Southern Blot Methode

Southern Blot Methode
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In diesem Versuchsteil wollen wir die klonierten Fragmente aus dem Restriktionsverdau der λ
DNA (Banden auf dem Gel aus AV4) hochauflösend identifizieren. Dieses geschieht durch
Hybridisierung mit einer aus der gesamten λ DNA gewonnenen Sonde. Dadurch wird sicher
gestellt, dass alle λ−Fragmente (auch die eventuell auf dem Gel mangels Masse unter der UV-
Lampe nicht mehr sichtbaren) aufgefunden werden. Die Grundlage für diesen Nachweis ist
die spezifische Basenpaarung zwischen Sonde und der zuvor denaturierten DNA nach
Übertragung aus dem Gel. Die DNA des Vektors bleibt – im Gegensatz zur Betrachtung unter
UV-Licht – hierbei unsichtbar. Die Sonde wiederum wird durch den zuvor erfolgten Einbau
DIG-markierter Nukleotide in einer speziellen Reaktion sichtbar gemacht (s.u.).
Die Southern Blot Methode besteht aus folgenden Arbeitschritten:
A. Blotting Schritt ( Gel Denaturierung und DNA Übertragung auf dem Filter)
B. Hybridisierungs Methode
- Vor (Prae) – und Hybridisierung der Filter.
- Markierung der DNA Sonde (λ DNA) mit Dioxygenin (DIG-dUTP)
C. Entwickeln des Filters
A. Blotting Schritt
1. Material:
Filter : Nylon Hybond-N Membran von Fa. Amersham
3 MM Whatmann Papier
Stammlösungen:
5 M NaCl
5 M NaOH
20 x SSC
Denaturierungslösung: enthält : 1,5 M NaCl und 0,5 N NaOH (Endkonzentration)
Neutralisierungslösung : enthält: 1M Tris (pH 7,4) und 1,5 M NaCl (Ek)
2. Methoden:
2.1. Aufarbeiten des Gels :
a) Das Gel wird mit einem Lineal photographiert und die Markerbanden durch
Ausstechen mit einer Pasteurpipette markiert
b) Das Gel wird 2 x 15 Minuten in Denaturierungslösung auf einem Taumler
geschwenkt bei Raum Temperatur.
c) Schließlich erfolgt die Renaturierung für 1 x 30 Minuten in Neutralisierungslösung
bei der gleichen Temperatur.

2.2 Aufbau des Southern Blots
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a) In eine Schale wird die 20xSSC Lösung gegeben.
Darüber wird eine Glasscheibe gelegt.
Als „Docht“ werden zwei Whatman 3 MM Papiere blasenfrei aufgelegt.
Das Gel wird mit der Unterseite nach oben (d.h. die Geltaschenöffnungen nach
unten ) auf den Docht gelegt. Auf das Gel, also auf die Unterseite werden
wiederum folgende Schichten (blasenfrei) aufgelegt:
1. eine Lage Hybond N (vorher in 2xSSC Lösung angefeuchtet ).
2. drei Lagen (in 2xSSC Lösung) angefeuchtete 3MM Whatmann Papiere.
3. als saugfähiges Material werden Zellstoff oder Apura handtücher Papier
aufgelegt..
4. Den Abschluß bildet eine Glassplatte mit einem Gewicht, sodaß ein
effizienter kapillarer Transfer gewährleistet ist.
5. Der Blot erfolgt für 4 Stunden oder über Nacht.
b) Nachdurchgeführtem Blot wird dieser vorsichtig abgebaut und die Gelspuren
werden hierbei auf dem HybondN-Filter mit einem Kugelschreiber markiert.
Anschließend wird das Filter getrocknet auf 3MM-Papier.
c) Schließlich muß noch die DNA entweder mit cross-linking oder durch Backen im
Trockenschrank bei 80°C 30 min fixiert werden.
B. Hybridisierung Methode
Herstellen der Sonde
Digoxigenin-Markierung der λDNA
Zur Markierung der Sonden mit Digoxigenin-11-dUTP wird der DIG-High-Prime-Kit (Roche;
http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1585606a.pdf) verwendet. Das dabei
verwendete Verfahren der "random primed" DNA-Markierung basiert auf der Methode von
Feinberg und Vogelstein (1983; 1984).

