BVDV-Diagnostik aus Ohrstanzproben – ELISA und Real time

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BVDV-Diagnostik aus Ohrstanzproben – ELISA und Real time

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

BVDV-Diagnostik BVDV Diagnostik anhand

von Ohrstanzproben

ELISA und Real time RT-PCR RT PCR

im Vergleich

R. Fux 1 , C. Baudy 1 , I. Moßbrugger 1 , M. Hellwig 2 ,

R. Birlbauer 2 und G. Wolf 1

1 Institut für Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und

Seuchenmedizin, LMU München

2 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und

Lebensmittelsicherheit (LGL), Oberschleißheim


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

BVDV-Diagnostik BVDV Diagnostik anhand

von Ohrstanzproben

ELISA und Real time RT-PCR RT PCR im Vergleich

�� „Münchener nchener Modell“ Modell zur BVDV-Tilgung

BVDV Tilgung

�� Warum Ohrstanzen?

�� Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR RT PCR

�� im Laborversuch (definiertes Probenmaterial)

�� im Feldversuch (Bayerische Pilotstudie 06/07)

�� Fazit

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

BVDV-Infektionen

BVDV Infektionen

�� Postnatale Infektionen

�� Intrauterine Infektionen

�� Persistente Infektionen (PI)

Infektionen (PI)

�� fetale Infektion im ersten Trimester

�� Immuntoleranz & lebenslange Virämie Vir mie

�� Kümmern mmern

�� Mucosal Disease

�� meist aber völlig llig unauffällig unauff llig!!! !!!

�� lebenslange Ausscheidung des BVDV

→ wichtigste Transmissionsquelle

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


Münchener nchener I. Modell:

Leipziger Labor Diagnostik Symposium

BVDV-Nachweis BVDV Nachweis im neugeborenen Kalb als

einziges Primärdiagnostikum

Prim rdiagnostikum für r eine Tilgung !

NPI NPI

negativer BVDV-Nachweis:

Kalb und Mutter lebenslang NPI

Info über Datenbank/Tierpass

positiver BVDV-Nachweis:

vorläufig PI, Verbringungsregelung,

PI-Bestätigung, Schlachtung

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

Untersuchung

der Mutter

GW 1/04


Voraussetzungen I. Leipziger Labor „Münchener

Diagnostik Symposium

Jedes neugeborene Kalb ist zu testen,

BVDV-PI Tiere werden sicher erkannt und

Mütter positiver Kälber sind zu testen

(korrekte HI-Tier Zuordnung).

absolute Handelsrestriktion für PI-Tiere

(Schlachtung oder TBA)

freier Handel nur für NPI-Tiere

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

nchener Modell“ Modell


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Tilgungsfortschritt „Münchener Modell“

% definierte NPI-Rinder

100

80

60

40

20

0

%PI

0,8

0,6

0,4

0,2

Tilgung Überwachung

| | | | | | | | | | | | |

. Start 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Jahre

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Warum Ohrstanzen?

Ohrstanzen

�� Statusdefinition (PI/NPI) bevor Kälber K lber in den

Handel kommen

→ innerhalb der ersten 14 Lebenstage

�� frühe fr he und günstige g nstige Probennahme

→ durch den Landwirt im Rahmen der Tiermarkierung

�� Diagnostische Lücke L cke

�� Versagen von „klassischen klassischen“ Nachweisverfahren (VI,

AG-ELISA, AG ELISA, IF) bei der Testung von Blutproben junger

PI Kälber K lber

�� bedingt durch die Aufnahme kolostraler Antikörper Antik rper

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

BVDV-PI: Diagnostische Lücke bei Blutproben

0 1 2 3 4 5 6 7 .10...14......30…..40.......60......90.. p.p.

E

BVDV-Isolierung 10-----------30

PCR Serum ?3--------------------------------40?

