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Synthese eines Polymerskeletts im hydrophilen Innenraum von ...

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84 METHODEN wurden

84 METHODEN wurden unmittelbar darauf in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -25 °C gelagert. Der Gehalt an Co-Monomeren blieb über eine Lagerzeit von bis zu 4 Tagen unverändert. Der Restgehalt unpolymerisierter Monomere wurde mittels HPLC bestimmt und gegen die Polymerisationszeit aufgetragen. Die HPLC-Bedingungen zur Quantifizierung der einzelnen Monomere werden in Kapitel 3.4.1 angegeben. 3.5 Untersuchungen zur Verkapselung von Monomeren Im Folgenden werden die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Methoden zur Ermittlung der Verkapselungseffizienz und des Permeationsverhaltens von Monomeren beschrieben. Da sich Störungen in der liposomalen Membran ebenfalls auf die Permeationsgeschwindigkeit und damit auf die Verkapselungseffizienz auswirken, werden entsprechende Untersuchungen ebenfalls an dieser Stelle aufgeführt. 3.5.1 Größenausschlusschromatographie (SEC) Messprinzip: Das Permeationsverhalten von Substanzen durch liposomale Membranen kann durch Kombination der Größenausschluss-Chromatographie (englisch: size exclusion chromatography, SEC) mit einer Quantifizierungsmethode (z.B. HPLC) charakterisiert werden. Mittels SEC lässt sich ein Konzentrationsgradient der zu untersuchenden Substanz zwischen intra- und extraliposomalem Kompartiment erzeugen. Die Geschwindigkeit der anschließenden Abnahme des Konzentrationsgradienten korreliert mit dem Permeationskoeffizienten der Substanz durch die liposomale Membran (Kapitel 1.3.3). Die SEC ermöglicht eine Trennung von dispergierten bzw. gelösten Teilchen nach ihren Teilchengrößen. Stationäre Phase dieses säulenchromatographischen Verfahrens sind meist Partikel aus einem polymeren Gel mit definierter Porengröße. Im Fall der Trennung von Liposomen und niedermolekularen Substanzen besteht die mobile Phase (Eluent) aus wässriger Pufferlösung. Die Trennung nach der Teilchengröße beruht auf der unterschiedlichen Eindringmöglichkeit und –dauer von Probenteilchen in die Poren der stationären Phase. Sind Teilchen zu groß, um in die Poren einzudringen, so werden sie „ausgeschlossen“ und verlassen die Säule als erstes. Kleinere Moleküle, die in die Poren des Gels eindringen können, werden

METHODEN 85 zeitweise aus dem Eluentenstrom entfernt und folglich später eluiert. Da die Eindringtiefe (und damit auch die Retentionszeit) von der Molekülgröße abhängt, kann zudem eine Klassifizierung der porengängigen Molekülfraktion erfolgen. Durch Auswahl eines geeigneten Säulenmaterials lassen sich Liposomen mittels SEC von kleineren, gelösten Molekülen abtrennen. Bei Verwendung von Sepharose CL-4B als stationäre Phase werden Liposomen nicht zurückgehalten, während kleine Moleküle in die Poren des Gels diffundieren können. Im Elutionsprofil erscheinen Liposomen und die kleinen, gelösten Moleküle folglich zu unterschiedlichen Retentionszeiten. Sind die gelösten Substanzmoleküle für die Dauer der SEC stabil in Liposomen verkapselt, so eluieren sie in der Liposomenfraktion und nicht in der Fraktion der unverkapselten Moleküle. Mit einer geeigneten Quantifizierungsmethode (z.B. HPLC) wird die Substanzkonzentration cS in jeder Fraktion bestimmt. Trägt man im Elutionsprofil die eluierte Substanzmenge n in jeder Fraktion (n = cS · Fraktionsvolumen) gegen das Elutionsvolumen auf, so können bei ausreichender Trennung zwei Peaks unterschieden werden. Bei geringem Elutionsvolumen erscheint die liposomal verkapselte Substanz, bei höheren Retentionszeiten der unverkapselte Anteil (Abbildung 3-13). Die Verkapselungseffizienz VE lässt sich nach folgender Gleichung berechnen: nverkapselt VE = ⋅100% Gleichung 3.10 nfrei + nverkapselt VE Verkapselungseffizienz [%] nverkapselt liposomal verkapselte Substanz [mol] nfrei unverkapselte Substanz [mol]

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