(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

(51) Int. Cl. 

(19) 대한민국특허청(KR) 

(12) 공개특허공보(A) 

C07K 16/10 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) 

G01N 33/50 (2006.01) A61P 31/16 (2006.01) 

(21) 출원번호 10-2010-7014772 

(22) 출원일자(국제출원일자) 2008년12월08일 

심사청구일자 없음 

(85) 번역문제출일자 2010년07월02일 

(86) 국제출원번호 PCT/US2008/085876 

(87) 국제공개번호 WO 2009/079259 

국제공개일자 2009년06월25일 

(30) 우선권주장 

61/005,725 2007년12월06일 미국(US) 

61/091,599 2008년08월25일 미국(US) 

전체 청구항 수 : 총 75 항 

(54) 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 및 그의 이용 방법 

(57) 요 약 

(11) 공개번호 10-2010-0115346 

(43) 공개일자 2010년10월27일 

(71) 출원인 

다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 

미합중국, 매사추세츠 02115, 보스톤, 빈니 스트 

리트44 

더 번햄 인스티튜트 

미국 92037 캘리포니아주 라 졸라 노쓰 트레이 파 

인스 로드 10901 

(72) 발명자 

마라스코, 웨인, 에이. 

미국 02481 매사추세츠주 웰리슬리 라이스 스트리 

트 43 

수이, 지안후아 

미국 02120 매사추세츠주 보스턴 #212 트레몬트 

스트리트 1575 

리딩턴, 로버트, 씨. 

미국 92037 캘리포니아주 라 졸라 노쓰 토리 파인 

스 로드 10901 번햄 인스티튜트 포 메디컬 리서치 

(74) 대리인 

양영준, 양영환 

본 발명은 인플루엔자 바이러스를 중화시키는 인간 scFv 항체 및 모노클로날 항체를 제공한다. 상기 항체는 헤 

마글루티닌 (HA) 단백질의 줄기 영역내 에피토프를 인식한다. 또한, 본 발명은 조류 독감과 같은 인플루엔자 관 

련 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 인플루엔자에 대하여 환자에게 

백신을 접종하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 관련 질환 또는 장애를 진단하는 방법 및 샘플 

내 인플루엔자의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 

대 표 도 - 도7a 

- 1 - 

공개특허 10-2010-0115346

특허청구의 범위 

청구항 1 

인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (HA) 단백질의 줄기 영역내 에피토프에 결합하여 A형 인플루엔자 바이러스 

를 중화시키는 단리된 모노클로날 항체. 

청구항 2 

제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 그룹 I 인플루엔자 바이러스인 모노클로날 항체. 

청구항 3 

제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 H1 클러스터 인플루엔자 바이러스인 모노클로날 항체. 

청구항 4 

제3항에 있어서, 상기 H1 클러스터 인플루엔자 바이러스가 H1a 클러스터 인플루엔자 바이러스 또는 H1b 클러스 

터 인플루엔자 바이러스인 모노클로날 항체. 

청구항 5 

제1항에 있어서, 상기 에피토프가 비-선형인 모노클로날 항체. 

청구항 6 

제1항에 있어서, 상기 에피토프가 HA1 및 HA2 폴리펩티드를 포함하는 것인 모노클로날 항체. 

청구항 7 

제1항에 있어서, 에피토프가 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40, 291의 아미노산 및 HA2 폴리펩티드의 위치 18, 

19, 20, 21, 38, 41, 42, 45, 49, 52, 53 및 56의 아미노산을 포함하는 것인 모노클로날 항체. 

청구항 8 

제1항에 있어서, 바이러스 및 세포 막 융합을 억제하는 모노클로날 항체. 

청구항 9 

제1항에 있어서, HA 단백질에 대한 결합에 대하여 모노클로날 항체 D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, 

E90, 또는 H98과 경쟁하는 모노클로날 항체. 

청구항 10 

제1항에 있어서, 완전 인간 항체인 모노클로날 항체. 

청구항 11 

인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (HA) 단백질의 에피토프와 결합하여 A형 인플루엔자 바이러스를 중화시키 

는 단리된 scFv 항체. 

청구항 12 

제11항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 그룹 I 인플루엔자 바이러스인 항체. 

청구항 13 

제11항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스가 H1 클러스터 인플루엔자 바이러스인 항체. 

청구항 14 

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공개특허 10-2010-0115346

제13항에 있어서, 상기 H1 클러스터 인플루엔자 바이러스가 H1a 클러스터 인플루엔자 바이러스인 항체. 

청구항 15 

제11항에 있어서, 상기 에피토프가 비-선형인 항체. 

청구항 16 

제11항에 있어서, 에피토프가 HA1 및 HA2 폴리펩티드를 포함하는 것인 항체. 

청구항 17 

제11항에 있어서, 에피토프가 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40, 291의 아미노산 및 HA2 폴리펩티드의 위치 

18, 19, 20, 21, 38, 41, 42, 45, 49, 52, 53 및 56의 아미노산을 포함하는 것인 항체. 

청구항 18 

제11항에 있어서, 바이러스 및 세포 막 융합을 억제하는 항체. 

청구항 19 

제11항에 있어서, HA 단백질에 대한 결합에 대하여 모노클로날 항체 D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, 

E90, 또는 H98과 경쟁하는 모노클로날 항체. 

청구항 20 

인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 질환 또는 장애를 앓을 위험이 있는 사람에게 치료 유효량의 제1항의 모노 

클로날 항체 또는 제11항의 scFv 항체를 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 질환 또 

는 장애를 예방하는 방법. 

청구항 21 

제20항에 있어서, 항-바이러스 약물, 바이러스 진입 억제제 또는 바이러스 부착 억제제를 투여하는 것을 추가로 

포함하는 방법. 

청구항 22 

제21항에 있어서, 상기 항-바이러스 약물이 뉴라미니다제 억제제, HA 억제제, 시알산 억제제 또는 M2 이온 채널 

인 방법. 

청구항 23 

제22항에 있어서, 상기 M2 이온 채널 억제제가 아만타딘 또는 리만타딘인 방법. 

청구항 24 

제22항에 있어서, 상기 뉴라미니다제 억제제가 자나미비르, 또는 오셀타미비르 포스페이트인 방법. 

청구항 25 

제20항 또는 제21항에 있어서, 그룹 I 인플루엔자 바이러스에 특이적인 2종 이상의 항체를 투여하는 것을 포함 

하는 방법. 

청구항 26 

제20항, 제21항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 그룹 II 인플루엔자 바이러스에 특이적인 항체를 투여하는 

것을 추가로 포함하는 방법. 

청구항 27 

공개특허 10-2010-0115346 

제20항에 있어서, 인플루엔자 바이러스에 대한 노출 이전 또는 이후에 상기 항체를 투여하는 방법. 

- 3 -

청구항 28 

제20항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스를 중화시키기에 충분한 투여량으로 상기 항체를 투여하는 방법. 

청구항 29 

인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 질환 또는 장애를 앓을 위험이 있는 사람에게 치료 유효량의 제1항의 모노 

클로날 항체 또는 제11항의 scFv 항체를 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 질환 또 

는 장애를 치료하는 방법. 

청구항 30 

제29항에 있어서, 항-바이러스 약물, 바이러스 진입 억제제 또는 바이러스 부착 억제제를 투여하는 것을 추가로 

포함하는 방법. 

청구항 31 


인 방법. 

청구항 32 


청구항 33 


청구항 34 

제29항 또는 제30항에 있어서, 그룹 I 인플루엔자 바이러스에 특이적인 2종 이상의 항체를 투여하는 것을 포함 

하는 방법. 

청구항 35 

제29항, 제30항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 그룹 II 인플루엔자 바이러스에 특이적인 항체를 투여하는 

것을 추가로 포함하는 방법. 

청구항 36 

제29항에 있어서, 인플루엔자 바이러스에 대한 노출 이전 또는 이후에 상기 항체를 투여하는 방법. 

청구항 37 

제29항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스를 중화시키기에 충분한 투여량으로 상기 항체를 투여하는 방법. 

청구항 38 

제1항의 모노클로날 항체 또는 제11항의 scFv 항체 및 담체를 포함하는 조성물. 

청구항 39 

제38항에 있어서, 항-바이러스 약물, 바이러스 진입 억제제 또는 바이러스 부착 억제제를 추가로 포함하는 조성 

물. 

청구항 40 


인 조성물. 

청구항 41 

- 4 - 

공개특허 10-2010-0115346


청구항 42 


청구항 43 

제38항에 있어서, 그룹 I 인플루엔자 바이러스에 특이적인 1종 이상의 항체를 추가로 포함하는 조성물. 

청구항 44 

제38항, 제39항 및 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 그룹 II 인플루엔자 바이러스에 특이적인 항체를 추가로 포 

함하는 조성물. 

청구항 45 

고체 표면에 고정된 트리메릭 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 시험 항체와 접촉시키고, HA 단백질-항체 복합체를 

검출하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 특이적인 항체를 확인하는 방법. 

청구항 46 

제45항에 있어서, 상기 고체 표면이 플라스틱인 방법. 

청구항 47 

제45항에 있어서, 상기 HA 단백질이 비-포유동물 세포에서 생산되는 것인 방법. 

청구항 48 

제45항에 있어서, 상기 HA 단백질이 곤충 세포에서 생산되는 것인 방법. 

청구항 49 

제45항에 있어서, 상기 HA 단백질이 야생형 HA 단백질에 비해 개질된 글리코실화를 포함하는 것인 방법. 

청구항 50 

제45항에 있어서, 상기 HA 단백질을 상기 고체 표면에 고정시켜 상기 HA 단백질의 구형 헤드(globular head)를 

차폐(mask)하는 방법. 

청구항 51 

(a) 단일 쇄 또는 Fab 발현 라이브러리를 고체 표면에 고정된 트리메릭 헤마글루티닌 (HA) 단백질에 

노출시키고, (b) 상기 단백질과 특이적으로 결합하는 상기 라이브러리내 항체를 확인하고, (c) 라이브러리로부 

터 항체를 단리하는 것을 포함하는, 상기 HA 단백질과 특이적으로 결합하는 단리된 항체의 제조 방법. 

청구항 52 


청구항 53 

제51항에 있어서, 상기 HA 단백질이 비-포유동물 세포에서 생산되는 것인 방법. 

청구항 54 


청구항 55 

공개특허 10-2010-0115346 

제51항에 있어서, 상기 HA 단백질을 상기 고체 표면에 고정시켜 상기 HA 단백질의 구형 헤드를 차폐하는 방법. 

- 5 -

청구항 56 

제51항에 있어서, 상기 발현 라이브러리가 비-면역 라이브러리인 방법. 

청구항 57 

제51항에 있어서, 상기 발현 라이브러리가 H5 네이브(naive) 라이브러리인 방법. 

청구항 58 

생물학적으로 상용성인 매트릭스에 코팅 또는 매입된 트리메릭 헤마글루티닌 (HA) 단백질을 대상체에게 투여하 

는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대하여 대상체에게 백신을 접종하는 방법. 

청구항 59 

제58항에 있어서, 상기 HA 단백질이 비-포유동물 탄수화물 구조를 갖는 것인 방법. 

청구항 60 


청구항 61 

제58항에 있어서, 상기 HA 단백질을 상기 생물학적으로 상용성인 매트릭스에 코팅 또는 매입하여 상기 HA 단백 

질의 구형 헤드를 차폐하는 방법. 

청구항 62 

(a) 단일 쇄 또는 Fab 발현 라이브러리를 고체 표면에 고정된 병원성 외피 바이러스의 막 융합 단백질에 노출시 

키고, (b) 상기 단백질과 특이적으로 결합하는 상기 라이브러리내 항체를 확인하고, (c) 라이브러리로부터 항체 

를 단리하는 것을 포함하는, 병원성 외피 바이러스에 특이적으로 결합하는 단리된 항체의 제조 방법. 

청구항 63 


청구항 64 

제62항에 있어서, 상기 막 융합 단백질이 비-포유동물 세포에서 생산되는 것인 방법. 

청구항 65 

제62항에 있어서, 상기 막 융합 단백질이 비-포유동물 탄수화물 구조를 갖는 것인 방법. 

청구항 66 

제62항에 있어서, 상기 막 융합 단백질이 야생형 막 융합 단백질에 비해 개질된 글리코실화를 포함하는 것인 방 

법. 

청구항 67 

제62항에 있어서, 상기 발현 라이브러리가 비-면역 라이브러리인 방법. 

청구항 68 

제62항에 있어서, 상기 발현 라이브러리가 H5 네이브 라이브러리인 방법. 

청구항 69 

생물학적으로 상용성인 매트릭스에 코팅 또는 매입된 병원성 외피 바이러스의 막 융합 단백질을 대상체에게 투 

여하는 것을 포함하는, 병원성 외피 바이러스에 대하여 대상체에게 백신을 접종하는 방법. 

- 6 - 

공개특허 10-2010-0115346

[0001] 

[0002] 

[0003] 

[0004] 

[0005] 

[0006] 

[0007] 

청구항 70 

제69항에 있어서, 상기 융합 단백질이 비-포유동물 탄수화물 구조를 갖는 것인 방법. 

청구항 71 

제69항에 있어서, 상기 융합 단백질이 야생형 막 융합 단백질에 비해 개질된 글리코실화를 포함하는 것인 방법. 

청구항 72 

a) 샘플을 청구항의 모노클로날 항체와 접촉시키고, 

b) 항체-항원 복합체의 존재 또는 부재를 검출하고, 

이에 따라, 샘플내 인플루엔자 바이러스의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 샘플내 인플루엔자 바이러스의 존재 

를 검출하는 방법. 

청구항 73 

제72항에 있어서, 검출이 생체내에서 수행되는 것인 방법. 

청구항 74 

제72항에 있어서, 샘플이 혈액, 모발, 볼 스크레이핑(cheek scraping), 타액, 생검, 또는 정액으로부터 얻어진 

것인 방법. 

청구항 75 

VH 생식세포 유전자 IGHV1-69*01에 의해 코딩된 VH 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 a) 위치 27의 아미노산이 

발린이고, b) 위치 28의 아미노산이 쓰레오닌이고, c) 위치 30의 아미노산이 세린이고, d) 위치 31의 아미노산 

이 세린이고, e) 위치 54의 아미노산이 메티오닌이고, f) 위치 55의 아미노산이 페닐알라닌이고, g) 위치 58의 

아미노산이 쓰레오닌이고, h) 위치 100의 아미노산이 프롤린이고, i) 위치 101의 아미노산이 세린이고; j) 위치 

102의 아미노산이 티로신이고, k) 위치 103의 아미노산이 이소루이신이고, 위치 105의 아미노산이 세린이며, 인 

플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (HA) 단백질의 줄기 영역내 에피토프에 결합하여 A형 인플루엔자 바이러스를 

중화시키는 단리된 모노클로날 항체. 

명 세 서 

기 술 분 야 

 

본 출원은 2007년 12월 6일자로 출원된 USSN 61/005,725 및 2008년 8월 25일자로 출원된 USSN 61/091,599의 이 

익을 주장하며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 

 

본 발명은 미국 국립보건원 허가 제U01 AI074518-01호 하의 미국 정부 지원에 의해 완성되었다. 미국 정부는 

본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다. 

본 발명은 일반적으로, 항-바이러스 항체 및 그의 이용 방법에 관한 것이다. 

배 경 기 술 

공개특허 10-2010-0115346 

인플루엔자 범유행은 인간 건강에 대한 가장 큰 급성 감염성 위협들 중 하나에 해당한다. 1918-1919 인플루엔 

자 범유행은 미국에서 500,000명(추정)의 사망자를 발생시켰고, 이로 인해 상기 인플루엔자 범유행은 미국 역사 

를 통틀어 가장 치명적인 사건이 되었다. 높은 병원성의 조류 인플루엔자(HPAI) H5N1 인플루엔자가 아시아를 

거쳐서 이제 중동 및 북아프리카로 확산됨에 따라, 새로운 범유행이 발생할 실질적인 위험이 조성되고 있다. 

천연 변이 및 탈피 돌연변이체는, 바이러스의 계속적인 진화가, 수동적 및 능동적 면역화를 위해 어떤 종(들)이 

- 7 -

[0008] 

[0009] 

[0010] 

[0011] 

[0012] 

[0013] 

[0014] 

[0015] 

[0016] 

[0017] 

선택되어야 하는지에 대한 결정에 영향을 미쳐야 한다는 점을 시사한다. 다수의 중요한 에피토프 맵핑 및 중화 

탈피 연구가 보고되었음에도 불구하고, HPAI H5N1에 대한 면역화 전략의 개발을 위한 신규 중화성 항체 및 관련 

구조 연구가 필요하다. HPAI H5N1에 대한 보호성 백신을 개발하기 위한 도전은 쉽지 않으며, 항상 변화하는 적 

에 의한 인간 감염을 예방 및 치료하기 위한 새로운 접근법이 요구된다. 보호성 숙주 면역을 수동적으로 및 능 

동적으로 도출하기 위한 치료적 전략의 신속한 개발이 요구된다. 

