m i t Escherichia coli - Forschungszentrum Jülich

2 Problemstellung und Zielsetzung
Die aromatische Aminosäure L-Phenylalanin ist als Bestandteil des Süßstoffs Aspartam
eine der wichtigsten Aminosäuren. Der Weltmarktbedarf an diesem Produkt ist weiter
steigend. Im Rahmen eines Bioregio-Projektes (Projekt-Nr. 0311644) sollte ein Prozess
zur fermentativen Produktion von L-Phenylalanin mit rekombinanten Escherichia coli
entwickelt werden. Dazu gehörten die Stammentwicklung, die Entwicklung des Fermentationsprozesses
und die Entwicklung eines Aufarbeitungsverfahrens, die von den
Kooperationspartnern Institut für Biotechnologie 1 und 2, der DSM Biotech GmbH und
der DSM Research zu erarbeiten waren.
Die Produktionsstämme wurden im Institut für Biotechnologie 1 in Zusammenarbeit
mit der DSM Biotech GmbH durch gezieltes ” Metabolic Engineering“ entwickelt. Durch
die rationale Entwicklung sollte das Verständnis der Stoffwechselprozesse verbessert und
daraus sukzessiv weitere Verbesserungsmöglichkeiten abgeleitet werden.
Zur Produktion von L-Phenylalanin mit E. coli wurde im Rahmen des Teilprojektes
von Gerigk ein Fermentationsprozess im Zulaufverfahren entwickelt [Gerigk 2001]. Dazu
wurden rekombinante, L-Tyrosin-auxotrophe E. coli Stämme mit Deregulierungen im
Aromatenbiosyntheseweg verwendet. Die Konzentrationen der Substrate Glucose und
L-Tyrosin wurden über die Zufuhrraten geregelt. Damit war ein reproduzierbarer und
für verschiedene Stämme verwendbarer Prozess gegeben. Den Untersuchungen zufolge
war die L-Tyrosin-sensitive DAHP-Synthase (AroF), das Eingangsenzym der Aromatenbiosynthese,
unter L-Tyrosin-limitierten Bedingungen aktiver und führte zu verbesserter
Produktion als eine gegen Feedback-Inhibierung resistente DAHP-Synthase. Eine Glucose-
Konzentration von 5 g/l war als geeignet für die Produktion ermittelt worden. Im 20 l
Bioreaktor wurde nach 50 Stunden eine Produktkonzentration von ≈ 34 g/l erreicht. Die
L-Phenylalanin-Glucose-Selektivität lag am Ende bei 13,2 mol/mol % und die Raum-
Zeit-Ausbeute bei 0,63 g/(l·h). Zudem wurde ein Scale-up vom 20 l Bioreaktor in den
300 l Pilotbioreaktor durchgeführt. Die Produktbildung nahm in diesen Fermentationen
jedoch in den letzten Prozessstunden stark ab. Diese Abnahme war wahrscheinlich auf
die Inhibierung der DAHP-Synthase AroF durch hohe L-Phenylalanin-Konzentrationen
zurückzuführen [Jossek 2000], [Backman u. a. 1990].
Eine Inhibierung durch L-Phenylalanin kann durch genetische Veränderungen oder
durch prozesstechnische Ansätze umgangen werden. Als technischer Ansatz bietet sich
hierbei die sofortige Abtrennung des Produktes aus dem Fermentationsprozess während
der Produktion an. Dadurch werden eine Produktinhibierung vermieden, die Produktausbeute
gesteigert und gleichzeitig die Produktionskosten gesenkt [Schuegerl 2000].
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