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m i t Escherichia coli - Forschungszentrum Jülich

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1. L-Phenylalanin-Produktion mit E. <strong>coli</strong> Stämmen mit unterschiedlichen<br />

Glucoseaufnahmesystemen<br />

Stämme mit unterschiedlichen Glucoseaufnahmesystemen sollten zur L-Phenylalanin-<br />

Produktion eingesetzt, stoffwechselphysiologisch charakterisiert und schließlich der beste<br />

Produzent identifiziert werden. Die zur Verfügung stehenden Stämme waren L-Tyrosinauxotroph<br />

und enthielten Deregulierungen im Aromatenbiosyntheseweg. Enzyme aus dem<br />

Aromatenbiosyntheseweg wurden plasmidkodiert überexprimiert. Die Glucoseaufnahme<br />

erfolgte entweder über das Glucose-spezifische Phosphotransferase-System oder über<br />

ein heterologes System. Bei letzterem wurde die Glucose über den Glucose-Facilitator<br />

aus Zymomonas mobilis aufgenommen und durch eine Glucokinase phosphoryliert. Im<br />

Gegensatz zur Glucoseaufnahme über das Phosphotransferase-System wird dabei kein<br />

Phosphoenolpyruvat verbraucht. Eine verbesserte Bereitstellung dieses Vorläufermetaboliten<br />

sollte zu einer höheren L-Phenylalanin-Produktion führen.<br />

Die Kapazität der Glucoseaufnahme der Zellen mit heterologem Glucoseaufnahmesystem<br />

war sowohl für das Wachstum als auch die Produktion der Stämme essenziell. Daher<br />

sollte der Einfluss der Glucosekonzentration sowie der Einfluss der Induktion auf die Produktion<br />

untersucht werden. Da die Glucoseaffinität der beiden Glucoseaufnahmesysteme<br />

unterschiedlich ist (Phosphotransferase-System: Km=3–10 µmol/l [Postma u. a. 1993];<br />

Glucose-Facilitator: Km=4,1 mmol/l [Weisser 1996]) war es möglich, dass der Einfluss<br />

der Glucosekonzentration bei beiden Systemen unterschiedlich war. Durch intensive<br />

Prozessanalytik sollte das Verständnis der ablaufenden Stoffwechselvorgänge verbessert<br />

werden. Der beste L-Phenylalanin-Produzent sollte für die weiteren Arbeiten zur Prozessverbesserung<br />

verwendet werden.<br />

2. Einfluss von Prozessparametern und Identifizierung einer Limitierung oder<br />

Inhibierung der L-Phenylalanin-Produktion<br />

In Vitro-Experimenten zufolge war die Enzymaktivität der L-Tyrosin-sensitiven DAHP-<br />

Synthase (AroF), dem Eingangsenzym der Aromatenbiosynthese, bei einer Temperatur<br />

von 33 o C höher als bei 37 o C [Jossek 2000]. Dagegen ist das Wachstum von E. <strong>coli</strong> bei<br />

einer Temperatur von 37 ◦ C optimal. Bei niedrigerer Temperatur laufen chemische und<br />

enzymatische Reaktionen in der Zelle langsamer ab. Der pH-Wert beeinflusst ebenfalls<br />

die Reaktionsraten verschiedenster Reaktionen und Enzyme [Ingraham und Marr 1996].<br />

Unter Verwendung des besten L-Phenylalanin-Produzenten sollte daher der Einfluss<br />

der Prozessparameter Temperatur und pH-Wert auf den Fermentationsprozess und die<br />

L-Phenylalanin-Produktion untersucht werden.<br />

In der Arbeit von Gerigk wurde deutlich, dass die Produktbildung während des Prozesses<br />

nach 30-40 Stunden abnahm und in einigen Experimenten sogar abbrach [Gerigk 2001]. Als<br />

Ursache war eine Inhibierung der Produktion durch hohe L-Phenylalanin-Konzentrationen<br />

anzunehmen, aber auch eine Inhibierung oder Limitierung durch Mediumkomponenten<br />

oder eine Kombination mehrerer Einflussgrößen war möglich. Um die Einflüsse genauer<br />

zu untersuchen, sollten sowohl Untersuchungen zum Einfluss von Mediumbestandteilen als<br />

auch zum Einfluss hoher L-Phenylalanin-Konzentrationen auf die Produktion durchgeführt<br />

werden.<br />

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