인간 항체(Ab) 조작 분야에서 상당한 발전이 이루어졌다. 모노클로날 항체(Mab)-기재 면역요법은 이제, 점증하 

는 인간 질환 (RSV 포함)에 대한 치료의 표준이 되어가고 있다. 새로운 인간 Mab 단리 및 그의 임상적 사용으 

로의 전환의 부분적인 원인은, 새로운 항체 디스플레이, 및 높은 친화성 및 특이성을 갖는 인간 항체를 구축하 

기 위해 현재 이용되고 있는 다른 라이브러리 스크리닝 기술이다. 인간 Mab 면역요법은 인간 질환의 임상적 관 

리에 있어서 점점 중요한 역할을 제공할 수 있다. 

 

본 발명은 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 A형 인플루엔자 바이러스를 중화시키는 모노클로날 항체의 발견에 

기초한다. A형 인플루엔자 바이러스는 그룹 I A형 인플루엔자 바이러스, 예컨대 H1 클러스터 인플루엔자 바이 

러스이다. H1 클러스터 인플루엔자 바이러스는 H1a 클러스터 또는 H1b 클러스터 인플루엔자 바이러스이다. 모 

노클로날 항체는 완전 인간 항체이다. 다양한 측면에서, 모노클로날 항체는 2가 항체, 1가 항체, 단일 쇄 항체 

또는 이들의 단편이다. 구체적으로, 이러한 모노클로날 항체는 헤마글루티닌 단백질(HA), 예컨대 HA1 또는 HA2 

폴리펩티드의 줄기 영역 상의 에피토프에 결합한다. 상기 에피토프는 비-선형이다. 

선택적으로, 에피토프는 HA-1 및 HA-2 둘 다를 포함한다. 에피토프는 비-선형이다. 몇몇 실시양태에서, 에피 

토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40 및 291의 아미노산, 및 HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 38, 

41, 42, 45, 49, 52, 53 및 56의 아미노산을 포함한다. 

예시적인 모노클로날 항체로는 모노클로날 항체 D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90 또는 H98, 또는 

D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90 또는 H98과 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 포함된다. 

본 발명의 모노클로날 항체는 모노클로날 항체 D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90 또는 H98의 결합 

친화성을 가질 수 있다. 별법으로, 결합 친화성은 약 1 pM 내지 약 200 mM의 범위일 수 있다. 본 발명의 모노 

클로날 항체는 바이러스 및 세포 막 융합을 억제하는 기능을 한다. 

모노클로날 항체는 서열 2, 6, 12, 18, 24, 28, 32 및 36을 함유하는 중쇄 가변 아미노산 서열 및/또는 서열 4, 

8, 14, 16, 20, 22, 26, 30, 34 및 38을 함유하는 경쇄 가변 아미노산 서열을 갖는다. 

모노클로날 항체는 서열 1, 5, 13, 15, 21, 23, 29, 33, 37 및 40을 함유하는 중쇄 가변 핵산 서열 및/또는 서 

열 3, 9, 11, 17, 19, 25, 27, 31, 35, 39 및 42를 함유하는 경쇄 가변 핵산 서열을 갖는다. 

공개특허 10-2010-0115346 

또한, 본 발명은 모노클로날 항-인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 항체 또는 그의 단편을 제공하며, 상기 항체는 

아미노산 서열 SYAFS, TNAFS, AYAFT, SFAIS, SYAIS, GYYIH, MTAFT 또는 DNAIS를 갖는 VH CDR1 영역; 아미노산 

서열 GIIPMFGTPNYAQKFQG, GVIPLFRTASYAQNVQG, GIIGMFGTANYAQKFQG, GISPMFGTPNYAQKFQG, GIIGVFGVPKYAQKFQG, 

WINPMTGGTNYAQKFQV, GISPIFRTPKYAQKFQG 또는 GIIPIFGKPNYAQKFQG를 갖는 VH CDR2 영역; 아미노산 서열 SSGYYYG 

GGFDV, SSGYHFGRSHFDS, GLYYYESSLDY, SPSYICSGGTCVFDH, EPGYYVGKNGFDV, GASVLRYFDWQPEALDI, TLSSYQPNNDAFAI 

또는 DSDAYYYGSGGMDV를 갖는 VH CDR3 영역; 아미노산 서열 TGSSSNIGNYVA, TGSSSNIAANYVQ, TGTSSDVGGYNSVS, 

TGNSNNVGNQGAA, TGDSNNVGHQGTA, GGNNIGGYSVH, RASQSVSSYLA, RASQSLSSKYLA, TGSSSNIGNYVA, SGSSSNIGSNTVN, 

RASQSISSYLN 또는 TLSSGHSNYIIA를 갖는 VL CDR1 영역; 아미노산 서열 SNSDRPS, EDDRRPS, EVTKRPS, RNNDRPS, 

RNGNRPS, DDKDRPS, DASNRAT, GASSRAT, SNNQRPS, AASSLQR, SNEQRPS 또는 VNSDGSHTKGD를 갖는 VL CDR2 영역; 및/ 

또는 아미노산 서열 QSYDSLSAYV, QSYDTNNHAV, CSYAGHSAYV, STWDSSLSAVV, SVWDSSLSAWV, QVWDSGNDRPL, 

QQYGSSPQV, QQYDGVPRT, QSYDSRLSASL, QQYDSSPYT, ASWDDNLSGWV 또는 ETWDTKIHV를 갖는 VL CDR3 영역을 갖는다. 

추가의 측면에서, 본 발명은 단리된 모노클로날 항-인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 항체 또는 그의 단편을 제 

공하고, 상기 항체는 VH 생식세포 유전자 IGHV1-69*01에 의해 코딩된 VH 아미노산 서열을 갖되, a) 위치 27의 

아미노산은 발린이고; b) 위치 28의 아미노산은 쓰레오닌이고; c) 위치 30의 아미노산은 세린이고; d) 위치 31 

의 아미노산은 세린이고; e) 위치 54의 아미노산은 메티오닌이고; f) 위치 55의 아미노산은 페닐알라닌이고; g) 

위치 58의 아미노산은 쓰레오닌이고; h) 위치 100의 아미노산은 프롤린이고; i) 위치 101의 아미노산은 세린이 

- 8 -

[0018] 


[0020] 

[0021] 

[0022] 

[0023] 

[0024] 

[0025] 

[0026] 

고; j) 위치 102의 아미노산은 티로신이고; k) 위치 103의 아미노산은 이소루이신이고, 위치 105의 아미노산은 

세린이다. 

또다른 측면에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 질환 또는 장애를 앓을 위험이 있는 인간에게 

치료 유효량의 본원에 기재된 모노클로날 항체 또는 scFV 항체를 투여함으로써, 상기 질환 또는 장애를 예방 또 

는 치료하는 방법을 제공한다. 모노클로날 항체 또는 scFV 항체는 인플루엔자 바이러스를 중화시키기에 충분한 

용량으로 투여된다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 방법은 또한, 항-바이러스 약물, 바이러스 진입 억제제 또 

는 바이러스 부착 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 항-바이러스 약물은 뉴라미니다제 억제제, 예컨대 자나미 

비르, 또는 오셀타미비르 포스페이트, HA 억제제, 시알산 억제제 또는 M2 이온 채널, 예컨대 아만타딘 또는 리 

만타딘이다. 항체는 인플루엔자 바이러스로의 노출 이전 또는 이후에 투여된다. 

또다른 측면에서, 본 발명은 샘플을 본원에 기재된 모노클로날 항체와 접촉시키고 항체-항원 복합체의 존재 또 

는 부재를 검출하여 샘플에서 인플루엔자 바이러스의 존재를 검출함으로써, 샘플에서 인플루엔자 바이러스의 존 

재를 검출하는 방법을 제공한다. 시험 샘플은 일반적으로, 혈액, 모발, 볼(cheek)의 스크레이핑(scraping) 또 

는 도찰물(swab), 타액, 생검, 소변, 대변, 가래, 비내 흡인물 또는 정액으로부터 얻어진다. 

본 발명은 또한, HA의 줄기 영역에서의 고도로 보존된 에피토프를 표적으로 하는 광범위 중화성 인간 항체를 생 

성하기 위한 프로토콜의 발견에 기초한다. 짧은 N-글리칸 및 비하전 만노스 (플라스틱 표면 상에 흡착됨)를 생 

성하는, 바큘로바이러스에서 발현되는 트라이머 H5 엑토도메인을 사용함으로써, 줄기 에피토프가 우세하게 존재 

하게 되었고, 통상적으로 면역우세한 구형 헤드(globular head)를 차폐할 수 있었다. 

따라서, 본 발명은 또한, 단일 쇄 또는 Fab 발현 라이브러리를 바이러스의 막 융합 단백질에 노출시키고, 상기 

단백질과 특이적으로 결합하는 라이브러리내 항체를 확인하고, 라이브러리로부터 항체를 단리함으로써, 병원성 

외피(enveloped) 바이러스와 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제조하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 융 

합 단백질은 고체 표면, 예를 들어 플라스틱 표면 상에 고정된다. 다양한 측면에서, 융합 단백질은 야생형 융 

합 단백질에 비해 개질된 글리코실화를 갖는다. 예를 들어, 융합은 비-포유동물 세포, 예컨대 곤충 세포에서 

생성된다. 융합 단백질은, 예를 들어 트라이머 헤마글루티닌(HA) 단백질이다. 

본 발명은 또한, 생물학적으로 상용성인 매트릭스 내에 매입되거나 코팅된 막 융합 단백질 (예를 들어, 트라이 

머 헤마글루티닌(HA) 단백질)을 대상체에게 투여함으로써, 인플루엔자 바이러스와 같은 병원성 외피 바이러스에 

대하여 대상체에게 백신을 접종하는 방법을 제공한다. 다양한 측면에서, 융합 단백질은 야생형 융합 단백질에 

비해 개질된 글리코실화를 갖는다. 

또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 모노클로날 항체를 포함하는 조성물, 및 하나 이상의 용기에 담긴 

상기 조성물 및 사용설명서를 함유하는 키트를 제공한다. 

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 통상의 기술자가 

통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 

발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 아래에 기재되어 있다. 본원에 언급된 모 

든 출판물, 특허 출원, 특허 및 여타 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다. 충돌하는 경우, 본 명세서 (정의 

포함)가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시만을 목적으로 하며, 제한을 위한 것은 아니다. 

본 발명의 여타 특징부 및 장점은 하기 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다. 

도면의 간단한 설명 

도 1a는 A/베트남 1203/04 트라이머의 구조의 도해이다. 수용체 결합 부위 및 항원 변이 부위는 모노머 상에 

강조표시하였다. 

도 1b는 양성 선택된 H5N1 인플루엔자 바이러스의 HA에 있는 아미노산 잔기들의 위치를 나타내는 도해이다. 

도 2는 H5N1에 대한 수렴성 조합 면역요법의 도식화 도해이다. 

도 3은 본 발명의 항-인플루엔자 항체의 VH 및 VL 둘 다에 대한, 프레임워크 영역 1-4 (FR1-4) 및 상보성 결정 

영역 1-3 (CDR1-3)의 아미노산 서열 비교를 나타내는 도해이다. FR 및 CDR 영역은 카바트(Kabat) 데이타베이스 

를 사용하여 정의된다. VH 및 VL 유전자 명칭은 오른쪽에 제시되어 있다 (IMGT 데이타베이스 사용). 점(.)은 

컨센서스 서열에 대한 서열 동일성을 나타낸다. 하이픈(-)은 갭(gap)을 나타낸다. 

공개특허 10-2010-0115346 

도 4는 항-H5 항체의 시험관내 중화를 나타낸다. (a) (상단 패널) 10종의 nAb를 가용성 scFv-Fc (힌지, CH2 및 

- 9 -

CH3과 연결된 가변 영역의 단일 쇄 단편)로 전환시키고, H5-TH04-슈도유형의 바이러스에 대한 중화 활성에 대해 

평가하였다. 2개 농도에서의 중화 백분율은 표준 오차 막대에 의해 표시된다. mAb 80R 16 

을 대조군(Ctrl.)으로 

사용하였다. (중단 및 하단 패널) 플라크 감소 검정을 이용한, 3개 농도에서 10종의 scFv-Fc에 의한 야생형 

H5-VN04 및 H5-IN05의 중화. 결과는 마이크로중화 검정으로부터 얻어진 것들과 일치한다 (데이타는 나타내지 

않음). (b) 교차 아형 중화. nAb D8, F10 및 A66은 모두 H5-TH04, H1-SC1918 (A/사우스 캐롤라이나/1/1918 

(H1N1)), H1-PR34 (A/푸에르토 리코/8/34 (H1N1)), H2-JP57 (A/일본/305/57 (H2N2)) 및 H6-NY98 (A/닭/뉴욕 

/14677-13/1998 (H6N2)) 슈도유형의 바이러스를 중화시켰다. (c) 마이크로중화 검정. 야생형 H5N1, H1N1 (A/ 

오하이오/83 ("H1-OH83")) 및 H2N2 (A/앤 아버/6/60 ("H2-AA60"))에 대한 F10의 중화 역가를 H5N1에 대한 뮤린 

mAb 21G8.6 및 Ctrl. 80R (1 mg/mL Ab 스탁 용액)의 경우와 비교하였다. "

[0027] 

80 내지 100%가 보호되었다. 

도 8은 HA 단백질의 SDS-PAGE 및 겔 여과 분석을 나타낸다. (a) 항체 2A는 H5-TH04의 HA1 (잔기 11-325) 단편 

에 대한 개별적인 HA1-표적화 선별로부터 얻어졌다 (왼쪽 패널). 라이브러리 선별에 사용된 H5 HA (H5-VN04 

종)는 오른쪽 패널에 제시되어 있다. (b) H5-VN04 (H5) 및 scFv F10 복합체. HA0은 푸린(furin)과의 동시-발 

현에 의해 HA1 및 HA2로 완전히 절단되었다 (왼쪽 패널). 우선 H5 및 F10을 1:10의 몰 비율로 혼합한 후에 겔 

여과에 의해 정제함으로써 복합체가 형성되었다. 

도 9는 항-H5 scFv-Fc와 H5 또는 HA1의 결합의 ELISA 및 경쟁 ELISA 분석을 나타낸다. (a) 1 ㎍/mL의 항-H5 

scFv-Fc에 이어 HRP-항-인간 IgG1을 사용하여, ELISA 플레이트 상에 코팅된 HA1 (H5-TH04) 또는 H5 (H5- 

VN04)에 대한 항-H5 scFv-Fc의 결합을 검출하였다. HA1 아형에 대해 선별된 항체인 mAb 2A scFv-Fc는 HA1 및 

H5 둘 다에 결합하였다. 10종의 강력한 중화성 scFv-Fc는 H5에 결합하였으나 HA1에는 결합하지 않았다. (b) 

10 12 

pfu의 항-H5 파지-scFv를 5 ㎍/mL의 항-H5 scFv-Fc와 혼합하고, H5 (H5-VN04)-코팅 플레이트에 첨가하고, 

세척한 후, HRP-항-M13을 첨가하여, H5에 결합된 파지-scFv를 검출하였다. mAb 2A-Fc는 10종의 H5-선별 Ab에 

의해 인식되는 에피토프에 대해 경쟁하지 않았다. 모든 H5-선별 scFv-Fc는 교차-경쟁하였다. 이들 중, H5 트 

라이머에 결합하는 Ab F10 (파지-scFv)은 다른 scFv-Fc에 의해 최소한으로 억제되었는데, 이는 시험된 모든 Ab 

중에서 상기 Ab가 가장 높은 친화성을 갖는다는 점을 시사한다. 

도 10은 H5와 nAb D8, F10 및 A66-IgG1의 결합의 동력학적 및 열역학적 특성 분석을 나타낸다. CM4 칩 상에서 

항-인간 IgG1을 통해 nAb를 포획하고, 다양한 농도 (20, 10, 5, 2.5, 2.5, 1.25, 0.625 nM)의 트라이머 H5 

(H5-VN04)를 칩 표면에 주사하였다. 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 이용하여 결합 동력학을 평가하였다. 

기록된 결합 곡선 (블랭크 기준 차감)과 계산된 곡선은 거의 겹쳐진다. 각 ka, kd 및 KD 값은 3회 실험의 평균 

및 표준 오차를 나타낸다. 

