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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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72 Polydispersitätsindex 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 METHODEN 0,00 0 200 400 600 800 Countrate (Kcps) Abbildung 3-8 Abhängigkeit des Polydispersitätsindex von der Countrate; Die Liposomendispersionen wurden mittels Detergensdialyse hergestellt. 3.3.3 Bestimmung der Lamellarität und Größenverteilung mittels Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie (Cryo-TEM) Zur Redispergierung sedimentierter Vesikel wurde jede Probe zunächst intensiv durchmischt. Zu hoch konzentrierte Liposomendispersionen wurden auf einen Lipidgehalt von 5 bis 10 mM verdünnt. Ein kleiner Tropfen (ca. 5 µl) der verdünnten Liposomendispersion wurde mittels Pipette auf ein mit Lochfolie befilmtes und mit Kohle bedampftes 400x100 mesh Kupfernetz (Grid) des Typs Quantifoil® S7/2 (Quantifoil Micro Tools, Jena) aufgebracht. Unmittelbar nach Absaugen der überschüssigen Flüssigkeit mit Filterpapier (blotten), wurde das Grid in flüssiges Ethan (Kryogen, 90 K) eingebracht und schockgefroren. Das überschüssige Ethan wurde mithilfe eines, in Flüssigstickstoff gekühlten, Filterpapiers, abgetupft und das Grid in ein verschließbares Aufbewahrungsgefäß überführt. Zwischen dem Absaugen der überschüssigen Flüssigkeit und dem Einfrieren in flüssigem Ethan durfte nur eine sehr kurze Zeitspanne (

METHODEN 73 überschüssigen Flüssigkeit folgten, wurden unter Stickstoffatmosphäre bei Temperaturen um 90 K in einer Cryo-Präparationskammer durchgeführt, um ein Auftauen des Films sowie die Bildung von Eiskristallen auf dem Grid zu vermeiden. Die tiefe Temperatur in der Cryo-Präparationskammer wurde durch Einsatz von Flüssigstickstoff erreicht. Der ebenfalls mit flüssigem Stickstoff gekühlte Cryo-Probenhalter an der Spitze eines Cryo-Stabes (Gatan ® ) wurde in die Cryo-Präparationskammer eingebracht und das zwischengelagerte Grid mithilfe eines Aluminiumrings im Probenhalter fixiert. Anschließend wurde das Präparat in einer Transfervorrichtung unter Stickstoffatmosphäre in das mittels Flüssigstickstoff gekühlte Transmissions- Eelektronenmikroskop (TEM) des Typs Leo 912 Ω-mega ® (Leo, Oberkochen) überführt. Bei niedriger Strahlenbelastung wurden die Präparate über eine Bildverstärkerkamera betrachtet, fokussiert und in bis zu 300 000 facher Vergrößerung digital abgelichtet. Die Belichtungszeit variierte zwischen 500 ms und 1 s. Die Intensität des Elektronenstrahls (emission current und ilumination angle) wurde zur ausreichenden Durchleuchtung des Präparats jeweils der Filmdicke angepasst. Zur Erhöhung des Kontrasts der liposomalen Membranen, wurde im leichten Unterfokus gearbeitet (Schmidtgen et al. 1998). Um einen Überblick über die Probe zu bekommen wurden jeweils ca. 50 Bilder, in unterschiedlichen Bereichen des Grids, aufgenommen. Die Größenbestimmung der Liposomen erfolgte durch Messung des horizontalen Durchmessers von ca. 100 bis 300 einzelnen Liposomen in mindestens drei unterschiedlichen Aufnahmen. Aus den Einzelwerten wurden Mittelwert und Standardabweichung berechnet. Zur Bestimmung der durchschnittlichen Lamellarität (LØ) der Vesikel wurden Bilder in hoher Auflösung aufgenommen, die das Auszählen einzelner Lamellen zuließen. Die Auswertung erfolgte nach Gleichung 3.2.

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