Material, Chemikalien und Lösungen
1. DIG-High-Prime-Gemisch (DIG-High Prime Kit)
2. EDTA, 0,2 M, pH 8,0
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Durchführung
• 0,02 µg gereinigte λ-DNA in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit sterilem Aqua dest. auf ein
Endvolumen von 16 µl auffüllen
• λ-DNA durch 10 minütiges Erhitzen in einem Wasserkocher denaturieren und schnell in
einem Eis/Ethanol-Gemisch abschrecken
• 4 µl DIG-High Prime zugeben, mischen und kurz Zentrifugieren
• Gemisch für 1Stunde bei 37°C inkubieren
• Reaktion stoppen durch Zugabe von 2 µl EDTA und Erhitzen auf 65°C
Vor-Hybridisierung und Hybridisierung der Filter
Material und Lösungen
20x SSC:
3M NaCl
0.3M Na-citrate; pH7.0
Hybridisierungslösung:
5 x SSC
0,5%- ige (G/V) Blocking Reagenzien (*)
0,1%-ige (G/V) N-lauroylsarkosin, Na- Salz
0,02%-ige (G/V) Sodiumdedocylsulfat (SDS)
50%-ige (V/V) Formamid
(*) Blocking Reagenzien lösen nicht so schnell, daher bitte bei 50 – 70°C aufwärmen, die
Lösung bleibt trübt. Bitte diese Lösung 1 Stunde vorher vorbereiten.
Die Hybridisierung Lösung wird in einer Glasflasche bei 4°C und in einem 50 ml
Kunsstoffröhrchen bei -20°C aufbewahrt.
Achtung, Vor(Prä)hybridisierung Lösung besteht aus Hybridisierungslösung ohne die
markierte Sonde.
1. 15 minutige Prähybridisieren des Filters in der 15 ml Prähybridisierung-lösung in
einem Roll-Inkubator bei 42°C
2. λDNA Probe (Dig-dUTP Markierte) wird 5 Minuten in einem kochenden Wasserbad
(90°C – 100°C) denaturiert und anschließend in einem Eisbad abgekühlt , bevor man in
der Hybridisierungslösung zugibt.
3. Die Prähybridisierunglösung herausgenommen und durch Hybridisierungslösung
ersetzt.
4. Die Inkubation des Filters im Rollinkubator bei 42°C erfolgt übernacht.
Filter Waschen

1. Waschpuffer : 2 X SSC ; 0.1% ige SDS
Die Filter 2 x 5 Minuten in 50 ml 1. Waschpuffer bei RT schwenken
2. Waschpuffer : 0,15 xSSC ; 0,1 %ige SDS
3 x 10 Minuten Waschen der Filter 50 ml 2. Waschpuffer bei 42°C
C. Entwickeln des Filters
Material, Chemikalien und Lösungen
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TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0
DIG-Puffer-1: 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5(Blocking Lösung/Malein Säure
Puffer)
DIG-Puffer-2: Blocking Lösung präparieren; 1:10 mit DIG-Puffer 1 aus dem 10X Blocking
Lösung (Vial Nr.6)
DIG-Puffer-3: 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl (Alkaline Phosphatase
Puffer/Detection Puffer)
Wasch-Puffer: 0,3% (V/V) Tween 20® (Fluka) in DIG-Puffer-1
Anti-DIG-Alkalische Phosphatase-Antikörper (FAB-Fragmente) gekoppelt mit
Alkalischer Phosphatase
Farb Lösung : 200µl NBT/BCIP Stamm Lösung (Vial Nr.5) in 10ml DIG Puffer 2 angeben.
Durchführung
• Alle weiteren Schritte werden bei RT und unter ständigem leichten Schütteln
durchgeführt
• Nylon-Membran in einer Plastik-Box passender Größe für 5 Min. bei RT waschen mit
Waschpuffer
• 15 min in DIG-Puffer-2 inkubieren
• Anti-DIG-Alkalische Phosphatase-Antikörper (1:5.000) in 5 ml mit DIG-Puffer-2
verdünnen und den Blot bei RT 45Min. inkubieren.
• Nylon-Membran zweimal je 15 min mit Wasch-Puffer waschen.
• Nylon-Membran 3 min in DIG-Puffer 3 äquilibrieren
• Frisch zubereitete Farblösung gleichmäßig über die Nylon-Membran verteilen und
lichtdicht abgedeckt stehen lassen
• Nach 5 min, 10 min und 20min die aufkommenden Banden kontrollieren und eventuellen
Hintergrund frühzeitig durch stoppen der Rx. vermeiden.
• Farbreaktion durch mehrmaliges schwenken in dest. Wasser stoppen
Fragen:
1. Welche Banden haben hybridisiert und zeigen eine Farbreaktion?
2. Stimmt die Größe der Banden mit der erwarteten Insert-Größe überein?
3. Sind zusätzliche Banden gefärbt? Wie stark sind sie angefärbt?