(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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음날, 펩티드를 가해, 이중으로 테스트하였다. 6일간의 배양 시간 후에, 세포 생존율을 셀타이터 (CellTiter)
96 솔루션 (Solution) (Promega)를 사용하여 측정하였다. 플레이트를 37℃에서 추가로 4 시간 동안
배양하였다. 접착 플레이트 시일러를 리드 대신에 사용하고, 시일링된 플레이트를 수회 전도시켜, 가용성 포르
마잔 생성물을 혼합하고, 몰레큘러 디바이스 Vmax 플레이트 리더를 사용하여, 플레이트를 490/560 nm에서 분광
광도법으로 리딩하였다.
항바이러스 활성의 예상 레벨을 나타내는 양성 대조군 화합물 간시클로비르의 평가에 기초한 전체 검정 성능은
유효하였다. 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 있어서의 세포의 거시적 관찰에 의해, MTS 대사성 염료로 세
포 염색을 행하여 얻어진 세포독성 결과를 확인하였다.
HCMV 검정 결과: 펩티드 1은 바이러스 대조 실험에 비해 HCMV 플라크 형성을 저해하지 않았다. 펩티드 2는 바이
러스 대조 실험에 비해 HCMV 플라크 형성을 2.9% 저해하였다. 펩티드 배합물은 상승 효과를 제공하지 않았다.
또한, 본 발명의 펩티드는 이들 인간 폐 세포에서 세포 생존성에 어떠한 유의적인 저해 효과도 나타내지
않았다.
실시예 4:
메티실린 내성 황색 포도상구균 (Staphylococcus Aureus) (MRSA) 검정
깨끗한 U-바텀 (bottom) 96 웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하여, 항균성 검정을 행하였다. 양이온으로 조
절된 뮬러-힌톤 배지 (Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth (MHB))를 MRSA를 테스트하는데 사용하였다. 이
중 실험으로, 본 발명의 펩티드 (각 0.1 ml - 10 ㎍/ml)를 웰에 분배하였다. 그 다음에, 웰에 5 × 10 5
CFU/mL
MRSA를 0.1 ml 용적으로 접종시켰다. 대조군용으로, 각 플레이트는 세균 접종원을 함유하지 않는 배지를 갖는
4개의 웰 및 접종원을 함유하나, 펩티드를 함유하지 않는 배지를 갖는 4개의 웰을 포함하였다. 플레이트를 37
℃에서 12 시간 동안 배양하여, 배양 후 18 내지 24 시간 동안 육안으로 리딩하였다. 처음에 MRSA의 성장 조절
을 조사하여, 배지 준비물 및 성장 조건의 적합성을 결정하였다. 허용 성장은 각 샘플 웰의 저부에서 세포의
≥ 2 mm 폭 버턴 (button) 또는 배양 상청액의 명백한 탁도로서 정의된다. 테스트 웰을 조사하여, 활성에 대하
여 포지티브/네가티브 스코어를 결정하였다. 활성에 대한 포지티브 스코어는 테스트 MRSA의 거시적 성장의 완
전 저해를 기초로 한다.
MRSA 검정 결과: 본 발명의 펩티드 및 펩티드 배합물은 MRSA의 증식에 저해 효과를 나타내지 않았다.
실시예 5:
녹농균 (Pseudomonas aeruginosa) 검정
깨끗한 U-바텀 96 웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하여, 항균성 검정을 행하였다. 양이온으로 조절된 뮬러-
힌톤 배지 (MHB)를 녹농균을 테스트하는데 사용하였다. 이중 실험으로, 본 발명의 펩티드 (각 0.1 ml - 10 ㎍
/ml)를 웰에 분배하였다. 그 다음에, 웰에 5 × 10 5
CFU/mL 녹농균을 0.1 ml 용적으로 접종시켰다. 대조군용
으로, 각 플레이트는 세균 접종원을 함유하지 않는 배지를 갖는 4개의 웰 및 접종원을 함유하나, 펩티드를 함유
하지 않는 배지를 갖는 4개의 웰을 포함하였다. 플레이트를 37℃에서 12 시간 동안 배양하여, 배양 후 18 내지
24 시간 동안 육안으로 리딩하였다. 처음에 녹농균의 성장 조절을 조사하여, 배지 준비물 및 성장 조건의 적합
성을 결정하였다. 허용 성장은 각 샘플 웰의 저부에서 세포의 ≥ 2 mm 폭 버턴 또는 배양 상청액의 명백한 탁
도로서 정의된다. 테스트 웰을 조사하여, 활성에 대하여 포지티브/네가티브 스코어를 결정하였다. 활성에 대
한 포지티브 스코어는 테스트 녹농균의 거시적 성장의 완전 저해를 기초로 한다.
녹농균 (Pseudomonas aeruginosa) 검정 결과: 본 발명의 펩티드 및 펩티드 배합물은 녹농균 (Pseudomonas
aeruginosa) 증식에 저해 효과를 나타내지 않았다.
실시예 6:
폐렴 연쇄상 구균 (Streptococcus pneumoniae) 검정
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공개특허 10-2010-0058551