도 11은 HA 아형들 간의 계통발생학적 관계 및 서열 비교를 나타낸다. 아미노산 서열에 기초한, A형 인플루엔 

자 바이러스의 16종 HA 아형의 계통발생학적 트리. HA 아형의 4개 클러스터는 다른 색으로 음영 처리되어 

있다. 분석에 이용된 서열은 H1 (A/사우스 캐롤라이나/1/1918), H2 (A/일본/305/1957), H3 (A/아이치 

/2/1968), H4 (A/오리/체코슬로바키아/56), H5 (A/베트남1203/2004), H6 (A/닭/캘리포니아/431/00), H7 (A/네 

덜란드/219/03), H8 (A/칠면조/온타리오/6118/68), H9 (A/돼지/HK/9/98), H10 (A/닭/독일/N49), H11 (A/오리/ 

잉글랜드/56), H12 (A/오리/앨버타/60/76), H13 (A/갈매기/메릴랜드/704/77), H14 (A/청둥오리/아스트라한 

/263/1982), H15 (A/슴새/웨스트 오스트레일리아/2576/79) 및 H16 (A/붉은부리갈매기/스웨덴/2/99)이었다. 

도 12는 H5-VN04 접종 후에 항-H5 nAb로 처리된 마우스의 폐, 비장 및 뇌에서의 바이러스 역가를 나타낸다. 

H5-VN04의 10배 MLD50에 의한 비내 감염으로부터 24, 48 또는 72시간 후, BALB/c 마우스 (n=5)를 15 mg/kg mAb 

의 복강내 주사에 의해 처리하였다. 96 hpi에서 수집한 폐, 뇌 및 비장에서 바이러스 역가를 측정하였다. 데 

이타는 상자-수염(box-and-whiskers) 형태로 표시되고, 여기서 박스는 제25 백분위수로부터 제75 백분위수까지 

뻗어 있다 (중간에 수평선이 있음). 박스의 위아래에 있는 수염은 극한 값을 나타낸다. 스튜던트(Student) T- 

검정 통계 분석의 결과에서, p

[0028] 

[0029] 

[0030] 

[0031] 

[0032] 

주 시알산을 절단함으로써 자손 바이러스의 확산을 용이하게 하는 뉴라미니다제(NA)로 구분된다. 

16종의 HA 아형 및 9종의 NA 아형이 있으며, 이들은 HA 및 NA의 다양한 조합에 의해 A형 인플루엔자 바이러스의 

모든 아형을 형성한다. 16종의 HA 및 9종의 NA 바이러스 아형의 모든 조합은 물새에서 발견된다. 조류 A형 인 

플루엔자 바이러스의 수백개 종 중, 오직 4개, 즉 H5N1, H7N3, H7N7 및 H9N2이 인간 감염을 일으키는 것으로 알 

려져 있다. 일반적으로, 이러한 바이러스에 의한 인간 감염은 경증 증상 및 거의 드문 중증 질병을 일으킨다 

(H7N7에 의해 유발된 치명적인 폐렴 케이스가 하나 있었음). 그러나, 인간에서의 천연 면역이 존재하지 않는 

높은 병원성의 H5N1 바이러스는 예외이다. RNA 폴리머라제의 배신 및 숙주 면역의 선택적인 압박은 돌연변이의 

축적 및 단백질의 표면 항원 변화를 일으킬 수 있다. 이러한 항원 변화는 항원 소변이(drift)로 불린다. 

또한, 절편화된 게놈으로 인해, A형 인플루엔자 바이러스의 상이한 2종 아형이 동일한 세포에 감염되는 경우에 

는 유전자 절편들의 셔플링이 발생할 수 있다. 예를 들어, 인간 H3N2 바이러스 및 조류 H5N1 바이러스가 인간 

또는 다른 포유동물 종 구성원에 동시-감염되는 경우, 이러한 사건이 새로운 H5N2를 생성할 수 있다. 이후, 이 

러한 새로운 바이러스는 인간에서 인간으로 효율적으로 전달될 수 있는데, 그 이유는 유전자 절편의 전부 또는 

대부분이 인간 바이러스로부터 유래되기 때문이다. 그러한 유전자 재분류는 주요한 항원 변화, 이른바 항원 이 

동(shift)을 초래할 것이며, 이는 세계 인구의 대부분이 그 재분류 바이러스에 대한 어떠한 중화성 항체도 갖지 

않음을 의미할 것이다. 이러한 상황은 인플루엔자 H5N1 폐렴의 높은 사망률과 함께, 공중 보건 분야에서 가장 

두려운 시나리오 중 하나이다. 

인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)은 인플루엔자 바이러스의 최고 가변성 항원이며, 세포로의 바이러스 진 

입을 담당한다. 이는, 단일 디술피드 결합에 의해 연결된 두 폴리펩티드 HA1 및 HA2로 번역후 절단되는 트라이 

머 전구체 폴리펩티드 HA0으로서 합성된다. HA의 HA1 쇄는 바이러스가 세포 표면에 부착되는 것에 관여한다. 

HA2는 엔도좀에서의 바이러스 및 세포 막의 융합을 매개하며, 이로써 리보뉴클레오단백질 복합체가 세포질 내로 

방출된다. HA1과는 달리, HA2 분자는 HA의 상대적으로 보존된 부분에 해당한다. 제2 면역원성 인플루엔자 단 

백질은 뉴라미니다제(NA)이다. 이러한 테트라머 당단백질은 생성자 세포 상에서 표면 시알산으로부터 비리온을 

방출하는 것을 담당하며, 또한 기도내 표적 세포로의 접근을 촉진하는 역할을 할 수 있다. NA에 대한 중화성 

항체가 동물 및 인간에서 보호 효과가 있더라도, 그 작용 메카니즘에 대한 데이타는 부족하다. N1 뉴라미니다 

제의 결정 구조에 대한 최근 보고서는, 항체를 비롯한 신규 항-인플루엔자 약물을 개발하기 위해 이용될 수 있 

는 활성 부위에 인접한 캐비티(cavity)가 존재한다는 점을 입증하였다. 이러한 발견은, H5N1 바이러스에 있어 

서 오셀타미비르 (타미플루(Tamiflu)) 및 자나미비르 (렐렌자(Relenza))에 대한 약물 내성 발생의 보고라는 점 

에서 특히 중요하다. 

HA의 HA1 및 HA2 쇄는 둘 다 면역원성이고, 두 쇄와 반응하는 항체는 인간에서의 천연 감염 후에 나타났다. 

HA1에 특이적인 항체는 대부분 중화성이지만, HA1 특이적 Mab에 의한 다양한 시험관내 바이러스 중화 메카니즘, 

예를 들어 HA1 상의 수용체 부위의 차폐, 바이러스-세포 융합의 세포내 억제, 또는 동시적 부착 억제 및 바이러 

스-세포 융합 억제 (항체 농도에 따라 달라짐)가 기술된 바 있다. 잘 연구되지는 않았지만, 항-HA2 항체에 의 

한 세포 융합 억제도 보고되었다. 

20년 보다 더 이전에, 항원 소변이 변이체 및 탈피 돌연변이체의 HA의 서열 분석에 의해 H3 아형의 HA 분자가 

특성 분석되었고, 항원 에피토프가 분자의 3차원 구조 상에 맵핑되었다. 이후, 조류 병원성 바이러스의 H1, H2 

및 H5 상의 항원 부위가 H3의 3차원 구조 상에 맵핑되었다. 1997년에 홍콩에서 인간의 H5N1 감염이 발생하고, 

1999년에 인간 케이스로부터 H9N2 바이러스가 단리된 후, 두 단백질의 X선 구조가 해명되었다. 그러나, 구조를 

해명하기 위해 사용되었던 1997 돼지 단리물 (A/오리/싱가포르/3/97) 및 보다 최근에 단리된 고병원성 종의 항 

원 소변이는 의미가 있다. 사실상, 돼지 단리물 (A/오리/싱가포르/3/97) 및 HPAI H5N1 종 (A/베트남1203/04) 

사이에는 28개의 미미한 변화 및 2개의 잠재적으로 주요한 변화가 존재한다. 

공개특허 10-2010-0115346 

2004-2005 발생으로부터의 H5 HA 유전자의 계통발생학적 분석은 분기군 1 및 2로 지칭되는 2개의 상이한 HA 유 

전자 계통을 밝혀냈다. HPAI H5N1 종 (A/베트남1203/04)은 분기군 1의 구성원이다. 이들 각 분기군의 바이러 

스는 아시아의 비-중첩 지리구에 분포되어 있다. 인도차이나로부터의 H5N1 바이러스는 분기군 1에 조밀하게 모 

여 있고, 여러 주위 국가로부터 단리된 H5N1은 분기군 1의 단리물과 구별되며, 보다 분기된 분기군 2에 속한다. 

분기군 1 바이러스는 베트남, 태국 및 캄보디아에서 인간 및 조류로부터 단리되었으나, 라오스 및 말레이시아에 

서는 조류로부터만 단리되었다. 분기군 2 바이러스는 중국, 인도네시아, 일본 및 대한민국에서 배타적으로 단 

리된 바이러스에서 발견되었다. 최신의 역학적 연구는 바이러스 도입, 풍토성 및 진화 36 

와 관련된 의문들을 해 

결하기 위해, 인도네시아 및 베트남에 걸쳐 가금류로부터 단리된 82종의 H5N1 바이러스 및 남베트남으로부터의 

- 12 -

[0033] 

[0034] 

[0035] 

[0036] 

[0037] 

[0038] 

[0039] 

11종의 인간 단리물을 공개 데이타베이스에서 입수가능한 서열 데이타와 함께 분석하였다. 계통발생학적 분석 

은, 인도네시아의 모든 바이러스가 H5N1 Z 유전자형 바이러스의 특징적인 하위계통을 형성함을 밝혀냈는데, 이 

는 아마도 상기 발생이 지난 2년 동안 국가 전반에 걸친 확산을 통한 단일 도입에 기인하였음을 시사한다. 인 

도네시아에서의 계속된 바이러스 활동은, 조류 이동에 의한 반복적인 도입을 통한 것이 아닌, 국가내 가금류 이 

동을 통한 전달에서 비롯되었다. 인도네시아 및 베트남 내에서, H5N1 바이러스는 시간이 지남에 따라, 각 국가 

에서 지역에 따라 구별되는 군들로 진화하였다. 

최근, A/베트남1203/4로부터의 HA의 구조가 해명되었다. 그의 아미노산 서열과, 분기군 1 및 2 바이러스로부터 

의 HPAI 2004 및 2005 단리물로부터의 HA 유전자와의 비교에 의해, 13개 위치의 항원 변이는 주로 수용체 결합 

도메인 주위에 클러스터화되어 있으며 나머지는 흔적 에스테라제 도메인 내에 있는 것으로 확인되었다. 항원 

변이의 영역은 H1 및 H3 혈청형에서 확인되었다 (도 1a). H1의 경우, 이러한 부위는 Sa, Sb, Ca 및 Cb로 명명 

되고, H3의 경우에는 그 부위가 A, B, C 및 D로 명명된다. H5 HA의 탈피 돌연변이체는 다음과 같은 3개 에피토 

프로 클러스터화될 수 있다: 부위 1: 항원 부위 A (H3) 및 항원 부위 Ca2 (H2)와 중첩되는 노출된 루프 (HA1 

140-145); 부위 2: H3 혈청형에서의 항원 부위 B에 상응하는 HA1 잔기 156 및 157; 및 3) H1 HA 및 H9 혈청형 

에서의 Sa 부위에 제한된 HA1 129-133. 스미스(Smith)의 최근 연구에서, 아미노산 수준에서의 양성 선택의 검 

출 결과, HA 단백질의 8개 잔기가 양성 선택된 것으로 나타났다 (도 1b). 이들 잔기에는 항원 부위 A 및 E의 5 

개 (위치 83, 86, 138, 140 및 141); 수용체 결합에 관여하는 2개 (위치 129 및 175); 및 수용체-결합 부위 근 

처에 있는 잠재적인 N-연결된 글리코실화를 위한 부위 (위치 156)가 포함된다. 또한, 연구 결과에 따르면, HA 

의 3개 잔기 (Val 86, Ser 129 및 Thr 156)는 닭 또는 오리 단리물보다 인간 단리물에서 보다 빈번하게 관찰되 

었으며 아마도 H5N1 Z 유전자형이 인간에 일찍 적합화된 것으로 밝혀졌다. 이러한 연구로부터 얻어진 또다른 

중요한 발견은, 인도네시아 및 베트남 하위-계통들 간의 계통발생학적 차이가 이들 두 바이러스 군 간의 유의한 

항원 교차-반응성 차이에 반영되었다는 점이다. 구체적으로, 인도네시아로부터의 바이러스는 A/베트남1203/04 

에 대한 페럿 항혈청과 반응하지 않았고, 베트남으로부터의 대표적인 바이러스는 인도네시아 바이러스 IDN/5/06 

및 Dk/IDN/MS/04에 대한 페럿 항혈청과 반응하지 않았다. 상기 발견은, 면역 인간 혈청 및 인간 1997 및 2003 

H5N1 바이러스를 이용한 선행 연구와 일치하며, 이들 종은 계통발생학적으로뿐만 아니라 항원에 따라서도 구별 

된다. 따라서, 천연 변이 및 탈피 돌연변이체는, 바이러스의 계속적인 진화가, 수동적 및 능동적 면역화를 위 

해 어떤 종(들)이 선택되어야 하는지에 대한 결정에 영향을 미쳐야 한다는 점을 시사한다. 

본 발명은 인간 항-인플루엔자 모노클로날 항체의 확인, 생성 및 특성 분석을 위한 방법을 제공한다. 

scFv 및 모노클로날 항체의 확인 및 특성 분석 

고친화성 교차-아형 광범위-중화성 인간 항-HA mAb가 확인되었다. 이러한 nAb는, 형태적 변화의 핵심 효소들 

(αA 헬릭스의 노출된 표면 및 융합 펩티드)이 밀접하게 근접하는 지점에서 줄기 영역내 신규하며 고도로 보존 

된 중화성 에피토프를 인식함으로써 부착후 융합 과정을 억제한다. 16종 HA 아형 모두의 구조 및 서열 분석에 

따르면, HA의 2개 계통발생학적 그룹 (그룹 1 및 그룹 2)에 상응하는, 상기 에피토프의 단 2종 변이체가 존재한 

다. 상기 결과는, 각 그룹의 아집단으로부터 유래된 nAb의 작은 칵테일이 계절성 및 범유행성 인플루엔자에 대 

한 광범위한 보호를 제공할 수 있는 가능성을 높인다. 

최근 보고서에서는, 항-HA nAb를 단리하기 위해 H5N1-감염된 환자로부터의 면역 세포가 사용되었다. 그러나, 

이들의 에피토프 및 작용 방식은 보고되지 않았다. 주목할 만하게도, 본 발명자들은 동일한 VH 생식세포 유전 

자 IGHV1-69*01을 이용하며, Y102와 동등한 위치에서 티로신을 함유하는 CDR3 루프를 코딩하는 nAb를 비-면역 

라이브러리로부터 반복하여 단리하였다. 이는, 아마도 H1 아형 및 (1968년 이전에 태어난 라이브러리 공여자의 

경우) H2 아형으로의 사전 노출로 인해, 광범위한 항-HA 교차-면역이 H5-네이브 집단에 이미 존재하고 있음을 

나타낸다. 상기 생식계열 VH 절편의 반복적인 사용, N 삽입 및/또는 생식계열 D 유전자 조립을 통해 도입된 

CDR3 티로신의 공통성, 및 두 연구에서 발견된 nAb에 의한 난잡한 VL 유전자 사용은, 상기 에피토프를 인식할 

수 있는 재배열된 VH 절편들의 전구체 빈도가 유의함을 시사한다. 이는, 본원에서 확인된 F10 에피토프로의 적 

합한 노출에 의해 광범위한 nAb가 생체 내에서 용이하게 유도될 수 있는 가능성을 높인다. 두 그룹의 바이러스 

아형에 대한 보편적인 보호를 제공하는 데 필요한 nAb의 유전자적 및 구조적 복잡성은 아직 밝혀지지 않았으나, 

본 발명자들의 데이타는 놀랍게도 간단한 해결책을 나타내는 것으로 보인다. 

58종의 HA-1 양성 클론의 서열 분석에 의해 3종의 고유한 항-HA-1 scFv가 확인되었다. 이들 scFv는 38B 및 1C 

로 명명하였다. 2A의 VH 및 VL 아미노산 서열은 도 4에 제시되어 있다. 

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97종의 HA0 양성 클론의 서열 분석에 의해 10종의 고유한 항-HA0 scFv가 확인되었다. 이들 scFv는 7, 8, 10, 

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17, 40, 66, 80, 88, 90 및 98로 명명하였다. 6종의 상이한 VH 유전자 및 10종의 상이한 VL 유전자가 밝혀졌 

다. 몇몇 scFv는 동일한 VH 유전자를 공유하였다. 6종의 상이한 VH 유전자 중 5종은 IGHV1-69 유전자 군에 속 

했다. 10종 VL 유전자 중 3종은 카파 쇄였다. 

