Zellbiologie & Imaging - Laborwelt

Blitzlicht Zellbasierte Assays
A B
C
5x
Das Problem Meniskusbildung
Sowohl Tube Formation- als auch Sprouting-
Assays werden auf Gelmatrizes durchgeführt,
wobei meist BD Matrigel TM von Becton Dickinson
verwendet wird. Aufgrund der hohen Kosten
für die Gelmatrix und der Parallelisierung
wird angestrebt, den Test in möglichst kleinen
Wells durchzuführen.
Allerdings tritt im Fall kleiner Wells ein
störender Meniskus auf. Dieser führt einerseits
zu einer ungleichmäßigen Zellverteilung
durch Zellkonzentration in der Mitte
des Wells. Andererseits liegen die Zellen
auf einer gekrümmten Oberfläche, was eine
scharfe mikroskopische Abbildung aller Zellen
zugleich unmöglich macht (Abb. 2). Die automatisierte
Bildverarbeitung wird dadurch
drastisch aufwendiger.
Ein möglicher Lösungsansatz ist es, Bilder
in verschiedenen Fokusebenen aufzunehmen,
um danach die jeweils scharfen Bereiche der
Bilder zu einem Bild zusammenzusetzen. Um
das Meniskusproblem selbst zu verringern,
bleibt bisher nur die Verwendung von größeren
Wells, zum Beispiel von 6 Well- oder
35 mm-Petrischalen. In diesem Fall vergrößert
sich allerdings der Matrigeleinsatz pro Well
–in 96-Well-Platten ca. 100 µl – um ein Vielfaches.
Bei der Verwendung von 100 µl pro Well
entstehen bereits Matrigelkosten von rund
300 Euro für eine 96-Well-Platte. Hier gilt es,
zwischen hohen Kosten einerseits und starker
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Abb. 2: Bei der Durchführung von Angiogenese-Assays in einfachen Töpfen erzeugt das eingefüllte
Gel einen Meniskus (A), so dass die Zellen in unterschiedlichen Fokusebenen liegen.
Die „well-in-a-well“-Struktur des µ-Slide Angiogenesis (B) verhindert durch vollständiges
Auffüllen des inneren Wells mit Gel die Bildung eines Meniskus. Mikroskopische Bilder, die
in Standard-Wells aufgenommen sind, enthalten ohne Software-seitige Nachbearbeitung
zugleich scharfe und unscharfe Bereiche (C). Wird der Assay in der neuen Struktur durchgeführt,
befinden sich alle Zellen in einer Fokusebene und können dadurch gleichzeitig scharf
abgebildet werden. Bilder m. freundlicher Genehmigung v. Peter Nelson, LMU München
0,8 mm
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Meniskusbildung, also schlechter Optik und
inhomogener Zellverteilung andererseits,
einen Kompromiss zu finden.
Zellmedium (50 µl)
Gelmatrix (10 µl)
4 mm
5 mm
26 | 9. Jahrgang | Nr. 3/2008 LABORWElT
1 mm
Abb 3: Das objekträgergroße µ-Slide Angiogenesis
enthält 15 „Well-in-a-Well“-
Strukturen. Wird das kleinere Well
vollständig mit Gel (10 µl) gefüllt,
benötigt das Objektiv einen Arbeitsabstand
von mindestens 1 mm. Sollte der
Meniskus an der Luft-Mediumgrenzfläche
z.B. für Phasenkontrastaufnahmen
stören, kann dieser durch vollständiges
Füllen des großen Töpfchens
(50 µl) vermieden werden. Ohne Gel
können auch hochauflösende Objektive
(z.B. 100x-Ölimmersion) zur Zellbeobachtung
verwendet werden.
Die Lösung: Well-in-a-Well
Mit einem geometrischen Trick lässt sich die
Meniskusbildung des Gels jedoch verhindern
und zugleich 90% des zu verwendenden Gel-
Materials einsparen. Dazu wird ein kleineres
Well mit 4 mm Durchmesser und 0,8 mm
Tiefe – also 10 µl Volumen – in einem größeren
Well mit 5 mm Durchmesser untergebracht.
Wird das kleinere Well komplett mit dem Gel
befüllt, bildet dieses eine flache Oberfläche.
Zellen und sich auf der Geloberfläche bildende
Zellstrukturen liegen damit in derselben
optischen Fokusebene und können einfach
und gleichzeitig scharf abgebildet werden.
Durch Verwendung eines deckglasdicken
Bodens beträgt die Gesamthöhe im Falle des
komplett gefüllten Wells etwa 1 mm und ist
damit mit handelsüblichen 10x-, 20x- und
40x-Objektiven mikroskopierbar.
Für andere Anwendungen können zudem
durch geringere oder größere Füllvolumen
möglicherweise erwünschte Menisken
hergestellt werden, zum Beispiel um wenige
Zellen in der Mitte des kleinen Wells
zu konzentrieren. Dazu würde lediglich
5 µl des Gels eingesetzt werden, um den
Zellen eine biokompatible und schalenförm -
ige Geloberfläche zu präsentieren. Die „Wellin-a-Well“-Idee
könnte auch ihren Platz in
der dreidimensionalen Zellkultur finden,
indem die Zellen nicht auf dem Gel, sondern
in der Gelmatrix ausgesät werden. Dabei ist
die homogene Dicke der Gelmatrix von nur
0,8 mm von Vorteil, weil sie eine gleichmäßige
Versorgung mit Nährstoffen gewähr -
leistet.
Fünfzehn dieser Well-in-a-well-Strukturen
sind im µ-Slide Angiogenesis von ibidi umgesetzt.
Das „well-in-a-well“ Prinzip bietet auch
großes Potential bei der Durchführung von
Screenings im Angiogenesebereich, da sich
gerade hier die Vorteile wie Kosteneinsparung
und vereinfachte Automatisierung der
Bildverarbeitung besonders stark bemerkbar
machen.
Das µ-Slide Angiogenesis wurde in enger
Zusammenarbeit mit Stefan Zahler
vom Center of Drug Research des Instituts
für pharmazeutische Biologie der Ludwig
Maximilians-Universität München entwickelt.
Korrespondenzadresse
Dr. Ulf Rädler
ibidi GmbH
Am Klopferspitz 19
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