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Proteomics � W I S S E N S C H A F T Präparative Aufreinigung von Organellen mit Immuno-FFE Markus Islinger 1 , Heribert Mohr 1 , Alfred Völkl 1 , Anatomie und Zellbiologie, Universität Heidelberg; Gerhard Weber, Christoph Eckerskorn; BD Diagnostics, Martinsried Als trägerfreie Separationstechnik unter kontinuierlichem Durchfluß bietet die Free-Flow- Elektrophorese (FFE) ein breites Applikationsspektrum bei der Trennung von biologischem Probenmaterial wie Peptiden, Proteinen, Proteinkomplexen bis zu vollständigen, intakten Zellorganellen. Hierbei spielt vor allem die hohe Modularität des Systems hinsichtlich der verwendeten Trennprinzipien eine ausschlaggebende Rolle: So bieten sich Zonenelektrophorese, isoelektrische Fokussierung oder Isotachophorese als separierendes Prinzip an. Darüber hinaus besteht jedoch die Möglichkeit, die hohe Affinität von Antigen-Antikörper-Reaktionen für die Isolierung von Einzelsubstanzen aus komplexen biologischen Gemischen zu nutzen. Diesbezüglich stellt die Technik der Immuno-Free-Flow-Elektrophorese eine effektive Methode dar, intakte Organellen aus Zellhomogenaten zu isolieren, die – wenn überhaupt – sonst nur durch aufwendige Zentrifugationsverfahren anzureichern sind. Die überraschend niedrige Anzahl von Genen in den Genomen höherer Organismen legt ein komplexes Regulationswerk auf der Ebene der Proteinexpression innerhalb einer Zelle nahe, das eine Gesamtanzahl von mehreren hunderttausend Proteinspezies erwarten läßt. In dieser Hinsicht steht die Proteomforschung vor der Aufgabe, nicht nur die Gesamtheit der in einem Organismus auftretenden Genprodukte zu erfassen, sondern auch zwischen funktionell unterschiedlichen Spleißvarianten und posttranlationalen Modifikationen, wie Phosphorylierungen und Glycosylierungen zu unterscheiden. Die zunehmende Automatisierung der massenspektrometrischen Proteinanalytik erlaubt es zwar mittlerweile, Proteine in hohem Durchsatz zu identifizieren und zu quantifizieren, jedoch erfordert der hohe dynamische Bereich in der Abundanz unterschiedlicher Proteine meist eine vorangehende Probenfraktionierung, um auch gering vertretene, aber potentiell physiologisch bedeutende Proteine zu erfassen. Diesbezüglich bietet die Isolierung von Organellen die Möglichkeit, Zellen nicht nur effektiv zu fraktionieren, sondern auch identifizierte Proteine einer für das Organell spezifischen Aufgabe zuzuordnen und so erste Hinweise auf die Funktion bisher noch unbekannter Proteine zu gewinnen. Meist werden Organellen auf klassische Weise über mehrere differentielle Zentrifugationsschritte und/oder Dichtegradientenzentrifugation gewonnen. Jedoch führen diese Verfahren häufig zu Materialverlusten und -veränderungen aufgrund der hohen mechanischen Belastungen während des Trennprozesses. Darüber hinaus erlauben sie keine befriedigende Isolierung von Organellpopulationen mit ähnlicher Dichte. Als kon- Abb. 1: BD Free Flow Electrophoresis- System Abb. 2: a) Abtrennung eines peroxisomalen Peaks von der Hauptmasse der Organellen. Die IFFE wurde mit einer D-Fraktion der Rattenleber nach vorheriger Inkubation mit peroxisomalem Membranantikörper (anti-PMP70) durchgeführt. b) Negativkontrolle einer Zonen- FFE ohne vorherige Antikörperinkubation, Es treten zwar Anreicherungen auf, jedoch keine deutlich voneinander getrennten Einzelpeaks. Die Farben verdeutlichen Fraktionen mit überwiegender Anreicherung folgender Organellen im Trennprofil: gelb – Mikrosomen, grün – Mitochondrien, rot – Peroxisomen. tinuierliches, rein auf flüssigen Trennphasen basierendes Verfahren stellt die Free-Flow- Elektrophorese (FFE) in beiderlei Hinsicht eine Alternative zu herkömmlichen Trennmethoden dar. Sie arbeitet nach dem Prinzip einer trägerfreien Elektrophorese, bei der der Trennprozeß in Abwesenheit einer festen Matrix stattfindet, wie beispielsweise Acrylamid in der Gelelektrophorese. Statt dessen werden Analyte in einem kontinuierlichen laminaren Fluß von Pufferlösungen durch ein dazu senkrecht angelegtes elektrisches Feld entsprechend ihrer Ladung und Mobilität aufgetrennt (Abb. 1). In den vergangenen Jahren konnten in der Tat unterschiedliche Zellorganellen wie Mitochondrien 1 , Melanosomen 2 , sekretorische Vesikel 3 oder Endosomen 4 über klassische Zonenelektrophorese gereinigt werden. Aufgrund der teilweise hohen Ladungsheterogenität von Zellorganellen und ihrer Ähnlichkeit in anderen physikalischen Eigenschaften bleiben solche Fraktionen abhängig vom Ausgangsgewebe jedoch häufig weiterhin mit anderen Organellpopulationen verunreinigt. Antigen-An- Kennziffer 20 LW 06 · www.biocom.de � 24 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT
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