2A scFv는 중간 수준 중화성 항체이고, 38B 및 1C는 비-중화성 항체이다. 10종의 scFv (7, 8, 10, 17, 40, 

66, 80, 88, 90 및 98)는 강력한 중화성 항체이다 (도 6). 

중화성 인플루엔자 항체의 핵산 및 아미노산 서열은 아래에 제공된다. 

 

 

 

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중화성 인플루엔자 항체의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열은 하기 표 2 및 도 4에 제시되어 있 

다. 

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당업자는, 다양한 결합 친화성을 갖는 추가의 scFv 및 모노클로날 항체도 치료적으로 유효할 수 있음을 알 것이 

다. 예를 들어, 약 1 pM 내지 약 200 mM 범위의 결합 친화성을 갖는 항체 및 scFv가 또한, 치료적으로 유효할 

수 있다. 

항-인플루엔자 항체에 의한 H5N1 중화 

H-5 슈도유형 바이러스를 2가 scFv 및 전장 항체와 함께 인큐베이션하고, 항체-바이러스 혼합물을 293T 세포와 

접촉시켰다. 표적 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 감염성을 정량화하였다. D7, D8, F10, G17, H40, 

A66, D80, E88, E90 및 H98 항체는 H5에 대한 강력한 중화 활성을 갖는다. D8, F10 및 A66 항체는 또한, H1N1 

을 교차 중화시켰고, H1-SC/1918 종을 강력하게 중화시켰고, H1-PR-34 종을 중간 수준으로 중화시켰다 (도 6). 

8, 10 및 66 에피토프의 특성 분석 

인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 단백질에 결합하는 8,10 및 66의 1차 에피토프 맵핑에 따르면, 이들 3종 항체의 

에피토프는 유사하며 HA1 상의 위치 307 및 HA2 상의 위치 52, 59, 65 및 93에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 상 

기 에피토프는 바이러스가 방출하지 않은 헤마글루티닌 단백질로 구성된다. 이는 바이러스가 방출하지 않은 뉴 

라미니다제 단백질에 결합하는 대부분의 여타 공지된 항-인플루엔자 항체의 경우와 다르다. 

nAb 에피토프의 구조 특성 분석 

nAb들 중 하나(F10)의 에피토프 및 결합 방식은, 3.2 Å 해상도에서 HA (H5-VN04)와 복합체화된 scFv 단편의 결 

정 구조의 해명 및 돌연변이 유발에 의해 결정하였다 (도 6 및 표 4). 

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복합체에서, 각 H5 트라이머는 대칭 관계인 부위에서 F10의 3개의 분자와 결합하고 (항체 당 약 1500 Å 2 

단백 

질 표면 매입), H5 자체의 구조는 F10 결합에 의해 유의하게 변경되지 않는다. HA는 단일 쇄인 HA0으로서 합성 

되고, 이는 2개 아형 HA1 및 HA2로의 단백질가수분해성 절단에 의해 활성화된다. 절단에 의해, "융합 펩티드" 

(HA2의 최초 약 21개 잔기를 포함함)가 막-근위 방향 줄기 내에 매입된다. F10 결합은 상기 영역에서 배타적으 

로 발생하여 (도 6), 융합 펩티드, 즉 중성 pH 형태로 펩티드를 고정시키는 HA1 및 HA2의 요소 (이들은 둘 다 

상기 영역의 구조에 필수적임), 및 융합 펩티드를 바이러스 막-근위 방향 포켓으로부터 바이러스의 원위 방향 

표면으로 추진하기 위해 산성 pH에서의 큰 형태 변화를 겪는 HA2의 거대 헬릭스 헤어핀 (이는 엔조좀 막과의 융 

합을 촉발할수 있음)과 친밀하게 접촉한다. 

F10의 중쇄는 H5 결합에 있어서 중요한 역할을 한다 (3개의 상보성 결정 영역 (CDR)의 팁을 이용함). 각 F10 

분자는 HA 트라이머의 단일 모노머 내에 있는 HA1 및 HA2 아형과 접촉한다 (도 6). 접촉 영역은, 한편으로는 

HA1의 요소, 및 다른 한편으로는 HA2의 αA 헬릭스의 노출된 면을 갖는, HA2 융합 펩티드의 일부에 의해 형성된 

포켓을 포함한다 (도 4 및 6). 항체 잔기들의 트라이어드 (CDR H2로부터의 F55 및 M54, 및 CDR H3으로부터의 

Y102)는 주요 접촉 지점을 형성한다. F55의 페닐 고리는 융합 펩티드 루프의 돌출 루프 (HA2 잔기 DGW 192-212 

(H3 넘버링 체계; 아래첨자 1 및 2는 HA1 및 HA2 쇄를 의미함)), 및 2개의 플랭킹 히스티딘 (잔기 181 및 381) 

및 포켓의 뒷면을 형성하는 트립토판 (W212)의 방향족 측쇄에 의해 형성된 편평한 표면을 가로질러 위치한다. 

M54의 측쇄는 또한, W212 및 H381의 방향족 고리 및 αA 헬릭스로부터의 I452의 측쇄와 접촉하며, 그의 주쇄 카 

르보닐 산소는 H381의 측쇄와 수소 결합한다. Y102는 그의 측쇄를, αA 헬릭스의 4개 측쇄에 의해 생성된 소수 

성 틈에 삽입하고, 또한 융합 펩티드의 골격 카르보닐 (D192)에 수소 결합한다. CDR H1 루프는 헤드 영역 아래 

에서 HA1 루프 및 αA 헬릭스의 C-말단 끝과 다중 접촉한다 (도 12d,e). 

동시에, αA 헬릭스에 대해 돌연변이 유발 실험을 수행하여, 에피토프의 정의를 도왔다 (도 6). 항체 V52A/E, 

N53A 및 I56A와 직접적으로 접촉하는 3개의 잔기에서의 돌연변이는 항체 결합을 유의하게 감소 또는 

제거하였고, 보존적 돌연변이 V52L은 효과가 전혀 없었다. 대조군으로서, 헬릭스의 다른 노출면 (항체와 접촉 

하지 않음) 상의 돌연변이는 항체 결합에 대한 효과가 전혀 없었다 (도 12b-c). 따라서, αA 헬릭스의 돌연변 

이 유발은 F10에 대해 결정학적으로 정의된 에피토프와 완전히 일치한다. 또한, 구조 데이타가 존재하지 않는 

다른 2종의 nAb가 거의 동일한 돌연변이체-nAb 결합 프로파일 (밀접하게 중첩하는 에피토프를 나타내며, 경쟁 

결합과 일치함)을 나타냈다 (도 6, 도 9). 요컨대, 본 발명자들은 3종 nAb 모두가, 융합 상태를 유도하는 형태 

적 변화를 위해 촉발 (가장 가능하게는, 포켓으로부터의 융합 펩티드 방출)을 제공하는 영역에서 HA의 중성 pH 

형태를 안정화시킴으로써 바이러스를 중화시키는 것으로 판단한다. 

항체 

본원에서 사용된 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원과 특이 

적으로 결합하는(면역반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 나타낸다. "특이적으로 결합하다" 또는 "면 

역반응하다"란, 항체가 원하는 항원의 하나 이상의 항원 결정기와 반응하되 다른 폴리펩티드와는 반응하지 않는 

것을 의미한다. 항체로는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, dAb (도메인 항체), 단일 쇄, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단 

편, scFv 및 Fab 발현 라이브러리가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 

단일 쇄 Fv ("scFv") 폴리펩티드 분자는 공유 결합된 VH::VL 이종다이머이고, 이는 펩티드-코딩 링커에 의해 연 

결된 VH- 및 VL-코딩 유전자를 포함하는 유전자 융합체로부터 발현될 수 있다 (문헌 [Huston et al. (1988) 

Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883] 참조). 항체 V 영역으로부터의 천연 응집 상태이되 화학적으로 분 

리된 폴리펩티드 경쇄 및 중쇄를 scFv 분자 (항원-결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 폴딩 

됨)로 전환시키기 위한 화학적 구조를 식별하기 위한 수많은 방법이 기술된 바 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 

5,091,513호; 제5,132,405호; 및 제4,946,778호를 참조한다. 

다양한 표적 분자에 대한 재배열 항체 유전자의 거대 공급원을 제공하기 위한 초대규모의 네이브 인간 scFv 라 

이브러리가 존재하여 왔으며 생성될 수 있다. 질환-특이적 항체를 단리하기 위해, 감염성 질환을 갖는 개인으 

로부터 소규모 라이브러리를 구축할 수 있다 (문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43 

(1992)]; [Zebedee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992)] 참조). 

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일반적으로, 인간으로부터 얻어진 항체 분자는 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 부류 중 임의의 것과 관련되어 있으 

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며, 이들은 분자 내에 존재하는 중쇄의 특성이 서로 다르다. 또한, 특정 부류는 하위 부류, 예컨대 IgG1, IgG2 

등을 갖는다. 또한, 인간에서 경쇄는 카파 쇄 또는 람다 쇄일 수 있다. 

용어 "항원-결합 부위" 또는 "결합 부분"은 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 일부를 나타낸다. 항원 

결합 부위는 중("H")쇄 및 경("L")쇄의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영 

역"으로 지칭되는, 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내에 있는 3개의 고도로 분기된 스트레치는 "프레임워크 영역" 또는 

"FR"로 알려져 있는 보다 보존된 플랭킹 스트레치들 사이에 개재되어 있다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린 

의 초가변 영역들 사이에 천연적으로 존재하며 이들 영역에 인접한 아미노산 서열을 나타낸다. 항체 분자에서, 

경쇄의 3개 초가변 영역 및 중쇄의 3개 초가변 영역은 항원-결합 표면을 형성하도록 서로에 대해 3차원 공간으 

로 배치된다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면과 상보적이며, 중쇄 및 경쇄 각각의 3개 초가변 영 

역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 11A 및 256 항체의 VH 및 VL 영역에 대한 CDR은 도 1 및 도 

6에 각각 제시되어 있다. 

본원에서 사용된 용어 "에피토프"는 면역글로불린, scFv 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의 

의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로, 분자의 화학적 활성 표면 기들, 예컨대 아미노 

산 또는 당 측쇄로 구성되고, 일반적으로 특정 3차원 구조 특성 및 특정 하전 특성을 갖는다. 예를 들어, 항체 

는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 펩티드에 대해 생성될 수 있다. 

본원에서 사용된 용어 "면역학적 결합" 및 "면역학적 결합 특성"은, 면역글로불린 분자 및 항원 (면역글로불린 

이 이에 대해 특이적임) 사이에 발생하는 유형의 비-공유 결합성 상호작용을 나타낸다. 면역학적 결합 상호작 

용의 강도 또는 친화성은 상호작용의 해리 상수 (Kd)에 의해 표현될 수 있고, 이때 Kd가 작을수록 친화성이 

높다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 정량화할 수 

있다. 한 방법은, 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 포함하며, 이러한 속도는 

복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화성, 및 양방향으로 속도에 동등한 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 

따라 달라진다. 따라서, "온(on) 속도 상수" (Kon) 및 "오프(off) 속도 상수" (Koff)는 농도 및 실제 결합 및 

해리 속도의 계산에 의해 결정될 수 있다 (문헌 [Nature 361:186-87 (1993)] 참조). Koff/Kon의 비율은 친화성 

과 관련되지 않은 모든 파라미터를 해제시킬 수 있으며, 해리 상수 Kd와 동일하다 (일반적으로, 문헌 [Davies 

et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473] 참조). 본 발명의 항체는, 방사성리간드 결합 검정 또는 당업 

자에게 공지된 유사한 검정과 같은 검정에 의해 측정시 평형 결합 상수 (Kd)가 ≤1 μM, 바람직하게는 ≤100 

nM, 보다 바람직하게는 ≤10 nM, 가장 바람직하게는 ≤100 pM 내지 약 1 pM인 경우에 인플루엔자 에피토프와 특 

이적으로 결합하는 것으로 판단된다. 

본 발명의 인플루엔자 단백질 (예를 들어, HA 또는 뉴라미니다제) 또는 그의 유도체, 단편, 유사체, 동족체 또 

는 병렬상동체(ortholog)는, 단백질 성분과 면역특이적으로 결합하는 항체의 생성시에 면역원으로서 사용될 수 

있다. 

당업자는, 소정의 인간 모노클로날 항체가 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 동일한 특이성을 갖는지 여부를, 

전자가 후자와 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 결합을 방지하는지 여부를 확인함으로써 과도한 실험 없이 결 

정할 수 있음을 알 것이다. 시험 인간 모노클로날 항체가 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 경쟁하는 경우 

(본 발명의 인간 모노클로날 항체에 의한 결합 감소로 나타남), 두 모노클로날 항체는 동일하거나 밀접하게 관 

련된 에피토프에 결합하는 것으로 보인다. 

소정의 인간 모노클로날 항체가 본 발명의 인간 모노클로날 항체의 특이성을 갖는지 여부를 결정하는 또다른 방 

법은, 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 인플루엔자 HA 단백질 (통상적으로, 이는 상기 항체와 반응함)과 함께 

사전-인큐베이션한 후에 시험 인간 모노클로날 항체를 첨가하여, 시험 인간 모노클로날 항체가 HA 단백질과 결 

합하는 능력이 억제되는지 여부를 결정하는 것이다. 시험 인간 모노클로날 항체가 억제되는 경우, 아마도 상기 

항체는 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하거나 기능적으로 동등한 에피토프 특이성을 갖는다. 또한, 인플루 

엔자 바이러스를 이용하여 시험 모노클로날 항체가 인플루엔자 바이러스를 중화시킬 수 있는지 여부를 결정함으 

로써 본 발명의 인간 모노클로날 항체의 스크리닝이 수행될 수 있다. 

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본 발명의 단백질 또는 그의 유도체, 단편, 유사체, 동족체 또는 병렬상동체에 대한 폴리클로날 또는 모노클로 

날 항체의 생성을 위해 당업계에 공지된 다양한 절차가 이용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Antibodies: A 

Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring 

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Harbor, NY] (본원에 참고로 포함됨) 참조). 

항체는 잘 알려져 있는 기술, 예컨대 주로 면역 혈청의 IgG 분획을 제공하는, 단백질 A 또는 단백질 G를 이용한 

친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 이어서 (또는 별법으로), 발견된 면역글로불린의 표적인 특이 

적 항원 또는 그의 에피토프는, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 면역 특이적 항체를 정제하기 위해 컬럼 상 

에 고정시킬 수 있다. 면역글로불린의 정제는, 예를 들어 미국 펜실베이니아주 필라델피아에 소재한 더 사이언 

티스트, 인크.(The Scientist, Inc.)에 의해 출판된 문헌 [D. Wilkinson, The Scientist, Vol. 14, No. 8 

(April 17, 2000), pp. 25-28]에서 논의되었다. 

본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "MAb" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은, 고유한 경쇄 유전자 생 

성물 및 고유한 중쇄 유전자 생성물로 구성된 단독 분자 종의 항체 분자를 함유하는 항체 분자들의 집단을 나타 

낸다. 특히, 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAb는 고유한 결합 

친화성을 특징으로 하는 항원의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위를 함유한다. 

모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 

방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 여타 적절한 숙주 동물을 전형 

적으로, 면역제로 면역화시켜 면역제와 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 도출 

한다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 

면역제는 전형적으로, 단백질 항원, 그의 단편 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기 

원의 세포가 필요한 경우에는 말초 혈액 림프구를 사용하거나, 비-인간 포유동물 공급원이 필요한 경우에는 비 

장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 이후, 적합한 융합제 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜)를 사용하여 림프구 

를 불멸화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: 

Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]). 불멸화 세포주는 일반적으로 형질전환된 포 

유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주 

가 사용된다. 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1 

종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 히폭산틴 구아닌 포 

스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결여된 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 

전형적으로, HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인 히폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포 

함할 것이다. 

바람직한 불멸화 세포주는, 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 발현 

을 지원하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감성인 것들이다. 보다 바람직한 불멸화 세포주는, 예를 들어 미국 캘 

리포니아주 샌 디에이고에 소재한 소크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution 

Center) 및 미국 버지니아주 매나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture 

Collection)으로부터 얻어질 수 있는 뮤린 골수종 세포주이다. 또한, 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 인 

간 골수종 및 마우스 인간 이종골수종 세포주가 기술된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 

(1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, 

Inc., New York, (1987) pp. 51-63] 참조). 

이어서, 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를, 항원에 대한 모노클로날 항체의 존재 여부에 대해 검정할 

수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 

시험관내 결합 검정법, 예컨대 방사성면역검정법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 검정법 (ELISA)에 의해 결정된 

다. 이러한 기술 및 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌 

[Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캣쳐드(Scatchard) 분석에 의해 측정될 수 있다. 

