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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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60 METHODEN auf 0 bis 5

60 METHODEN auf 0 bis 5 °C gekühlt. Nach 5 Minuten im Ultraschall entstand eine weiße, stabile W/O-Emulsion. Der Druck im Kolben wurde mittels Rotationsverdampfer schrittweise nach dem Schema in Tabelle 3-1 abgesenkt. Tabelle 3-1 Schema zur Absenkung des Drucks während der Herstellung von Liposomen mittels Phasenumkehr durch Lösungsmittelverdampfung Zeit Druck 0 – 20 min 400 mbar 20 – 25 min 350 mbar 30 – 35 min 300 mbar 35 – 40 min 250 mbar 40 – 45 min 200 mbar 45 – 50 min 150 mbar ab 50 min 100 mbar Während der Druckabsenkung wurde bei 200 – 150 mbar zunächst ein gelartiger Zustand durchlaufen, dann erfolgte Phasenumkehr und es entstand eine milchige O/W-Emulsion. Der Kolben wurde solange bei 100 mbar am Rotationsverdampfer belassen, bis kein Geruch nach TBME mehr wahrnehmbar war. Die Liposomendispersion enthielt noch einzelne größere Lipidaggregate. Mehrmalige Extrusion (Kapitel 3.1.2) durch Polycarbonatmembranen mit Poren von 600, 400 und zuletzt 200 nm, führte zur Reduzierung und Vereinheitlichung der Partikelgröße im Produkt. Die zahlreichen Extrusionsschritte waren aufgrund der hohen Rigidität der cholesterolhaltigen Lipidmembran erforderlich.

METHODEN 61 3.1.5 Synthese des intraliposomalen Polymerskeletts Herstellung der Liposomendispersion: Die Synthese des intraliposomalen Polymerskeletts erfolgte in modifizierter Form nach Stauch (Stauch 2002). Die Herstellung der Liposomendispersion wurde bereits unter Filmmethode und Extrusion (Kapitel 3.1.1 und 3.1.2) beschrieben. Als Monomer wurde 2-Sulfoethylmethacrylat (SEMA) in einer Konzentration von 95 mM verwendet, als Vernetzer kam Dimethacryloylglycerolsulfat (DMAGS) in einer Konzentration von 5 mM zum Einsatz, sofern bei der jeweiligen Untersuchung nichts anderes beschrieben ist. Bei Verwendung von Tetraethylenglycoldimethacrylat (TEGDM) als Vernetzer, wurde dieses erst nach der Abtrennung des unverkapselten Anteils an SEMA zugesetzt. Das Verhältnis von Monomer zu Vernetzer wurde aus den Arbeiten von Stauch und Gutmayer (Stauch 2002, Stauch et al. 2002, Gutmayer 2004, Gutmayer et al. 2006) übernommen und betrug 20:1. Die Monomere wurden zusammen in 5 mM Phosphatpuffer gelöst und der pH der Lösung anschließend durch Zusatz von NaOH auf einen Wert von 7,4 eingestellt. Mit dieser Lösung wurde der ankerhaltige Film dispergiert. Der Film bestand, wenn nicht anders beschrieben, aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC) und der Ankerkomponente DOGM. Die Gesamtlipidkonzentration betrug 25 mM, zusammengesetzt aus 24,5 mM EPC und 0,5 mM DOGM. Damit lag der Ankergehalt in der Lipidphase bei 2 mol%. Abtrennung des unverkapselten Anteils: Die Abtrennung des unverkapselten Anteils an Co-Monomeren erfolgte durch Größenausschlusschromatographie über Sepharose CL-4B ® . Die Füllhöhe der Säule betrug 170 mm bei einem Innendurchmesser von 10 mm. Frisch gegossenes Gelmaterial wurde zunächst für einige Stunden mit mobiler Phase konditioniert und anschließend durch mehrfache Aufgabe von Leerliposomen mit Lipiden gesättigt. Als Eluent diente frisch entgaster, sterilfiltrierter Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,4), dessen Osmolarität durch Zusatz von 100 mM NaCl an den Intraliposomalraum angepasst war. Es wurden 200 µl liposomale Zubereitung auf das - nicht von mobiler Phase bedeckte - Gelbett gegeben. Unmittelbar nach vollständigem Eindringen der Liposomendispersion in das Gelbett wurde mit Puffer überschichtet. Die Flussrate der mobilen Phase wurde auf konstante 60 ml pro Stunde eingestellt (Kolbenhubpumpe P-500, Pharmacia Biotech). Die Liposomenfraktion, erkennbar an der Trübung, wurde aufgefangen und der unverkapselte Anteil im folgenden Eluat

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