 95mM / DMAGS 5 mM in Na-Phosphatpuffer 5 mM pH 7,4 500 µl - - 500 µl [ 3 H]-Inulin 1000 kBq 1000 kBq zubereitungen wurden nach der Filmmethode (Kapitel 3.1.1) und anschließender Extrusion (Kapitel 3.1.2) hergestellt. Die Zusammensetzungen der beiden Vesikelpräparationen werden aus Tabelle 3-5 und Tabelle 3-6 ersichtlich. Die Lipidkonzentration der Vesikelproben betrug 25 mM. Der Anteil an unverkapselten Monomeren und [ 3 H]-Inulin wurde durch Größenausschlusschromatographie über Sepharose CL-4B mit Phosphatpuffer pH 7,4 (isotonisiert mit 100 mM NaCl) als Eluent abgetrennt. Das Gelbett zur Abtrennung der unverkapselten Anteile hatte eine Höhe von 14 cm und einen Durchmesser von 1,4 cm. Es wurde jeweils ein Volumen von 400 µl Liposomendispersion auf die Säule aufgebracht. Durch die Größenausschlusschromatographie wurde die Liposomendispersion auf einen Lipidgehalt von ca. 5 mM verdünnt. Die gewählten Aktivitäten an [ 3 H]-Inulin und [ 14 C]-DPPC ergaben nach Elution der Liposomen in etwa gleiche Aktivitäten von 3 H und 14 C. Die Polymerisation erfolgte nach Zugabe von 1 µl DEAP als Starter, wie unter 3.1.5 beschrieben. Es wurden sowohl die Anker- als auch die Polymerliposomen dem Polymerisationsprozess unterzogen.

METHODEN 107 Die fertige Liposomendispersion wurde in Ultrazentrifugenröhrchen zu je 60 µl aliquotiert, mit jeweils 940 µl einer Natriumcholatlösung definierter Konzentration in Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,4) versetzt und für 15 Minuten bei 25 °C inkubiert. Die Natriumcholat-Konzentrationen deckten einen breiten Bereich von 0 bis 50 mM ab, wobei im Bereich der Solubilisation entsprechend kleine Konzentrationsänderungen gewählt wurden. Die Proben wurden für 3 Stunden bei 140 000 x g zetrifugiert (Festwinkelrotor 50.4 Ti, Beckman LE 80 Optima Ultrazentrifuge), anschließend je 600 µl des Überstands entnommen, mit 3 ml Hionic Fluor ® gemischt und die 3 H/ 14 C-Aktivität der Lösung im ß-Counter (Tri-Carb 1900 TR, Canberra Packard) gemessen. Die prozentualen Freisetzungen von [ 14 C]-DPPC aus der Liposomenmembran und [ 3 H]-Inulin aus dem intraliposomalen Kompartiment wurden ermittelt und gegen die jeweilige Natriumcholat-Konzentration in einem Diagramm aufgetragen. 3.7.5 Untersuchung der mechanischen Stabilität mittels AFM Durchführung: Gegenstand der Untersuchung waren verschiedene Arten von Co-Polymeren innerhalb Liposomen, deren Zusammensetzungen in Tabelle 3-7 aufgeführt sind. Die Lipidphase aller Liposomen bestand aus EPC mit 2 mol% DOGM (bezogen auf EPC) als Ankerkomponente. Probe 4 wurde wie in Kapitel 3.1.5 beschrieben hergestellt. Die Herstellung der Proben 1 und 2 folgte ebenfalls der Vorschrift aus Kapitel 3.1.5, doch wurde hier auf den Zusatz des Vernetzers DMAGS verzichtet. Stattdessen wurde unmittelbar nach der größenchromatographischen Trennung die entsprechende Menge des Vernetzers TEGDM zugesetzt, für 60 Minuten intensiv gerührt und erst dann polymerisiert. Dieses Vorgehen verhinderte den fast vollständigen Verlust zuvor verkapselten TEGDM während der größenchromatographischen Abrennung unverkapselter Monomere. Für die Rasterkraftmikroskopie wurde ein Mikroskop des Typs Nanoscope VI Dimension Bioscope (Veeco Instruments, Santa Barbara, US) verwendet. Als Abbildungstechnik kam der Tapping modus in Luft zum Einsatz. Die Wechselwirkung zwischen der Probe und der Abtastspitze wurde bei der Bildgebung auf ein Mindestmaß reduziert und betrug weniger als 300 pN. Als Abtastspitzen kam ein I-Typ Cantilever mit einer nominalen Kraftkonstante von 36 nN/nm zum Einsatz. Die

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