또한, 모노클로날 항체의 치료적 적용에 있어서, 표적 항원에 대해 고도의 특이성 및 높은 결합 친화성을 갖는 

항체를 확인하는 것이 중요하다. 

필요한 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론을 제한적인 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 

성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) 

pp. 59-103] 참조). 이러한 목적을 위한 적합한 배양 배지로는, 예를 들어 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's 

Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지가 포함된다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 포유동물의 복수 

(ascites)로서 생체내 성장시킬 수 있다. 

공개특허 10-2010-0115346 

서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 배양 배지 또는 복수액으로부터 통상적인 면역글로불린 정제 

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[0117] 

절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로 

마토그래피에 의해 단리 또는 정제될 수 있다. 

모노클로날 항체는 또한, 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 

있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는, 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 

및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용) 용이하게 단리 및 

서열 분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 기능한다. 단리된 

DNA는 발현 벡터 내에 도입될 수 있고, 이어서 이는 숙주 세포, 예컨대 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 

(CHO) 세포, 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포로 형질감염되어 재조합 숙주 세포에 

서의 모노클로날 항체 합성을 달성한다. DNA는 또한, 예를 들어 동족체 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 

불변 도메인을 코딩 서열로 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrison, Nature 368, 812 13 

(1994)] 참조) 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열과 공 

유 결합시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인으로 

치환될 수 있거나, 본 발명의 항체의 한 항원 조합 부위의 가변 도메인으로 치환되어 키메라 2가 항체를 생성할 

수 있다. 

완전 인간 항체는, 경쇄 및 중쇄의 전체 서열 (CDR 포함)이 인간 유전자로부터 유래된 항체 분자이다. 이러한 

항체는 본원에서 "인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"로 지칭된다. 인간 모노클로날 항체는 트리오마(trioma) 

기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (문헌 [Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4:72] 참조); 및 인간 모노 

클로날 항체를 생성하기 위한 EBV 하이브리도마 기술 (문헌 [Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES 

AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 참조)을 이용함으로써 제조될 수 있다. 인간 모노클로 

날 항체가 사용될 수 있으며, 이는 인간 하이브리도마를 사용하거나 (문헌 [Cote, et al., 1983. Proc Natl 

Acad Sci USA 80: 2026-2030] 참조) 시험관 내에서 인간 B 세포를 엡스테인 바(Epstein Barr) 바이러스로 형질 

전환시킴으로써 (문헌 [Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, 

Inc., pp. 77-96] 참조) 생성될 수 있다. 

또한, 인간 항체는 추가적인 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 생성될 수 있다 (문헌 

[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)] 

참조). 이와 유사하게, 인간 면역글로불린 좌위를 트랜스제닉 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자가 

부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내에 도입함으로써 인간 항체가 제조될 수 있다. 접종시에 인간 항 

체 생성이 관찰되며, 이는 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 측면에서, 인간에서 나타나는 

것과 밀접하게 유사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825 

호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 

(1992)]; [Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)]; [Fishwild 

et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)]; 및 

문헌 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)]에 기재되어 있다. 

또한, 항원 접종에 반응하는 동물의 내인성 항체가 아닌, 완전 인간 항체를 생성하도록 변형된 트랜스제닉 비- 

인간 동물을 사용하여 인간 항체를 생성할 수 있다 (PCT 공보 WO 94/02602 참조). 비-인간 숙주의 면역글로불 

린 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 내인성 유전자를 무능화시키고, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 활성 

좌위를 숙주의 게놈 내에 삽입한다. 예를 들어, 필수적인 인간 DNA 절편을 함유하는 효모 인공 염색체를 이용 

하여 인간 유전자를 도입시킨다. 이후, 보다 적은 수의 완전 상보성의 변형들을 함유하는 중간 트랜스제닉 동 

물들을 교차교배시킴으로써, 필요한 모든 변형을 제공하는 동물이 자손으로 얻어진다. 이러한 비-인간 동물의 

바람직한 실시양태는 마우스이며, PCT 공보 WO 96/33735 및 WO 96/34096에 개시된 바와 같은 제노마우스 

(Xenomouse)로 지칭된다. 이 동물은 완전 인간 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생성한다. 항체는 동물로 

부터 관심 면역원에 의한 면역화 후에, 예를 들어 폴리클로날 항체의 생성물로서 얻어지거나, 또는 별법으로, 

동물로부터 유래된 불멸화 B 세포, 예컨대 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 얻어질 수 있다. 

또한, 인간 가변 영역을 갖는 면역글로불린을 코딩하는 유전자를 회수 및 발현시켜 항체를 직접 생성할 수 있거 

나, 또는 추가로 변형시켜 항체의 유사체, 예를 들어 단일 쇄 Fv (scFv) 분자를 생성할 수 있다. 

공개특허 10-2010-0115346 

내인성 면역글로불린 중쇄의 발현이 결여된 비-인간 숙주 (예를 들어, 마우스)를 생성하는 방법의 예는 미국 특 

허 제5,939,598호에 개시되어 있다. 이는, 배아 줄기 세포의 하나 이상의 내인성 중쇄 좌위로부터 J 절편 유전 

자를 결실시켜 좌위의 재배열을 방지하면서 재배열된 면역글로불린 중쇄 좌위의 전사의 형성을 방지하고 (여기 

서, 결실은 선별 마커를 코딩하는 유전자를 함유하는 표적화 벡터에 의해 수행됨), 선별 마커를 코딩하는 유전 

- 23 -

[0118] 


[0120] 







자를 함유하는 체세포 및 생식세포를 갖는 트랜스제닉 마우스를 배아 줄기 세포로부터 생성하는 것을 포함하는 

방법에 의해 얻어질 수 있다. 

관심 항체, 예컨대 인간 항체를 생성하기 위한 한 방법은 미국 특허 제5,916,771호에 개시되어 있다. 이 방법 

은 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 배양 상태의 한 포유동물 숙주 세포 내에 도입 

하고, 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 다른 포유동물 숙주 세포 내에 도입하고, 두 

세포를 융합시켜 하이브리드 세포를 형성하는 것을 포함한다. 하이브리드 세포는 중쇄 및 경쇄를 함유하는 항 

체를 발현한다. 

상기 절차의 추가적인 개선에 있어서, 면역원 상의 임상 관련 에피토프를 확인하는 방법, 및 높은 친화성을 갖 

는 관련 에피토프와 면역특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위한 상호관련 방법은 PCT 공보 WO 99/53049에 

개시되어 있다. 

항체는 앞서 기재된 단일 쇄 항체를 코딩하는 DNA 절편을 함유하는 벡터에 의해 발현될 수 있다. 

이러한 항체에는 벡터, 리포좀, 네이키드(naked) DNA, 아쥬반트(adjuvant)-보조 DNA, 유전자 건, 카테터 등이 

포함될 수 있다. 벡터에는 표적화 잔기 (예를 들어, 세포 표면 수용체로의 리간드) 및 핵산 결합 잔기 (예를 

들어, 폴리라이신)를 갖는, WO 93/64701에 기재된 바와 같은 화학적 접합체, 표적 잔기 (예를 들어, 표적 세포 

에 특이적인 항체) 및 핵산 결합 잔기 (예를 들어, 프로타민)를 함유하는 융합 단백질인 PCT/US 95/02140 (WO 

95/22618)에 기재된 바와 같은 융합 단백질, 플라스미드, 파지 등이 포함된다. 벡터는 염색체성, 비-염색체성 

또는 합성일 수 있다. 

바람직한 벡터로는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 접합체가 포함된다. 레트로바이러스 벡터로는 몰로 

니(moloney) 뮤린 백별병 바이러스가 포함된다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터로는 폭스(pox) 

벡터, 예컨대 오르토폭스 또는 조류폭스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 예컨대 단순 포진 I 바이러스 (HSV) 벡 

터 (문헌 [Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995)]; [Lim, F., et al., in DNA Cloning: 

Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995)]; [Geller, A. I. et al., 

Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993)]; [Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 

87:1149 (1990)] 참조), 아데노바이러스 벡터 (문헌 [LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993)]; 

[Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993)]; [Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)] 참조) 및 아데노- 

연관 바이러스 벡터 (문헌 [Kaplitt, M. G.. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)] 참조)가 포함된다. 

폭스 바이러스 벡터는 유전자를 세포질 내에 도입시킨다. 조류폭스 바이러스 벡터는 단지 핵산의 짧은 기간 발 

현을 일으킨다. 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 및 단순 포진 바이러스(HSV) 벡터는 핵산을 

중성 세포 내에 도입시키는 데 바람직하다. 아데노바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (약 4개월)의 경우보 

다 짧은 기간의 발현 (약 2개월)을 일으킨다 (또한, HSV 벡터의 경우보다 짧음). 선택된 특정 벡터는 표적 세 

포 및 치료할 병태에 따라 달라질 것이다. 도입은 표준 기술, 예를 들어 감염, 형질감염, 형질도입 또는 형질 

전환에 의해 수행될 수 있다. 유전자 전달 방식의 예에는, 예를 들어 네이키드 DNA, CaPO4 침전, DEAE 덱스트 

란, 전기천공, 원형질체 융합, 리포좀-매개 형질감염, 세포 마이크로주사 및 바이러스 벡터가 포함된다. 

벡터는 임의의 원하는 표적 세포를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 입체정위(stereotaxic) 주사 

는 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, HSV)를 원하는 위치로 지시하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 미니펌프 

주입 시스템, 예컨대 싱크로메드(SynchroMed) 주입 시스템을 이용한 뇌실내(icv) 주입에 의해 입자가 전달될 수 

있다. 벌크 유동 (대류로 지칭됨)에 기초한 방법은 또한, 큰 분자들을 뇌의 확장된 영역에 전달하는 데 있어서 

효과적인 것으로 입증되었으며, 벡터를 표적 세포에 전달하는 데 있어서 유용할 수 있다 (문헌 [Bobo et al., 

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994)]; [Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)] 

참조). 이용될 수 있는 다른 방법으로는 카테터, 정맥내, 비경구, 복강내 및 피하 주사, 및 경구 또는 여타 공 

지된 투여 경로가 포함된다. 

다양한 방식으로 사용될 수 있는 다량의 항체를 발현시켜, 예를 들어 샘플에서 인플루엔자 바이러스의 존재를 

검출하기 위해 상기 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 인플루엔자 바이러스 세포 막 융합체의 결합 및 파괴를 시 

도하기 위해 항체를 사용할 수 있다. 

공개특허 10-2010-0115346 

본 발명의 항원 단백질에 특이적인 단일 쇄 항체의 생성을 위해 기술을 적합화시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 

특허 제4,946,778호 참조). 또한, 단백질 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 동족체에 대한 원하는 특이성 

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[0131] 

[0132] 

[0133] 

을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 효과적인 확인이 가능하도록 Fab 발현 라이브러리를 구축하기 위해 방법 

을 적합화시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281] 참조). 단백질 항원 

에 대한 이디오형(idiotype)을 함유하는 항체 단편은 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 (i) 항체 분자의 펩신 

분해에 의해 생성된 F(ab')2 단편; (ii) F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 환원시킴으로써 생성된 Fab 단편; (iii) 항 

체 분자를 파파인 및 환원제로 처리함으로써 생성된 Fab 단편; 및 (iv) Fv 단편 (이에 제한되지는 않음)에 의해 

생성될 수 있다. 

이종접합체 항체도 본 발명의 범주 내에 있다. 이종접합체 항체는 2개의 공유 결합 항체로 구성된다. 이러한 

항체는, 예를 들어 면역 시스템 세포를 원하지 않는 세포에 대해 표적화시키고 (미국 특허 제4,676,980호 참 

조), HIV 감염을 치료하기 위해 제안되었다 (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 참조). 합성 단백질 화학 

에서 공지된 방법, 예를 들어 가교제를 비롯한 것들을 이용하여 항체를 시험관 내에서 제조할 수 있다는 점도 

고려된다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성함으로써 면역독소를 구축할 

수 있다. 이러한 목적을 위해 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트, 및 

예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 것들이 포함된다. 

예를 들어, 인플루엔자의 치료를 위한 항체 효과를 증진시키기 위해 본 발명의 항체를 이펙터 기능에 대해 변형 

시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입시켜 이 영역에서의 쇄간 

디술피드 결합을 가능하게 할 수 있다. 이렇게 생성된 동종다이머 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 

보체-매개 세포 사멸성 및 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다 (문헌 [Caron et al., J. Exp Med., 

176: 1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)]). 별법으로, 이중 Fc 영역을 가짐 

으로써 증진된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있도록 항체를 조작할 수 있다 (문헌 [Stevenson et al., 

Anti Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)] 참조). 

본 발명은 또한, 세포독성제, 예컨대 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또 

는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 

것이다. 

사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 

외독소 A 쇄 (슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신(ricin) A 쇄, 아브린 A 

쇄, 모데신 A 쇄, 알파 사르신, 알류리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리 

카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제 

제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭 

토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 각종 방사성 핵종이 방사성접합된 항체의 생성을 위 

해 사용될 수 있다. 그 예로는 212 

Bi, 131 

I, 131 

In, 90 

Y 및 186 

Re이 포함된다. 

항체 및 세포독성제의 접합체는 각종 2관능성 단백질-커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피 

오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 

활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 

(예컨대, 비스-(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌 

디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디 

플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., 

Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3- 

메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX DTPA)은 방사성뉴클레오티드와 항체의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제 

이다 (WO 94/11026 참조). 

공개특허 10-2010-0115346 

당업자는, 각종 가능한 잔기가 생성된 항체 또는 본 발명의 다른 분자에 커플링될 수 있음을 알 것이다 (예를 

들어, 문헌 ["Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. 

Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)] 참조 (이 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨)). 

커플링은, 항체 및 여타 잔기가 각각의 활성을 유지하는 한, 2개의 분자와 결합하는 임의의 화학 반응에 의해 

달성될 수 있다. 이러한 결합에는 수많은 화학 메카니즘, 예를 들어 공유 결합, 친화성 결합, 삽입 

(intercalation), 배위 결합 및 착물화가 포함될 수 있다. 그러나, 바람직한 결합은 공유 결합이다. 공유 결 

합은 존재하는 측쇄들의 직접 축합에 의해, 또는 외부 가교 분자들의 도입에 의해 달성될 수 있다. 수많은 2가 

또는 다가 결합제는 단백질 분자, 예컨대 본 발명의 항체를 다른 분자와 커플링시키는 데 유용하다. 예를 

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[0140] 

들어, 대표적인 커플링제에는 티오에스테르, 카르보디이미드, 숙신이미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타 

르알데히드, 디아조벤젠 및 헥사메틸렌 디아민과 같은 유기 화합물이 포함될 수 있다. 상기 목록은 당업계에 

공지된 다양한 커플링제 부류의 전부라기 보다는, 보다 통상적인 커플링제를 예시한다 (문헌 [Killen and 

Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984)]; [Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 

(1982)]; 및 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)] 참조). 바람직한 링커는 문헌에 기재되어 있다 (예 

를 들어, MBS (M-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르)의 용도가 기재된 문헌 [Ramakrishnan, S. 

et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)] 참조). 또한, 올리고펩티드 링커를 통해 항체에 커플링된 할로겐화 

아세틸 히드라지드 유도체의 용도가 기재되어 있는 미국 특허 제5,030,719호를 참조한다. 특히 바람직한 링커 

로는 (i) EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드; (ii) SMPT (4-숙신이미딜옥 

시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔 (피어스 케미컬 컴퍼니(Pierce Chem. Co.), Cat. 

21558G); (iii) SPDP (숙신이미딜-6 [3-(2-피리딜디티오)프로피오아미도]헥사노에이트(피어스 케미컬 컴퍼니, 

Cat #21651G); (iv) 술포-LC-SPDP (술포숙신이미딜-6 [3-(2-피리딜디티오)-프로피안아미드]헥사노에이트 (피어 

스 케미컬 컴퍼니, Cat. #2165-G); 및 (v) EDC에 접합된 술포-NHS (N-히드록시술포-숙신이미드: 피어스 케미컬 

컴퍼니, Cat. #24510)가 포함된다. 

상기 링커들은 다양한 속성을 갖는 성분들을 가지며, 이에 따라 다양한 물리화학적 특성을 갖는 접합체가 생성 

된다. 예를 들어, 알킬 카르복실레이트의 술포-NHS 에스테르는 방향족 카르복실레이트의 술포-NHS 에스테르보 

다 안정하다. NHS-에스테르 함유 링커는 술포-NHS 에스테르보다 덜 가용성이다. 또한, 링커 SMPT는 입체적으 

로 방해된 디술파이드 결합을 함유하며, 안정성이 증가된 접합체를 형성할 수 있다. 디술파이드 연결은 일반적 

으로 다른 연결보다 덜 안정한데, 이는 디술파이드 연결이 시험관내에서 절단되어 이용가능한 접합체를 보다 적 

게 생성하기 때문이다. 술포-NHS는 특히 카르보디이미드 커플링의 안정성을 향상시킬 수 있다. 카르보디이미 

드 커플링 (예컨대 EDC)이 술포-NHS와 함께 사용되는 경우, 카르보디이미드 커플링 반응 단독의 경우보다 가수 

분해에 더 내성인 에스테르를 형성한다. 