PCR Leukos keine Lücke bei Einzelproben

rns 1------------------------------------------------60

NS2/3 (1)..3---------------------------------------------------90..(200)

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR RT PCR

„Entwicklung Entwicklung und Prüfung Pr fung einer Analytik zum

Nachweis BVDV-infizierter BVDV infizierter Kälber K lber mittels

Ohrstanzproben, die im Rahmen der

Tiermarkierung gewonnen werden“ werden

Projekt: 04HS040, BMELV

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR RT PCR

�� homologe Probenserien genau definierter

PI Tiere (Stamm, Infektionszeitpunkt, kolostrale AK

Untersuchungen von:

(Stamm, Infektionszeitpunkt, kolostrale AK…)

�� Untersuchungen von:

�� NS3 ELISAs

�� E rns ELISAs

�� Real time RT-PCR RT PCR (5‘UTR) (5 UTR)

�� Untersuchungsschwerpunkte:

�� Gewebelyse, Gewebelyse,

Freisetzung des Analyten, Isolierung

�� Analytische Sensitivität Sensitivit

�� Einfluss kolostraler Antikörper Antik rper

�� Stabilität Stabilit t der nachzuweisenden Viruskomponenten

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


AG-Titer

70

60

50

40

30

20

10

0

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Sensitivität Sensitivit t der ELISAs

NS2/3 NS2/3 NS2/3 AG-Mix polyklonal Erns

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Sensitivität Sensitivit t der Real time RT-PCR RT PCR

�� RNA-Freisetzung

RNA Freisetzung

�� enzymatisch

�� mechanisch

Ct-Wert

40

35

30

25

20

enzymatisch

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

B C D E K

PI-Tiere

mechanisch


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Sensitivität Sensitivit t der Real time RT-PCR RT PCR

�� RNA-Freisetzung

RNA Freisetzung

�� RNA-Isolierung

RNA Isolierung

Ct-Wert

40

35

30

25

20

A J A J A J A J A J A J A J

H igh P ure R N A

Iso latio n Kit

(R oche)

High P ure Viral

R N A Kit (R o che)

High P ure R N A

T issue Kit

(R o che)

RN easy M ini Kit

(QIA GEN )

RNA-Isolierungs-Kit

R N easy F ibro us

T issue Kit

(QIA GEN )

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

RN easy Lipid

T issue Kit

(QIA GEN)

peqGOLD T riF ast

(peqLab)


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Sensitivität Sensitivit t der Real time RT-PCR RT PCR

�� RNA-Freisetzung

RNA Freisetzung

�� RNA-Isolierung

RNA Isolierung

35

�� PCR-Assay PCR Assay

C t-W ert

30

25

20

Hoffmann, 2006

Gaede, 2005

PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2 PCR 1 PCR 2

B C E K

PI-Tier / PCR

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

PI-Tiere PI Tiere in der kolostralen Phase

präkolostrale

postkolostrale

Kalb Blutprobe

Euthanasie Blutprobe

NS2/3-positive Tag NS2/3-positive SNT-Titer

Lym. Mye. Lym. Mye.

A 35% 30% 9 0,7% 0,2% > 2900

B 56% 46% 13 0,3% 0,4% > 2900

C 57% 48% 5 6,5% 9,0% 2299

D 60% 49% 8 3,3% 3,5 724

E 49% 42% 7 37% 67% < 10

F 43% 38% 9 39% 47% < 10

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


OD-Wert

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

PI-Tiere PI Tiere in der kolostralen Phase

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

-0.5

NS2/3

uv 1:4 1:16 1:64

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

AK-Titer 2900


AG-Titer

160

120

80

40

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

PI-Tiere PI in der kolostralen Phase

0

Tiere in der kolostralen Phase

E rns

AK-Titer >2900 AK-Titer 2900 bis 10 AK-Titer < 10

PI Tiere

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


Ct-W ert

40

30

20

10

0

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

PI-Tiere PI Tiere in der kolostralen Phase

Real time RT-PCR RT PCR

AK-Titer >2900 AK-Titer 2900 bis 10 AK-Titer < 10

PI Tiere

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Kolostrale Phase bei Ohrstanzen/Hautbiopsie

0 1 2 3 4 5 6 7 .10..14......30...40..........60.....90.. p.p.

NS2/3 1-------------------------------------------------------90..(200)

E

PCR keine Lücke

rns ?keine Lücke?

