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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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58 METHODEN

58 METHODEN durchschnittlichen Lamellenzahl. Die ungerade Anzahl von Membranpassagen verhinderte große Lipidaggregate in der fertigen Liposomendispersion, da jedes im Produkt enthaltene Liposom mindestens ein einziges Mal die Polycarbonatmembran passieren musste. 3.1.3 Detergensdialyse Die theoretischen Grundlagen zur Herstellung liposomaler Zubereitungen mittels Detergensdialyse sind Gegenstand von Kapitel 1.2.3.2.2. Zunächst wurde nach der Filmmethode (Kapitel 3.1.1) ein detergenshaltiger Lipidfilm hergestellt. Dabei wurde das Detergens n-Octyl-β-D-glucopyranosid (OG) im molaren Verhältnis von 5 zu 1 (Detergens zu Lipid) eingesetzt. Nach Zusatz der berechneten Menge Puffer, bzw. wässriger Co-Monomerenlösung, entstand eine anfangs leicht opaleszierende, mischmizellare Lösung, die nach kurzer Zeit klar wurde. Beim Lösen DOGM-haltiger Filme musste die Temperatur kurzzeitig auf 60 °C erhöht werden, um eine, bei höheren DOGM-Konzentrationen auftretende, dauerhafte Trübung zu beseitigen. Um das Detergens unter Luftausschluss und bei exakt definierten Bedingungen aus der mischmizellaren Lösung zu entfernen, wurde eine Dialyseapparatur aus Acrylglas angefertigt (Abbildung 3-1). Diese ermöglichte die Herstellung von bis zu 2,4 ml liposomaler Zubereitung in einem Arbeitgang. Mithilfe einer Kolbenhubpumpe wurde frisch entgaster Dialysepuffer, bzw. wässrige Co-Monomerenlösung, mit einer konstanten Flussrate von 1 ml/min über 24 Stunden durch die Akzeptorkammer geleitet und im Abfallgefäß aufgefangen. Das Entgasen des Dialysepuffers verhinderte die Bildung von Luftblasen, deren Auftreten zu einer Verringerung der Austauschfläche an der Dialysemembran hätte führen können. In der Donor- und Akzeptorkammer wurde mithilfe je eines kleinen Magnetrührstabes eine gute Durchmischung erreicht. Zu Beginn der Dialyse wurde eine hohe Rührgeschwindigkeit von 350 U/min gewählt. Dies führte zu einer homogenen Größenverteilung der Liposomen im Produkt. Nach Bildung der Liposomen, erkennbar an der intensiven Trübung, wurde die Rührgeschwindigkeit auf 60 U/min reduziert, um im weiteren Verlauf die Dialysemembran nicht zu schädigen. Aus dem gleichen Grund wurden scharfe Kanten an den Magnetrührstäben entfernt. Als Dialysemembran fanden Cellulosemembranen des Typs Diachema very high permeability Verwendung. der Firma Dianorm mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa

METHODEN 59 Abbildung 3-1 Schematischer Aufbau der Dialysekammer aus Acrylglas; links: Deckelplatte mit Donorkompartiment (oben) und Bodenplatte mit Akzeptorkompartiment (unten) vor dem Zusammenfügen; In beiden Kompartimenten befand sich ein Magnetrührstab. Dazwischen wurde die Dialysemembran (grau) eingelegt. Zunächst wurde die Deckelplatte kopfüber mit der mischmizellaren Lösung befüllt und die vorgequollene Dialysemembran auf das Donorkompartiment aufgelegt. Die Deckelplatte wurde anschließend fest an die Bodenplatte geschraubt und das Akzeptorkompartiment unter Vermeidung von Luftblasen mit Akzeptormedium durchströmt. Nach Beendigung des Dialyseprozesses konnte die Liposomendispersion aus dem Donorkompartiment entnommen werden, indem eine kleine Schraube aus der Bodenplatte entfernt und die Dialysemembran mit einer Kanüle durchstochen wurde. Durch die Entnahme über die Akzeptorseite konnte ein schlecht durchmischbares „Totvolumen“ im Donorkompartiment vermieden werden. Beide Kompartimente hatten ein Fassungsvolumen von 2,4 ml. rechts: Bodenplatte (Aufsicht); Konzentrisch um das Akzeptorkompartiment wurde ein Gummiring (schwarz) eingelassen, um beim Verschrauben der beiden Platten einen dichten Abschluss mit der Dialysemembran zu gewährleisten. Der kontinuierliche Austausch des Dialysepuffers erfolgte über zwei seitlich angebrachte Bohrungen mittels einer Kolbenhubpumpe. 3.1.4 Phasenumkehr durch Lösungsmittelverdampfung Zur Herstellung von 1,5 ml liposomaler Zubereitung mit einer Gesamtlipidkonzentration von 66 mM wurden 60 µmol EPC und 40 µmol Cholesterol in einen 50 ml-Rundkolben mit langem Hals eingewogen. Der Rundkolben wurde zur Entfernung von Sauerstoff mit Stickstoff gespült. Anschließend wurden die eingewogenen Substanzen in 4,5 ml tert. Butylmethylether (TBME) gelöst, und 1,5 ml der 100 mM PEG400MMA-Lösung zugesetzt. Das Verhältnis von Ether zu wässriger Phase betrug 3 zu 1. Der verschlossene Rundkolben wurde im Ultraschallbad mit Eis

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