본원에 개시된 항체는 또한 면역리포좀으로서 제제화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 

방법, 예컨대 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. 

Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호에 기재된 방법에 

의해 제조된다. 순환 시간이 개선된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다. 

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 

지질 조성물을 이용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 한정된 기공 크기의 필터를 통해 압출 

되어 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 생성한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술파이드-상호교환 반응을 통 

해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 

있다. 

인플루엔자 바이러스에 대한 항체의 용도 

목적하는 특이성을 갖는 항체를 스크리닝하는 방법은 효소 기반 면역흡착 검정 (ELISA) 및 당업계에 공지된 다 

른 면역학적 매개 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 

인플루엔자 바이러스 단백질, 예컨대 HA (또는 이의 단편)에 대해 지시된 항체는 인플루엔자 바이러스 단백질의 

국부화 및/또는 정량화와 관련된 업계에 공지된 방법에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 적절한 생리학적 샘플 내 

인플루엔자 바이러스 단백질의 수준의 측정, 진단 방법, 단백질의 영상화 등에 사용). 소정의 실시양태에서, 

항체 유래 항원 결합 도메인을 함유하는, 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상 

동체에 특이적인 항체가 약리학상 활성인 화합물로서 이용된다 (이하에서 "치료제"로서 지칭됨). 

공개특허 10-2010-0115346 

본 발명의 인플루엔자 바이러스 단백질에 특이적인 항체는 표준 기술, 예컨대 면역친화성, 크로마토그래피 또는 

면역침전법에 의해 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드를 단리하는데 사용될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 단백 

질 (또는 이의 단편)에 대해 지시된 항체는 임상 시험 절차의 일부로서 조직 내 단백질 수준을 모니터링하기 위 

해, 예를 들어 소정의 치료 투약법의 효능을 결정하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출가 

능한 물질에 커플링 (즉, 물리적으로 연결)시켜 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예에는 다양한 효소, 보결 

기, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예에는 양고추냉이 퍼옥 

시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되고; 적합한 보결기 복합체 

의 예에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되고; 적합한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오 

레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또 

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[0148] 

는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되고; 생체발광 물질의 예에는 루시페라제, 루 

시페린 및 애쿠오린이 포함되며; 적합한 방사성 물질의 예에는 125 

I, 131 

I, 35 

S 또는 3 

H가 포함된다. 

폴리클로날, 모노클로날, 인간화 및 완전 인간 항체를 비롯한 본 발명의 항체는 치료제로서 사용될 수 있다. 

이러한 작용제는 일반적으로 대상체에서 인플루엔자 바이러스-관련 질환 또는 병증 (예를 들어, 조류 독감)을 

치료 또는 예방하는데 사용될 것이다. 항체 제제, 바람직하게는 표적 항원에 대한 고특이성 및 고친화성을 갖 

는 항체 제제가 대상체에 투여되며, 일반적으로 표적과의 결합으로 인해 효과를 나타낼 것이다. 항체의 투여는 

바이러스의 세포 내로의 내재화를 취소하거나 억제하거나 방해할 수 있다. 이 경우, 항체는 표적에 결합하며, 

천연적으로 발생한 리간드의 결합 부위를 차폐하여, 바이러스가 세포 막에 융합하는 것을 차폐함으로써 바이러 

스의 내재화를 억제한다. 

본 발명의 항체의 치료 유효량은 일반적으로 치료 목적을 달성하는데 필요한 양에 관한 것이다. 상기 나타낸 

바와 같이, 이는 항체와 그의 표적 항원 사이의 결합 상호작용 (특정 경우에서는 표적의 기능을 방해함)일 수 

있다. 또한, 투여에 필요한 양은 특이적 항원에 대한 항체의 결합 친화성에 좌우될 것이며, 투여된 항체가 투 

여된 다른 대상체의 자유 부피로부터 고갈되는 비율에도 좌우될 것이다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 치 

료 유효 투여량에 대한 통상적인 범위는 비제한적인 예로서, 체중 1 kg 당 약 0.1 mg 내지 체중 1 kg 당 약 50 

mg일 수 있다. 통상적인 투여 빈도는 예를 들어 1일에 2회 내지 1주에 1회일 수 있다. 

인플루엔자 바이러스 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체, 및 본원에 개시된 스크리 

닝 검정에 의해 확인된 다른 분자는 제약 조성물의 형태로 인플루엔자 바이러스-관련 장애의 치료를 위해 투여 

될 수 있다. 상기 조성물의 제조와 관련된 원리 및 고려사항, 및 성분의 선택에 있어서의 지침은 예를 들어 문 

헌 [Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) 

Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1995]; [Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, 

And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994]; 및 [Peptide And Protein Drug Delivery 

(Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York]에 제공되어 있다. 

항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제성 단편이 바람 

직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 기준으로, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 

분자가 디자인될 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다 

(예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)] 참조). 제제는 또한 

치료될 특정 적응증에 필요한 1개 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보 

적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 조성물은 그의 기능을 향상시키는 작용제, 

예를 들어 세포독성제, 시토카인, 화학치료제 또는 성장억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 

의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 존재한다. 

또한, 활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각 

각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드성 

약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 

마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균성이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 

지속 방출형 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체 

의 반투과성 매트릭스 (이 매트릭스는 성형품의 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐임)가 포함된다. 지속 

방출형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴 

리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비- 

분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포트(LUPRON DEPOT) TM 

트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3-히드 

록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일에 걸쳐 분자를 

방출시킬 수 있는 반면, 특정 히드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 

본 발명에 따른 항체는 샘플에서 인플루엔자 바이러스 (또는 단백질 또는 이의 단백질 단편)의 존재를 검출하기 

위한 작용제로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 검출가능한 표지를 함유한다. 항체는 폴리클로날이거 

나, 또는 보다 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 무손상 항체 또는 이의 단편 (예를 들어, Fab, scFv 또는 

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(락

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F(ab)2)이 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련된 용어 "표지된"은, 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 

커플링 (즉, 물리적으로 연결)시키는 프로브 또는 항체의 직접적인 표지화 뿐만 아니라, 직접 표지되는 또다른 

시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지화를 포함하는 것으로 의도된다. 간적접인 표지화의 

예에는 형광-표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체의 검출 및 형광-표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 비 

오틴에 의한 DNA 프로브의 말단-표지화가 포함된다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 

및 생물학적 유체 뿐만 아니라, 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하는 것으로 의도된다. 따라 

서, 용어 "생물학적 샘플"의 용도 내에는 혈액 및 혈액 혈청, 혈액 혈장 또는 림프를 비롯한 혈액의 분획 또는 

성분이 포함된다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 시험관내에서 뿐만 아니라 생체내에서 생물학적 샘플 내의 분석 

물인 mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석물인 mRNA의 검출을 위한 시 

험관내 기술은 노던(Northern) 혼성화 및 계내 혼성화를 포함한다. 분석물인 단백질의 검출을 위한 시험관내 

기술은 효소 기반 면역흡착 검정 (ELISA), 웨스턴(Western) 블롯, 면역침전법 및 면역형광법을 포함한다. 분석 

물인 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 서던(Southern) 혼성화를 포함한다. 면역검정을 수행하기 위한 

절차는 예를 들어 문헌 ["ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. 

Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995]; ["Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, 

Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996]; 및 ["Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. 

Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985]에 기재되어 있다. 또한, 분석물인 단백질의 검출을 

위한 생체내 기술은 대상체 내로 표지된 항-분석물인 단백질 항체를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체 

는 대상체에서의 존재 및 위치를 표준 영상화 기술에 의해 검출할 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다. 

제약 조성물 

본 발명의 항체 또는 작용제 (또한 본원에서 "활성 화합물"로 지칭됨) 및 이의 유도체, 단편, 유사체 및 상동체 

는 투여에 적합한 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 항체 또는 작용제 및 제약상 

허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여에 상용성인 임의의 및 모 

든 용매, 분산성 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 

적합한 담체는 본원에 참조로 포함된 당업계의 표준 참조 문헌인 [Remington's Pharmaceutical Sciences]의 가 

장 최신판에 기재되어 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예에는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용 

액 및 5% 인간 혈청 알부민이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 리포좀 및 비-수성 비히클, 예컨대 고정유 

가 또한 사용될 수 있다. 제약상 활성인 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 용도는 당업계에 널리 공지되어 

있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 조성물에서 그의 사 

용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 

본 발명의 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제제화된다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예 

를 들어 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (즉, 국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 비 

경구, 피내 또는 피하 적용에 사용된 용액 또는 현탁액은 다음 성분을 포함할 수 있다: 멸균성 희석제, 예컨대 

주사용수, 식염수액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예 

컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이팅제, 예컨대 

에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA); 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 장성 

조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 

수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 투여 바이알 중에 동 

봉될 수 있다. 

주사가능한 용도에 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 주사가능한 멸균 용액 

또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정 

균수, 크레모포르 EL(Cremophor EL) TM 

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(바스프, 뉴저지주 파르시파니 소재) 또는 포스페이트 완충 식염수 (PB 

S)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균성이어야 하며, 용이하게 주사가능할 정도로 유동화되어야 한다. 

제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 

담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 

등)을 함유하는 용매 또는 분산성 매질 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시 

틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 

의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페 

놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에서, 조성물에 등장성제, 예를 들어 당, 폴 

리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 

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흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 

일어날 수 있다. 

주사가능한 멸균 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 필요한 경우 상기 열거한 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 

적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기 

성 분산 매질 및 상기 열거한 성분과 다른 필요 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 주 

사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 활성 성분에 더하여 사전 멸균 여과된 용액 

으로부터의 임의의 추가적인 목적 성분을 생성하는 진공 건조 및 냉동 건조이다. 

경구 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 동봉되거나 정제 

로 압축될 수 있다. 경구 치료 투여의 목적을 위해서, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되며, 정제, 트로키제 

또는 캡슐제의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세척제로서 사용하기 위해 유동성 담체를 사용 

하여 제조될 수 있으며, 여기서 유동성 담체 중의 화합물은 경구 적용되고, 스위싱되고(swished), 뱉어지거나 

삼켜진다. 제약상 상용성인 결합제 및/또는 보조 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡 

슐제, 트로키제 등은 하기 성분 중 임의의 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 

미결정질 셀룰로스, 트래거캔쓰 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 부형제, 예컨대 알긴산, 프 

리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes); 활택 

제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메 

틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제. 

흡입에 의한 투여의 경우, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 기체 또는 연무제를 함유하는 

가압 용기 또는 분배기로부터 에어로졸 분무의 형태로 전달된다. 

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과될 장 

벽에 적절한 침투제가 제제 중에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 

경점막 투여의 경우 세제(detergent), 담즙염 및 후시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 분무 또는 

좌제의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같은 

연고, 고약, 겔 또는 크림 내로 제제화된다. 

화합물은 또한 좌제 (예를 들어 코코아 버터 및 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌제 기재를 갖는 것) 또는 

직장 전달을 위한 정체 관장제의 형태로 제조될 수 있다. 

한 실시양태에서, 활성 화합물은 화합물을 신체로부터의 신속한 제거에 대해 보호하는 담체, 예컨대 임플란트 

및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제로 제조된다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예컨대 

에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 

있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 물질은 알자 코포레이션(Alza 

Corporation) 및 노바 파마슈티칼즈, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 구입할 수 있다. 또한, 리포 

좀 현탁액 (바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포에 표적화된 리포좀 포함)이 제약상 허용되는 

담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 방법 

에 따라 제조될 수 있다. 

경구 또는 비경구 조성물을 투여 용이성 및 투여 균일성을 위한 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하 

다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 

지칭하며, 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 예정량의 활성 화 

합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 상세설명은, 활성 화합물의 고유 특성 및 달성될 특정 치 

료 효과, 및 개체의 치료를 위한 상기 활성 화합물의 배합 기술에 고유한 제한에 의해 기술되며 그에 직접적으 

로 좌우된다. 

제약 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 팩 또는 분배기에 포함될 수 있다. 

스크리닝 방법 

본 발명은 세포 막에의 인플루엔자 바이러스 융합을 조절하거나 방해하는 조절제, 즉 후보 또는 시험 화합물 또 

는 작용제 (예를 들어, 펩티드, 펩티드모방체, 소분자 또는 다른 약물)를 확인하는 방법 (본원에서 "스크리닝 

검정"이라고도 지칭됨)을 제공한다. 또한, 인플루엔자 감염을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는 방법을 제 

공한다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 스크리닝 검정을 사용하여 확인된 화합물을 포함한다. 

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예를 들어, 본 발명은 인플루엔자 바이러스와 세포 막 사이의 상호작용을 조절하는 후보 또는 시험 화합물을 스 

크리닝하기 위한 검정을 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 생물학적 라이브러리; 공간적으로 어드레스할 수 

있는 병렬 고체 상 또는 용액 상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; 

"1-비드 1-화합물(one-bead one-compound)" 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용하는 합성 

라이브러리 방법을 비롯한 당업계에 공지된 조합 라이브러리 방법에 있어서 수많은 접근법 중 임의의 접근법을 

사용하여 수득될 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리로 제한되지만, 다른 네가지 접근 

법은 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 적용가능하다. (예를 들어, 문헌 [Lam, 

1997. Anticancer Drug Design 12: 145] 참조). 

본원에 사용된 "소분자"는 분자량이 약 5 kD 미만, 가장 바람직하게는 약 4 kD 미만인 조성물을 지칭함을 의미 

한다. 소분자는 예를 들어, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 탄수화물, 지질 또는 다른 유기 또는 무 

기 분자일 수 있다. 진균, 세균 또는 해조류 추출물과 같은 화학적 및/또는 생물학적 혼합물의 라이브러리는 

당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 임의의 검정에 의해 스크리닝될 수 있다. 

분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 당업계에서, 예를 들어 문헌 [DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. 

Sci. U.S.A. 90: 6909]; [Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422]; [Zuckermann, et 

al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678]; [Cho, et al., 1993. Science 261: 1303]; [Carrell, et al., 1994. 

Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059]; [Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061]; 

및 [Gallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233]에서 발견할 수 있다. 

화합물의 라이브러리는 용액 중에 (예를 들어, 문헌 [Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421] 참조), 또 

는 비드 상에 (문헌 [Lam, 1991. Nature 354: 82-84] 참조), 칩 상에 (문헌 [Fodor, 1993. Nature 364: 555- 

556] 참조), 세균 상에 (미국 특허 제5,223,409호 참조), 포자 상에 (미국 특허 제5,233,409호 참조), 플라스미 

드 상에 (문헌 [Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869] 참조) 또는 파지 상에 (문헌 

[Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390]; [Devlin, 1990. Science 249: 404-406]; [Cwirla, et al., 

1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382]; [Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310]; 및 미 

국 특허 제5,233,409호 참조) 존재할 수 있다. 

한 실시양태에서, 후보 화합물을 항체-항원 복합체에 도입하여, 후보 화합물이 항체-항원 복합체를 파괴하는지 

여부를 결정하며, 여기서 이러한 복합체의 파괴는 후보 화합물이 인플루엔자 바이러스와 세포 막 사이의 상호작 

용을 조절함을 나타낸다. 예를 들어, 항체는 모노클로날 항체 D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, 

및 H98일 수 있고, 항원은 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 상에 위치할 수 있다. 

또다른 실시양태에서, 1종 이상의 중화 모노클로날 항체에 노출되는 1종 이상의 HA 단백질이 제공된다. 항체- 

항원 복합체의 형성이 검출되고, 1종 이상의 후보 화합물이 복합체에 도입된다. 1종 이상의 후보 화합물의 도 

입 후에 항체-항원 복합체가 파괴된다면, 후보 화합물은 인플루엔자 바이러스-관련 질환 또는 장애, 예를 들어 

조류 독감을 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 1종 이상의 인플루엔자 바이러스 단백질은 인플루엔자 바이러스 

분자로서 제공될 수 있다. 

항체-항원 복합체를 방해하거나 파괴하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은, 예를 들어 항원 또는 이의 생물 

학적으로 활성인 부분에 대한 시험 화합물의 결합이 복합체 중 표지된 화합물의 검출에 의해 결정될 수 있도록 

시험 화합물을 방사성 동위원소 또는 효소 표지와 커플링시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물 

은 125 

I, 35 

S, 14 

C 또는 3 

H에 의해 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있으며, 방사성 동위원소는 방사성 방출의 직 

접적인 계수 또는 섬광 계수에 의해 검출될 수 있다. 별법으로, 시험 화합물은 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다 

제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시퍼라제에 의해 효소적으로 표지될 수 있으며, 효소 표지는 생성물에 대한 적 

절한 기질의 전환의 결정에 의해 검출될 수 있다. 

