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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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114 AUC 1,8E+05 1,6E+05

114 AUC 1,8E+05 1,6E+05 1,4E+05 1,2E+05 1,0E+05 8,0E+04 6,0E+04 4,0E+04 2,0E+04 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 0,0E+00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 NIPAM [µg/ml] ohne EPC mit EPC-Liposomen Abbildung 4-2 Kalibrationsgerade der HPLC-Analytik auf NIPAM (Detektions- wellenlänge = 195 nm) im Bereich der Bestimmungsgrenze (0,05- 2,5 µg/ml) ohne und mit 20 mM EPC. Verkapselung und gelchromatographische Abtrennung des unverkapselten Anteils: Es wurden NIPAM-haltige EPC-Liposomen nach der Filmmethode (Kapitel 3.1.1) hergestellt und anschließend durch 200 nm-Polycarbonatmembranen extrudiert (Kapitel 3.1.2). Die Liposomendispersion hatte einen mittleren Durchmesser von 212 nm. Die gelchromatographische Abtrennung (SEC) des unverkapselten Anteils erfolgte über CL-4B ® wie unter 3.5.1 beschrieben. Nach ca. 7 min eluierten die liposomenhaltigen Fraktionen. In diesen war mittels HPLC allerdings kein NIPAM nachweisbar (Elutionsprofil siehe Abbildung 4-3). Unverkapseltes NIPAM erschien erst nach ca. 25 min im Eluat. Ein NIPAM-Verlust auf der Säule konnte ausgeschlossen werden, da die Wiederfindungsrate im Mittel bei 100,7 % lag. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass der ursprünglich liposomal verkapselte NIPAM-Anteil die Vesikel im Verlauf der SEC verlassen hat. Während der SEC herrschte stets ein maximaler Konzentrationsgradient zwischen intraliposomalem und extraliposomalem Kompartiment, was in Kombination mit einer guten Membrangängigkeit zum schnellen Austritt der verkapselten Substanz führte.

NIPAM [µg] 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 115 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Retentionszeit [s] Abbildung 4-3 Elutionsprofil von NIPAM-haltigen EPC-Liposomen nach SEC über Sepharose CL-4B. Die vesikulären Bestandteile erschienen nach ca. 500 sec im Eluat (schwarzer Kreis). Dagegen eluierte NIPAM erst zwischen 1500 und 2500 sec. Folglich war nach der SEC kein liposomal verkapseltes NIPAM nachweisbar. Abtrennung des unverkapselten Anteils mittels Gelzentrifugation: Es wurden NIPAMhaltige EPC-Liposomen mittels Filmmethode und Detergensdialyse (Kapitel 3.1.3) hergestellt. Die Vesikel hatten einen mittleren Durchmesser von 184 nm (PCS) und eine Lamellarität von 1,3 (Cryo-TEM). Der unverkapselte NIPAM- Anteil wurde mittels Gelzentrifugation innerhalb von wenigen Sekunden abgetrennt (Kimpfler 2003). Im Vergleich zur SEC, wurde bei der Gelzentrifugation die Aufenthaltsdauer der Liposomen auf der Säule stark verkürzt. Die verkapselte Substanz hatte weniger Zeit die Vesikel zu durch Permeation zu verlassen. Dadurch sollten, trotz schneller Permeationskinetik, noch Reste von verkapselten NIPAM zusammen mit der Liposomenfraktion eluieren. Es wurde gegen eine liposomenfreie Lösung gleicher NIPAM-Konzentration verglichen, um ein Auftreten von NIPAM im Eluat eindeutig als Verkapselungseffekt identifizierten zu können. Das Ergebnis dieser Untersuchungen wird in Abbildung 4-4 dargestellt. Im liposomenhaltigen Eluat wurde zwar signifikant mehr NIPAM gefunden, als im liposomenfreien Eluat. Der auf eine Verkapselung zurückzuführende Anteil an NIPAM im Eluat lag mit nur 0,05 ‰ weit unterhalb des, bei stabiler Verkapselung erwarteten, Erfahrungswerts von ca. 3,5 %.

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