Immunhistologie keine Lücke

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


OD-Wert

1.5

1

0.5

0

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Lagerungstemperaturen NS3

Kurvenmittel (n=8)

uv 1:4 1:16 1:64

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

50°C

37°C

RT

-20°C

positiv

negativ


OD-Wert

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Lagerungstemperaturen E rns

Kurvenmittel (n=8)

uv 1:4 1:16 1:64

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

50°C

37°C

RT

-20°C

positiv

negativ


Ct-Wert

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Lagerungstemperaturen

40

35

30

25

20

Real time RT-PCR RT PCR

50°C 37°C 23°C 4°C -20°C

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR RT PCR

NS3

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

E rns 5‘UTR UTR

� Sensitivität: +/- + +++

� Freisetzung: + +++ +

� Stabilität: - + +++

� kolostrale AK: - + +++


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR RT PCR

„Studie Studie zur Eignung der

"Ohrstanzmethode" bei neugeborenen

Kälbern lbern zur Bekämpfung Bek mpfung der BVD/MD

(Bovine Virusdiarrhoe/Mucosal Disease)“ Disease)

(1205 54761-05 54761 05-10) 10)

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR RT PCR

� Diagnostische Sensitivität und Spezifität

BVDV-E rns ELISA und

BVDV-PCR im Poolverfahren

� Präanalytik

� Gewebegewinnung durch Landwirte

� Probenqualität

� Akzeptanz des Verfahrens

� Rückmeldungen

� Abgabe frühzeitig definierter PI-Tiere

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


Feldstudie I. Leipziger Labor Bayern Diagnostik Symposium 2006/07

~ 300 PI, 100% detektiert >Sensitivität >99% (α=5%)

Betriebsauswahl > Angebot an Hoftierarzt / Landwirt

HOFTIERARZT

+ + + + + + +

LGL LMU

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

EDTA-Blut

Untersuchung im Alter von über 90 Tagen mit EDTA-Blut


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Vergleich von ELISA und Real time RT-PCR RT PCR

Feldstudie Bayern 2006/07

�� LGL Oberschleißheim

Oberschlei heim

�� HerdChek BVDV

Antigen/Serum Plus

(IDEXX)

�� automatisiertes Verfahren

�� Antigen-Solubilisierung

Antigen Solubilisierung im

Stanzgefäß Stanzgefäß

�� Kontrolle der Probe nur

bedingt möglich m glich

�� Institut für f r Medizinische

Mikrobiologie, LMU

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

�� mechanische Freisetzung

mittels Laborschwingmühle

Laborschwingm hle

�� RNA Isolierung mit Fibrous

Tissue Mini Kit (QIAGEN)

�� Primer und Sonde nach

Hoffmann, 2006: 5‘UTR 5 UTR als

Zielstruktur

�� RT-PCR RT PCR mit QuantiTect

QuantiTect

Probe RT-PCR RT PCR Kit (QIAGEN)


�� Öffnen ffnen des

Probengefäß

Probengefäßes

es

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Durchführung

Durchf hrung PCR

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


�� Öffnen ffnen des

Probengefäß

Probengefäßes

es

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Durchführung

Durchf hrung PCR

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


�� Öffnen ffnen des

Probengefäß

Probengefäßes

es

�� Entnahme und

Begutachtung der

Probe

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Durchführung

Durchf hrung PCR

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Durchführung

Durchf hrung PCR

�� Öffnen ffnen des

Probengefäß

Probengefäßes

es

�� Entnahme und

Begutachtung der Probe

�� Überf berführung hrung in

Collection Microtube

(enthält (enth lt bereits Puffer und

Stahlkugel)

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Durchführung

Durchf hrung PCR

�� Öffnen ffnen des

Probengefäß

Probengefäßes

es

�� Entnahme und

Begutachtung der Probe

�� Überf berführung hrung in Collection

Microtube

�� Probenzerkleinerung

Laborschwingmühle

Laborschwingm hle

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Durchführung

Durchf hrung PCR

�� Öffnen ffnen des

Probengefäß

Probengefäßes

es

�� Entnahme und

Begutachtung der Probe

�� Überf berführung hrung in Collection

Microtube

�� Probenzerkleinerung in

Laborschwingmühle

Laborschwingm hle

�� Poolung des

Homogenats

(12er Pool)