한 실시양태에서, 검정은 항체-항원 복합체를 시험 화합물과 접촉시키고, 항원과 상호작용하거나 또는 존재하는 

항체-항원 복합체를 파괴하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다. 이 실시양태에서, 항원과 상호작 

용하고/거나 항체-항원 복합체를 파괴하는 시험 화합물의 능력의 결정은, 항체에 비해 항원 또는 이의 생물학적 

으로 활성인 부분에 우선적으로 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다. 

공개특허 10-2010-0115346 

또다른 실시양태에서, 검정은 항체-항원 복합체를 시험 화합물과 접촉시키고, 항체-항원 복합체를 조절하는 시 

험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다. 항체-항원 복합체를 조절하는 시험 화합물의 능력의 결정은, 예 

를 들어 시험 화합물의 존재 하에 항체에 결합하거나 항체와 상호작용하는 항원의 능력을 결정함으로써 수행될 

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수 있다. 

당업자는 본원에 개시된 임의의 스크리닝 방법에서 항체가 인플루엔자 바이러스 중화 항체, 예컨대 모노클로날 

항체 D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90 및 H98일 수 있다는 것을 인식할 것이다. 추가로, 항원은 

HA 단백질 또는 이의 일부분일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 검정에서, D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, 

E88, E90 및 H98 모노클로날 항체와 HA 단백질 사이의 결합을 방해하는 후보 화합물의 능력은, 후보 화합물이 

인플루엔자 바이러스와 세포 막의 융합을 방해하거나 조절할 수 있을 것임을 나타낸다. 또한, 세포에 대한 HA 

단백질의 결합이 세포 내로의 인플루엔자 바이러스 진입의 원인이 되기 때문에, 상기 후보 화합물은 또한 인플 

루엔자 바이러스 관련 질환 또는 장애, 예를 들어 조류 독감의 치료에 유용할 것이다. 

본원에 개시된 스크리닝 방법은 세포-기재 검정 또는 세포-부재 검정으로서 수행될 수 있다. 본 발명의 세포- 

부재 검정은 HA 단백질 및 이의 단편의 가용성 형태 또는 막-결합 형태 둘 다를 사용할 수 있다. HA 단백질의 

막-결합 형태를 포함하는 세포-부재 검정의 경우, 단백질의 막-결합 형태가 용액 중에서 유지되도록 가용화제를 

이용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 가용화제의 예에는 비-이온성 세제, 예컨대 n-옥틸글루코시드, n-도 

데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥타노일-N-메틸글루카미드, 데카노일-N-메틸글루카미드, 트리톤(Triton) 

X-100, 트리톤 X-114, 테시트(Thesit) , 이소트리데시폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n, N-도데실--N,N-디메틸- 

3-암모니오-1-프로판 술포네이트, 3-(3-콜라미도프로필)디메틸암미니올-1-프로판 술포네이트 (CHAPS) 또는 3- 

(3-콜라미도프로필)디메틸암미니올-2-히드록시-1-프로판 술포네이트 (CHAPSO)가 포함된다. 

1개 초과의 실시양태에서, 항체 또는 항원을 고정시켜 후보 화합물의 하나 또는 모든 후속 도입의 비복합체 형 

태로부터 복합체 형태의 분리를 촉진할 뿐만 아니라 검정의 자동화를 적응시키는 것이 바람직할 수 있다. 후보 

화합물의 존재 및 부재 하에 항체-항원 복합체를 관찰하는 것은 반응물 함유에 적합한 임의의 용기에서 수행될 

수 있다. 이러한 용기의 예에는 마이크로티터 플레이트, 시험관 및 마이크로-원심분리 튜브가 포함된다. 한 

실시양태에서, 하나 또는 모든 단백질이 매트릭스에 결합되도록 하는 도메인이 부가된 융합 단백질이 제공될 수 

있다. 예를 들어, GST-항체 융합 단백질 또는 GST-항원 융합 단백질을 글루타치온 세파로스 비드 (시그마 케미 

칼(Sigma Chemical), 미주리주 세인트 루이스 소재) 또는 글루타치온 유도체화 마이크로티터 플레이트 상에 흡 

착시킨 다음, 시험 화합물과 조합하고, 혼합물을 복합체 형성에 도움되는 조건 하에서 (예를 들어, 염 및 pH에 

대한 생리학적 조건에서) 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 후, 비드 또는 마이크로티터 플레이트 웰을 세척 

하여 임의의 비결합 성분을 제거하고, 비드의 경우 매트릭스를 고정시키고, 복합체를 직접 또는 간접적으로 결 

정한다. 별법으로, 복합체를 매트릭스로부터 해리시킬 수 있으며, 항체-항원 복합체 형성의 수준을 표준 기술 

을 사용하여 결정할 수 있다. 

또한, 매트릭스 상에 단백질을 고정시키는 다른 기술이 본 발명의 스크리닝 검정에 사용될 수 있다. 예를 

들어, 항체 또는 항원은 비오틴과 스트렙타비딘의 접합을 이용하여 고정될 수 있다. 비오티닐화 항체 또는 항 

원 분자는 당업계에 널리 공지된 기술 (예를 들어, 비오티닐화 키트, 피어스 케미칼즈(Pierce Chemicals), 일리 

노이주 록포드 소재)을 사용하여 비오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조되고, 스트렙타비딘-코팅된 96 

웰 플레이트 (피어스 케미칼)의 웰 내에 고정될 수 있다. 별법으로, 관심 항체 또는 항원과 반응성이지만 관심 

항체-항원 복합체의 형성을 방해하지 않는 다른 항체는 플레이트의 웰에 유도체화될 수 있으며, 비결합 항체 또 

는 항원은 항체 접합에 의해 웰에 포획될 수 있다. GST-고정된 복합체에 대해 상기 기재된 방법에 더하여, 상 

기 복합체를 검출하는 방법은, 항체 또는 항원과 반응성인 다른 항체를 사용하는 복합체의 면역검출을 

포함한다. 

본 발명은 또한 상기 언급된 임의의 스크리닝 검정에 의해 확인된 신규 작용제 및 본원에 기재된 치료를 위한 

그의 용도에 관한 것이다. 

진단 검정 

공개특허 10-2010-0115346 

본 발명의 항체는 적절한 검정, 예를 들어 통상적인 유형의 면역검정에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 인플 

루엔자 단백질 (예를 들어, HA1, HA2 또는 뉴로미니다제) 또는 이의 단편을 고체 상에 고정시키는 검정이 수행 

될 수 있다. 인큐베이션은 샘플 중의 항체가 고체 상에 고정된 폴리펩티드에 결합하도록 충분한 시간 동안 유 

지된다. 이러한 제1 인큐베이션 후에, 고체 상은 샘플로부터 분리된다. 고체 상은 세척되어 비결합 물질 및 

방해 물질, 예컨대 샘플 중에 또한 존재할 수 있는 비-특이적 단백질을 제거한다. 이후, 고정된 폴리펩티드에 

결합된 관심 항체를 함유하는 고체 상은 제2의 표지된 항체 또는 비오틴 또는 아비딘과 같은 커플링제에 결합된 

항체와 함께 인큐베이션된다. 이러한 제2 항체는 또다른 항-인플루엔자 항체 또는 또다른 항체일 수 있다. 항 

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체에 대한 표지는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 방사성핵종, 효소 (예를 들어 말레에이트 탈수소효소, 양고 

추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, 카탈라제), 플루오르 (플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 피 

코시아닌, 플루오레스카르민), 비오틴 등이 포함된다. 표지된 항체는 고체와 인큐베이션되며, 고체 상에 결합 

된 표지가 측정된다. 이들 및 다른 면역검정은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 

(생물학적 샘플 중) 인플루엔자 바이러스의 존재 또는 부재를 검출하는 예시적인 방법은, 시험 대상체로부터 생 

물학적 샘플을 수득하고 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 표지된 모노클로날 또는 scFv 항체와 접촉시켜 생물학 

적 샘플 중 인플루엔자 바이러스의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 

프로브 또는 항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링 

(즉, 물리적으로 연결)시키는 프로브 또는 항체의 직접적인 표지화 뿐만 아니라, 직접 표지되는 또다른 시약과 

의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 표지화를 포함하는 것으로 의도된다. 간적접인 표지화의 예에 

는 형광 표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체의 검출 및 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴 

에 의한 DNA 프로브의 말단 표지화가 포함된다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 및 

생물학적 유체 뿐만 아니라, 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하는 것으로 의도된다. 즉, 본 

발명의 검출 방법은 시험관내에서 뿐만 아니라 생체내에서 생물학적 샘플 중 인플루엔자 바이러스를 검출하는데 

사용될 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 기반 면역흡착 검정 

(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전법 및 면역형광법을 포함한다. 또한, 인플루엔자 바이러스의 검출을 위한 생체 

내 기술은 표지된 항-인플루엔자 바이러스 항체의 대상체 내로의 도입을 포함한다. 예를 들어, 항체는 대상체 

에서의 존재 및 위치를 표준 영상화 기술에 의해 검출할 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다. 

한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 시험 대상체로부터의 단백질 분자를 함유한다. 한 바람직한 생물학적 샘플 

은 대상체로부터 통상적인 수단에 의해 단리된 말초 혈액 백혈구 샘플이다. 

본 발명은 또한 생물학적 샘플 중 인플루엔자 바이러스의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 예를 들어, 

키트는 생물학적 샘플 중 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 작용제 (예를 들어, 항-인 

플루엔자 scFv 또는 모노클로날 항체); 샘플 중 인플루엔자 바이러스의 양을 측정하기 위한 수단; 및 샘플 중 

인플루엔자 바이러스의 양과 표준을 비교하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 화합물 또는 작용제는 적합한 용기 

에 포장될 수 있다. 키트는 또한 샘플에서 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 키트의 사용설명서를 포함할 

수 있다. 

수동 면역 

수동 면역은 바이러스 질환의 예방 및 치료에 효과적이며 안정한 전략임이 입증되었다. (각각이 본원에 참조로 

포함된 문헌 [Keller et al., Clin. Microbiol. Rev. 13:602-14 (2000)]; [Casadevall, Nat. Biotechnol. 

20:114 (2002)]; [Shibata et al., Nat. Med. 5:204-10 (1999)]; 및 [Igarashi et al., Nat. Med. 5:211-16 

(1999)] 참조). 중화 인간 모노클로날 항체를 사용하는 수동 면역은 조류 독감과 같은 인플루엔자의 긴급 예방 

및 치료를 위한 즉각적인 치료 전략을 제공할 수 있지만, 백신 및 신규 약물의 대안적이며 보다 시간-소모적인 

개발이 진행중이다. 

하위단위 백신은 잠재적으로 통상적인 면역원보다 유의한 이점을 제공한다. 이들은 통상적인 사멸 또는 약화된 

전체-병원균 백신의 생산, 분배 및 전달에 고유한 안전성 위험을 방지한다. 또한, 이들은 확인된 보호 에피토 

프만을 포함하도록 합리적으로 디자인됨으로써, 억제성 T 에피토프를 방지하거나 (문헌 [Steward et al., J. 

Virol. 69:7668 (1995)] 참조) 또는 무익한 비-보호 반응을 유도하여 면역 시스템을 파괴하는 면역우세 B 에피 

토프 (예를 들어 "미끼(decoy)" 에피토프)를 방지할 수 있다 (문헌 [Garrity et al., J. Immunol. 159:279 

(1997)] 참조). 

또한, 당업자는 다수의 상이한 바이러스, 접종 경로 및 동물 모델에 대한 시험관내 항체 중화 활성과 생체내 보 

호 사이에 양호한 상관관계가 존재함을 인식할 것이다. (문헌 [Burton, Natl. Rev. Immunol. 2:706-13 

(2002)]; [Parren et al., Adv. Immunol. 77:195-262 (2001)] 참조). 본원에 제공된 데이타는 D7, D8, F10, 

G17, H40, A66, D80, E88, E90 및 H98 인간 모노클로날 항체가 더 개발되고 생체내 동물 연구에서 시험되어 인 

플루엔자의 긴급 예방 및 치료를 위한 강력한 바이러스 진입 억제제로서 그의 임상 이용성을 결정할 수 있음을 

입증한다. 

백신접종에서의 항원-Ig 키메라 

공개특허 10-2010-0115346 

제1 항체가 면역 시스템에 대한 항원 결정부위의 효율적인 제시를 위한 스캐폴드(scaffold)로서 사용된지 10년 

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이 넘었다. (문헌 [Zanetti, Nature 355:476-77 (1992)]; [Zaghouani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 

92:631-35 (1995)] 참조). 펩티드가 IgG 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 11A 또는 256 IgG1 모노클로날 

항체)의 필수 부분으로서 포함되는 경우, 펩티드 에피토프의 항원성 및 면역원성은 유리 펩티드에 비해 대단히 

향상된다. 이러한 향상은 아마도 항원-IgG 키메라의 보다 긴 반감기, 보다 우수한 제시 및 본래 구조를 모방하 

는 제한된 배열에 기인한다. 

또한, 항원-Ig 키메라를 사용하는 추가 이점은 항원-Ig 키메라의 가변 또는 Fc 영역이 전문적인 항원-제시 세포 

(APC)를 표적화하는데 사용될 수 있다는 것이다. 지금까지, 중쇄 가변 유전자 (VH)의 상보성 결정 영역 (CDR) 

을 B 또는 T 세포에 의해 인식된 다양한 항원 펩티드로 대체하는 재조합 Ig가 생성되었다. 이러한 항원-Ig 키 

메라는 체액성 및 세포성 면역 반응 모두를 유도하는데 사용되었다. (문헌 [Bona et al., Immunol. Today 

19:126-33 (1998)] 참조). 

CDR3 루프에 혼입된 특이적 에피토프를 갖는 키메라는 HIV-1 gp120 V3-루프 또는 인간 CD4 수용체의 제1 세포외 

도메인 (D1)에 대한 체액성 반응을 유도하는데 사용되었다. (문헌 [Lanza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 

USA 90:11683-87 (1993)]; [Zaghouani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:631-35 (1995)] 참조). 면역 

혈청은 HIV-1MN (항-gp120 V3C)에 의한 CD4 SupT1 세포의 감염을 방지하거나 합포체 형성 (항-CD4-D1)을 억제 

할 수 있었다. CDR2 및 CDR3은 펩티드 에피토프로 동시에 대체될 수 있고, 삽입된 펩티드의 길이는 19개 이하 

의 아미노산 길이일 수 있다. 

별법으로, 한 그룹은 펩티드 항원이 Ig 불변 (C) 영역의 루프에 제시되고 키메라의 가변 영역은 B-세포의 표면 

상의 IgD를 표적화하거나 B-세포, 수지상 세포 (DC) 및 마크로파지를 비롯한 전문적인 APC 상의 MHC 유형 II 분 

자를 표적화하는데 사용될 수 있는 "트로이바디(troybody)" 전략을 개발하였다. (문헌 [Lunde et al., 

Biochem. Soc. Trans. 30:500-6 (2002)] 참조). 

또한, 항원-Ig 키메라는 항원을 IgG 분자의 Fc 부분에 직접 융합시켜 제조될 수 있다. 문헌 [You et al., 

Cancer Res. 61:3704-11 (2001)]에서는 이러한 방법을 사용하여 B형 간염 바이러스 코어 항원에 대한 매우 높은 

수준의 항체를 비롯한, 특이적 면역 반응의 모든 부분을 수득할 수 있었다. 

DNA 백신접종 

DNA 백신은 안정하고, 항원에 천연적으로 가공될 기회를 제공할 수 있으며, 보다-지속적인 반응을 유도할 수 있 

다. DNA 백신은 매우 매력적인 면역화 전략이지만, 종종 면역 반응을 유도하는데 매우 제한된 효능을 갖는다. 

전문적인 APC, 예컨대 수시상 세포 (DC)에 의한 주입 DNA의 불량한 흡수가 이러한 제한의 주 원인일 수 있다. 

항원-Ig 키메라 백신과 조합된, APC 항원 제시의 향상을 기준으로 한 유망한 신규 DNA 백신 전략이 보고되었으 

며 (문헌 [Casares, et al., Viral, Immunol. 10:129-36 (1997)]; [Gerloni et al., Nat. Biotech. 15:876-81 

(1997)]; [Gerloni et al., DNA Cell Biol. 16:611-25 (1997)]; [You et al., Cancer Res. 61:3704-11 

(2001)] 참조), 이는 DC의 표면 상의 Fc 수용체 (FcγR)의 존재를 이용한다. 

