Serine Protease and Its Inhibitor

Serine Protease and Its Inhibitor
By 第四組
第四組

三個基本動作:
酵素基本反應機制
1、 Orientation 空間方向
2、 Acid-base Acid base transfer 化學轉移
3、 Bond Strain 構形扭曲

以上三種方式同時發生稱為
以上三種方式同時發生稱為協同式酵素催化
協同式酵素催化
(concerted set)
例: 例:Carboxypeptidase Carboxypeptidase A ,羧肽酶
若先後依序發生,稱
若先後依序發生,稱順序式酵素催化
順序式酵素催化
(sequential mechanism)
例: 例:Chymotrypsin
Chymotrypsin ,胰凝乳蛋白酶

Chymotrypsin Chymotrypsin 胰凝乳蛋白酶
胰凝乳蛋白酶

Chymotrypsinogen (inactive)
π-Chymotrypsin (active)
R15-I16
α-Chymotrypsin (active)
Trypsin
π-Chymotrypsin
S14-R15 T147-N148
L13 I16
Y146 A149
Disulfide bonds
245

Asp 102
His 57 Ser 195
催化鐵三角
Asp 194
Gly 193
+ NH3
Ile 16

O
C–O -
=
Asp 102
O
C–O–H
=
Asp 102
C
H–N N
His 57
H
C C
CH 2
His 57
H
H
C
N N–H
C C
CH 2
H
H–O–CH 2
Active Ser
- O–CH2
Ser
195
Ser
195

Chymotrypsin 催化步驟大約分成兩段
催化步驟大約分成兩段
(1) Acylation
(2) Deacylation

O
O -
C
Chymotrypsin 催化機制
Nitrophenol acetate
CH 3–C–O– –NO 2
CH 3COOH
O-H
C
Acylation
O
CH 3–C HO– –NO 2
+ H 2O
O
C
Deacylation (slow step)
Nitrophenol
Two-phase
reaction
Time (sec)
Kinetics of reaction

Acylation
1、Substrate Substrate peptide 進入活性區
檢查專一性位置
檢查專一性位置,確定水解位置
確定水解位置 (aromatic
amino acid)

2、Ser Ser-O- 攻擊 peptide 上面的 carbonyl 碳,
形成第一個過渡狀態。

3、Peptide Peptide bond 斷裂,His 斷裂, His 57 供給氫離
子,放出 free peptide N (N (N-端那一半 端那一半)

4、Peptide Peptide C 以 acylation 接在 Ser 195 上,
成為中間產物

O
-C N-
H
O -
-C N-
HO H
ES
-C-C-N-C-C-N-C-C-N-
H H
O -
-C N-
HO H
O
-C-OH
NH 2-

Deacylation
Deacylation
1、水分子進入活性區,結合在
、水分子進入活性區,結合在 His 57

2、水分子的氧攻擊上述
、水分子的氧攻擊上述 carbonyl 碳,形成
第二個過渡狀態,並把一個氫留在 His57

3、Ser Ser 195 放出所連結的peptide
放出所連結的 peptide,回復 ,回復
原來的活化狀態

pH pH值對酵素活性的影響
pH pH pH 值對酵素活性的影響
值對酵素活性的影響
pH 6 H
H pH 7
+
C
H–N N–H
O
C–O -
=
Asp 102
C C
H
H
C +
H–N N–H
His 57
C C-H
CH 2
H +
Inactive
H–O–CH 2
C
H–N N
Ser
195
C C
H

pH Influences Chymotrypsin Activity
Relative Activity
5 6 7 8 9 10 11
pH

常見抑制劑:
Inhibitor Inhibitor對酵素活性的影響
酵素活性的影響
TPCK (tosyl (tosyl-L-phenylalaninechloromethyl phenylalaninechloromethyl ketone )
DIFP (diisopropyl
(diisopropyl-fluorophosphate
fluorophosphate)
※DIFP DIFP 會與其上的 Ser 195 反應,然後形成
固定的鍵結,使得該酵素失去活性。

Chymotrypsin Ser195 Inhibited by DIFP
Diisopropyl-fluorophosphate (DIFP)
O
=
(CH 3) 2CH–O– P –O–CH(CH 3) 2
F
O - …H
CH 2
Ser 195
O
=
(CH 3) 2CH–O– P –O–CH(CH 3) 2
O
CH 2
Ser 195
X

Percent Inhibition of activity (%)
Addition of Substrate Blocks DIFP Inhibition
100
50
0
+ DIFP
+ DIFP & substrate
Reaction time
No substrate
X
Add substrate
S

Inhibitor Inhibitor - 沙林毒氣
沙林毒氣
沙林 沙林是一種神經毒氣,能使自主神經系統
沙林 是一種神經毒氣,能使自主神經系統
的交感神經與副交感神經立即失去平衡的
毒氣。

國考題 國考題 國考題 國考題
國考題 國考題 國考題
62. Chymotrypsin 催化水解蛋白質的胜肽鍵,
在催化官能基中,下列何者參與親核性催
化機制?
(A) Histidine 57
(B) Aspartate 102
(C) Serine 195
(D) Cysteine 201

78. 79.
Chymotrypsinogen
Chymotrypsinogen如何轉換成 如何轉換成Chymotrypsin
Chymotrypsin?
(A) 由protein protein kinase將Chymotrypsinogen
kinase Chymotrypsinogen磷酸化 磷酸化
(B) Chymotrypsinogen
Chymotrypsinogen與cAMP cAMP結合 結合
(C) Chymotrypsinogen
Chymotrypsinogen與鈣離子結合
與鈣離子結合
(D) Chymotrypsinogen
Chymotrypsinogen經由蛋白水解
經由蛋白水解
(proteolysis)
(E) 由原本二聚體(dimer)
由原本二聚體 (dimer)聚合為四聚体
聚合為四聚体(tetramer) (tetramer)

83. 何者是Chymotrypsin
何者是 Chymotrypsin之非可逆性抑制?
之非可逆性抑制?
(A) pp-nitrophenyl
nitrophenyl acetate
(B) Diisopropyl fluorophosphates
(C) tosyl tosyl-L-lysine lysine chloromethyl ketone
(D)EDTA

85. Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
為酵素 為酵素chymotrypsin
chymotrypsin之抑制劑,是因
之抑制劑,是因DIPF DIPF
與chymotrypsin
chymotrypsin內核者胺基酸做共價結合?
內核者胺基酸做共價結合?
(A) Asp
(B) His
(C) Ser
(D) Val
※催化鐵三角: His、Asp 、Ser