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Durchführung

Durchf hrung PCR

�� Öffnen ffnen des

Probengefäß

Probengefäßes

es

�� Entnahme und

Begutachtung der Probe

�� Überf berführung hrung in Collection

Microtube

�� Probenzerkleinerung in

Laborschwingmühle

Laborschwingm hle

�� Poolung des Homogenats

(12er Pool)

�� RNA-Isolierung

RNA Isolierung

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


Anzahl Proben

70

60

50

40

30

20

10

0

Ohrgewebe: E rns

ELISA

rns ELISA

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Cut off

Tierstatus (Blut)

,015 ,06 ,105 ,15 ,195 ,24 ,285 ,40 ,55 ,70 ,85 1,0 1,6 2,2 2,8 3,4 >3,5

OD

persistent infiziert: 156

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

nicht PI (transient inf.): 19

nicht PI: 3121

86

Stand:

18.6.07


Ohrgewebe: I. Leipziger Labor Diagnostik 5‘UTR 5 UTR Symposium PCR

N=8665; 7220 über 12er Pools negativ; Einzelproben: 635 kein Ct; 310 Ct

Anzahl Proben

25

20

15

10

5

0

persistent infiziert

147 Kälber

nicht PI (transient inf.)

16 Kälber

18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42

Ct-Wert

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

nicht PI

106 Kälber

PI Tiere mit negativem PCR-Ergebnis (Pool & einzeln): 0

Stand:

18.6.07


Ohrgewebe: I. Leipziger Vergleich Labor Diagnostik E Symposium rns ELISA / PCR

OD Erns (IDEXX)

>=3,5

1,0

0,1

,01

Cut off

BVDV PCR

Ct-Wert


Sensitivität Sensitivit I. Leipziger t und Labor Spezifität Spezifit Diagnostik Symposium t ELISA / PCR

Tierstatus

(„Goldstandard“ Blut)

persistent BVDV infiziert

nicht-PI

Sensitivität

PI-prädiktiver Wert

Spezifität NPI (ca.)

Sensitivität

Ohrgewebe A

E

POS NEG

151 5

13 3109

rns ELISA

96,8%

92,1%

99,8%

(93,1-98,7)

Berechnung nach der Binomialverteilung

100%

99%

98%

97%

96%

95%

94%

93%

92%

91%

90%

89%

88%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

OGW-Test negativ bei 150 PI-Kälbern

10

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

Ohrgewebe B

Pool-PCR

POS NEG

147 0

122 2820

100% (>98,0)

55%

98,5%

obere Grenze

rel. Häufigkeit

untere Grenze

Stand:

18.6.07


Sensitivität I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Sensitivit und verbleibende PI

t und verbleibende PI-Kälber lber

1 Mio. Geburten (~Bayern); 0,5% BVDV PI-Kälber: N=5000

Sensitivität des Tests 0% 96,5% 99,9%

nicht detektierte PI‘s 5000 175 5

weibliche Zuchtkälber 1350 47 1

weibliche Mastkälber 1150 40 1

männlich Kälber 2500 88 3

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

ELISA PCR


�� ELISA:

I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Fazit

�� gut automatisierbar

�� (zu) geringe diagnostische Sensitivität? Sensitivit t?

�� PCR:

�� aufwendiger in der Probenaufbereitung

�� durch Pooluntersuchung kostengünstig

kosteng nstig

�� höchste chste diagnostische Sensitivität Sensitivit

�� vergleichsweise viele positive Ergebnisse von NPI

→ transiente Infektionen

→ Kontaminationen durch Kontakt mit PI

→ Laborkontaminationen

→ Impfungen

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007


I. Leipziger Labor Diagnostik Symposium

Herzlicher Dank gilt… gilt

�� den Landwirten und Tierärzten Tier rzten der Ohrgewebsstudie

�� den Mitarbeitern von:

�� den Sponsoren:

Bayerisches Landesamt

für Gesundheit und

Lebensmittelsicherheit,

Oberschleißheim

Bay. Staatsministerium

für Umwelt, Gesundheit

und Verbraucherschutz

Fux, Baudy, Moßbrugger, Hellwig, Birlbauer und Wolf 2007

Institut für Medizinische

Mikrobiologie, Infektionsund

Seuchenmedizin,

Tierärztliche Fakultät, LMU

Bayerische

Tierseuchenkasse

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