항원 (Ag)-Ig 키메라를 코딩하는 DNA 백신을 생성하는 것이 가능하다. 면역화시, Ag-Ig 융합 단백질은 DNA 분 

자를 흡수하는 세포에 의해 발현 및 분비될 것이다. 분비된 Ag-Ig 융합 단백질은 B-세포 반응을 유도하는 동안 

포획되고, DC 표면 상의 FcγR에 의한 Fc 단편의 상호작용에 의해 내재화될 수 있으며, 효율적인 항원 제시를 

촉진하고 항원-특이적인 면역 반응을 대단히 향상시킬 것이다. 동일한 원리를 적용하여, 기능성 항-MHC II 특 

이적 scFv 영역 유전자를 보유하는 항원-Ig 키메라를 코딩하는 DNA는 또한 APC의 모든 세가지 유형에 대한 면역 

원을 표적화할 수 있다. 면역 반응은 필요하다면 시험관내에서 생성된 동일한 단백질 항원을 사용하여 더 증대 

될 수 있다 (즉, "최초(prime) 및 증대(boost)"). 이러한 전략을 사용하여, 인플루엔자 바이러스의 감염에 대 

한 특이적 세포성 및 체액성 면역 반응이 DNA 백신의 근육내 (i.m.) 주사를 통해 달성되었다. (문헌 [Casares 

et al., Viral. Immunol. 10:129-36 (1997)] 참조). 

백신 조성물 

일반적으로 1종 이상의 모노클로날 항체 또는 ScFv와 이들의 조합물의 혼합물을 포함하는 치료 또는 예방 조성 

물이 본원에 제공된다. 예방 백신은 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는데 사용될 수 있고, 치료 백신은 인 

플루엔자 바이러스 감염 후의 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 예방 용도는 백신접종 대상체에서 인플루엔 

자 바이러스에 대한 증가된 항체 역가(titer)의 공급을 포함한다. 이러한 방식으로, 인플루엔자에 걸릴 높은 

위험에 있는 대상체에게 인플루엔자 바이러스에 대한 수동 면역이 제공될 수 있다. 

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이들 백신 조성물은 보조의 면역조절제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, IL-2, 변형된 IL-2 (Cys125 → 

Ser125), GM-CSF, IL-12, γ-인터페론, IP-10, MIP1β 및 RANTES를 포함하지만 이에 제한되지 않는 시토카인, 

림포카인 및 케모카인. 

면역화 방법 

본 발명의 백신은 다른 항-바이러스 백신보다 우수한 면역보호 및 면역치료 성질을 갖는다. 본 발명은 대상체 

의 면역화 방법, 예를 들어 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 대상체는 병원성 외피 바이러스의 막 융합 

단백질을 함유하는 조성물을 대상체에게 투여하여 면역된다. 융합 단백질은 생물학적으로 상용성인 매트릭스로 

코팅되거나 그에 삽입된다. 융합 단백질은 글리코실화되며, 예를 들어 탄수화물 잔기를 함유한다. 탄수화물 

잔기는 단당류, 이당류(들), 올리고당류(들), 다당류(들) 또는 이들의 유도체 (예를 들어 술포- 또는 포스포-치 

환됨)의 형태일 수 있다. 탄수화물은 선형 또는 분지형이다. 탄수화물 잔기는 폴리펩티드에 N-연결 또는 O-연 

결된다. N-연결된 글리코실화는 아스파라긴 측쇄의 아미드 질소에 대해 이루어지며, O-연결된 글리코실화는 세 

린 및 쓰레오닌 측쇄의 히드록시 산소에 대해 이루어진다. 

탄수화물 잔기는 백신접종될 대상체에 대해 내인성이다. 다르게는, 탄수화물 잔기는 백신접종될 대상체에 대해 

외인성이다. 탄수화물 잔기는 백신접종될 대상체의 폴리펩티드 상에 전형적으로 발현되지 않는 탄수화물 잔기 

이다. 예를 들어, 탄수화물 잔기는 식물-특이적 탄수화물이다. 식물 특이적 탄수화물 잔기는 예를 들어 코어 

결합된 α1,3 푸코스 또는 코어 결합된 β1,2 크실로스를 갖는 N-연결된 글리칸을 포함한다. 다르게는, 탄수화 

물 잔기는 백신접종될 대상체의 폴리펩티드 또는 지질 상에 발현되는 탄수화물 잔기이다. 예를 들어, 다수의 

숙주 세포가 유전자 조작되어 인간-유사 당 부착기를 갖는 인간 단백질이 생산되었다. 

예를 들어, 융합 단백질은 트리메릭 헤마글루티닌 단백질이다. 임의로, 헤마글루티닌 단백질은 비-포유동물 세 

포, 예컨대 식물 세포에서 생산된다. 대상체는 바이러스 감염이 발생하거나 바이러스 감염에 걸릴 위험에 

있다. 외피 바이러스는 예를 들어, 엡스타인-바르 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 유형 1 및 2, 인간 

시토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스, 유형 8, 바리셀라 조스터 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 

바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 파라인플루엔자 바 

이러스, 호흡기 합포 바이러스, 광견병 바이러스 및 풍진 바이러스를 포함한다. 본원에 기재된 방법은 바이러 

스 감염의 하나 이상의 증상의 중증도 감소 또는 완화를 유도한다. 감염은 전형적으로 표준 방법을 사용하여 

의사에 의해 진단되고/거나 모니터링된다. 면역화를 필요로 하는 대상체는 당업계에 공지된 방법에 의해 확인 

된다. 예를 들어, 대상체는 문헌 [CDC's General Recommendation on Immunization (51(RR02) pp1-36)]에 약술 

된 바와 같이 면역화된다. 암은 예를 들어 물리적 조사, 생검, 혈액 시험 또는 x-선에 의해 진단된다. 대상체 

는 예를 들어 임의의 포유동물, 예를 들어 인간, 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 어류 또는 

조류이다. 치료는 감염의 진단 전에 투여된다. 별법으로, 치료는 진단 후에 투여된다. 

치료의 효능은 특정 장애 또는 감염을 진단하거나 치료하기 위한 임의의 방법과 함께 결정된다. 장애의 하나 

이상의 증상의 완화는 화합물이 임상적 이익을 제공함을 나타낸다. 

백신 잠재력에 대한 항원 단백질 단편 (APF)의 평가 

체액성 면역을 표적화하는 백신 후보는 성공적이기 위해서 적어도 세가지 기준을 충족하여야 한다: 강력한 항체 

반응 ("면역원성")을 일으켜야 하고; 일으킨 항체의 유의한 분획이 병원체와 교차-반응 ("면역성 적합성 

(immunogenic fitness)")하여야 하며; 일으킨 항체가 보호되어야 한다. 면역원성은 종종 보조제 또는 담체를 

사용하여 향상될 수 있지만, 면역성 적합성 및 보호를 유도하는 능력 (중화에 의해 입증된 바와 같음)은 궁극적 

으로 백신 성분으로서 항원의 성공을 결정할 항원의 고유 성질이다. 

면역성 적합성의 평가 

"면역성 적합성"은 병원체와 교차-반응하는 항원에 의해 유도된 항체의 분획으로서 정의된다. (문헌 [Matthews 

et al., J. Immunol. 169:837 (2002)] 참조). 이는 면역원성과 상이하며, 병원체와 교차-반응하지 않는 항체 

를 비롯한, 항원에 의해 유도된 모든 항체의 역가에 의해 측정된다. 부적절한 면역성 적합성은 아마도 지금까 

지 펩티드 백신의 실망스런 행로 기록에 기여해왔다. 항체에 높은 친화성으로 결합하여 높은 항체 역가를 일으 

키는 펩티드는 종종 적절한 면역성 적합성이 부족하여 잠재적인 백신 성분으로서 실패한다. 따라서, 인플루엔 

자 백신 후보를 선택하기 위한 기준의 하나로서 면역성 적합성을 포함시키는 것이 중요하다. 

공개특허 10-2010-0115346 

불량한 면역성 적합성에 대한 통상적인 설명은 가장 짧은 펩티드의 구조적 유연성이다. 구체적으로, 유연한 펩 

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티드는 환자로부터의 항체에 잘 결합할 수 있으며, 네이브 대상체에서 실질적인 항체 역가를 이끌어낼 수 있다. 

그러나, 펩티드가 많은 레파토리의 구조를 갖는 경우, 네이브 대상체에서 유도된 항체의 우위는 무손상 병원체 

상에서 상응하는 본래 에피토프와 교차-반응하는데 실패할 수 있다. 

짧은 펩티드처럼, 일부 APF는 매우 유연할 수 있으며, 따라서 백신 성분으로서 실패할 수 있다. 가장 면역원적 

으로 적합한 APF는 본질적으로 전체 단백질의 환경 밖에 구속된 자가-폴딩 단백질 하위도메인으로 이루어진 것 

같다. 

면역성 적합성은 주로 APF 자체의 성질이며 반응 면역 시스템의 성질이 아니기 때문에, 궁극적으로 APF가 인간 

에서 수행되어야 하더라도 면역성 적합성은 동물 모델 (예를 들어 마우스)에서 평가될 수 있다. 

APF에 의해 수행된 면역성 적합성은 문헌 [Matthews et al., J. Immunol. 169:837 (2002)]에 기재된 절차와 유 

사한 절차로, 정제된 스파이크(spike) 또는 막 단백질을 이용한 항-APF 혈청의 면역흡수에 의해 평가된다. IgG 

는 면역화된 마우스에서 수집한 혈청으로부터 정제된다. 정제된 비오티닐화 단백질 (적절한 경우, 마우스를 면 

역화시킨 특정 APF에 좌우됨)은 마우스 IgG와 혼합되고 인큐베이션된다. 이어서, 스트렙타비딘-코팅된 세파로 

스 비드가 임의의 결합된 IgG와 함께 비오티닐화 단백질 모두를 포획하기에 충분한 양으로 첨가된다. 스트렙타 

비딘-코팅된 비드를 마이크로원심분리에서 13,000 rpm으로 원심분리하여 제거함으로써, 각각 단백질에 대해 지 

시된 항체가 고갈된 IgG를 남긴다. 모의 흡수제로서 인플루엔자 단백질 대신에 비오티닐화 BSA를 사용하는 것 

을 제외하고는, 모의 면역흡수를 동일한 방식으로 병렬로 수행한다. 

APF의 면역성 적합성을 측정하기 위해, 흡수된 항체 및 모의-흡수된 항체를 면역화 APF에 대해 ELISA에서 나란 

히 역가측정한다. 파지 디스플레이 NPL로부터 선택된 APF 친화성의 경우, 이들 ELISA에 대한 항원은 정제된 

APF-GST 융합 단백질일 것이다. 포유동물 세포 디스플레이 NPL로부터의 잠재적으로 글리코실화된 APF의 경우, 

이들 ELISA에 대한 항원은 포유동물 세포에 의해 분비되고 단백질 A에 의해 정제된 APF-Fc 융합 단백질일 것이 

다. 모의-흡수된 항체에 비해 흡수된 항체의 항-APF 역가의 감소율(%)은 APF의 면역성 적합성의 척도를 제공 

할 것이다. 

치료 방법 

본 발명은 인플루엔자 바이러스-관련 질환 또는 장애의 위험에 있는 (또는 걸리기 쉬운) 대상체를 치료하는 예 

방적 및 치료적 방법 모두를 제공한다. 이러한 질환 또는 장애는 예를 들어 조류 독감을 포함하지만, 이에 제 

한되지 않는다. 

예방적 방법 

한 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 모노클로날 항체 또는 scFv 항체 또는 본 발명의 방법에 따라 확 

인된 작용제를 투여함으로써 대상체에서 인플루엔자 바이러스-관련 질환 또는 장애를 예방하는 방법을 

제공한다. 예를 들어, scFv 및/또는 모노클로날 항체 D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90 및 H98은 

치료 유효량으로 투여될 수 있다. 임의로, 둘 이상의 항-인플루엔자 항체가 동시-투여된다. 

인플루엔자 바이러스-관련 질환 또는 장애의 위험에 있는 대상체는 감염된 사람과 접촉한 환자 또는 몇몇 다른 

방식으로 인플루엔자 바이러스에 노출된 환자를 포함한다. 예방제의 투여는 인플루엔자 바이러스-관련 질환 또 

는 장애의 특징적인 증상이 표출되기 전에 수행되어, 질환 또는 장애가 예방되거나 또는 다르게는 그의 진행이 

지연될 수 있다. 

적절한 작용제가 본원에 기재된 스크리닝 검정을 기준으로 결정될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 투여될 작 

용제는 본 발명의 방법에 따라 확인된 인플루엔자 바이러스를 중화시키는 scFv 또는 모노클로날 항체이다. 

치료적 방법 

본 발명의 또다른 측면은 환자에서 인플루엔자 바이러스-관련 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 

한 실시양태에서, 상기 방법은 질환 또는 장애에 걸린 환자에게 인플루엔자를 중화시키는 작용제 (예를 들어, 

본원에 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 작용제 및/또는 본 발명의 방법에 따라 확인된 scFv 항체 또는 모 

노클로날 항체) 또는 작용제의 조합물을 투여하는 것을 포함한다. 

조합 방법 

공개특허 10-2010-0115346 

본 발명은 둘 이상의 항체, 예컨대 HA 단백질의 동일한 에피토프에 결합하는 D7, D8, F10, G17, H40, A66, 

D80, E88, E90 및 H98을 투여함으로써 환자에서 조류 독감과 같은 인플루엔자-관련 질환 또는 장애를 치료하는 

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것을 제공한다. 

본 발명은 하기 실시예에서 더 기재될 것이며, 이는 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 

실시예 

실시예 1: 일반 방법 

파지 디스플레이 항체 라이브러리의 선별을 위한 다양한 패닝(panning) 항원의 발현 및 제조 

HA1. HA1은 (A/태국/2(SP-33)/2004(H5N1)의 N-말단 단편 (aa17-338)이다. 유전자를 코돈-최적화하고, C-말단 

9개 아미노산 태그 (C9-태그:GTETSQVAPA)를 갖는 융합 단백질로서 발현시켰다. 융합 단백질 HA1-C9를 293T 세 

포에서 일시적으로 발현시키고, 분비된 단백질을 친화성 크로마토그래피에 의해 상등액으로부터 정제하였다. 

항-C9 항체 1D4와 공유적으로 커플링된 단백질 A 세파로스 (내쇼날 셀 컬쳐 센터(National Cell Culture 

Center))를 HA1-C9의 정제에 사용하였다. 

트리메릭 HA0. A/베트남/1203/2004의 헤마글루티닌 (HA) 유전자의 엑토도메인 (HA0)을 상기 33 

기재된 프로토콜 

을 변형시켜 곤충 세포에서 융합 단백질로서 발현시켰다. 이러한 제작물은 트리메릭 구조를 안정화시키기 위한 

박테리오파지 T4 피브리틴으로부터의 C-말단 트라이머화 '폴돈' 서열, 이어서 트롬빈 부위 및 His6 태그를 함유 

한다. 융합 단백질의 cDNA를 바큘로바이러스 전달 벡터인 pAcGP67A (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 매 

사추세츠주 베드포드 소재) 내로 클로닝하여 재조합 단백질의 효율적인 선별을 가능케 하였다. 9x10 6 

세포를 바 

이러스 스탁으로 감염시켰다. 감염 3일 후에, 세포를 스핀 다운시키고, 상등액을 6 ml Ni-NTA 비드 (키아젠 인 

크.(Qiagen Inc.), 캘리포니아주 발렌시아 소재)와 함께 인큐베이션하였다. 비드를 10 mM 이미다졸 함유 TBS 

완충액 (10 mM 트리스.HCl/80 mM NaCl, pH 8.0)으로 세척하고, 250 mM 이미다졸 함유 TBS로 용출시켰다. 용출 

된 HA5 단백질을 TBS 완충액에 대해 투석하고, 모노(Mono) Q HR10/10 컬럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 뉴 

저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 이온-교환에 의해 추가로 정제하였다. 정제된 HA5를 밤새 트롬빈에 의 

해 소화시켰다. HA0 트라이머의 완전성 및 특성을 겔 여과 (슈퍼덱스(Superdex) 200 컬럼) 및 SDS-PAGE를 사용 

하여 조사하였다. 

파지 항체 라이브러리의 선별 및 H5에 대한 항체의 스크리닝 

57개의 비-면역된 공여자의 B-세포로 제작된 2개의 인간 비-면역 scFv 라이브러리 (총 2.7x10 10 

된 HA1 또는 트리메릭 HA0에 대한 scFv의 선별에 사용하였다. 각각의 라이브러리로부터 제조된 5x10 11 

구성원)를 정제 

pfu의 파 

지-scFv를 별도로 10 μg의 HA1 또는 HA0으로 코팅된 면역튜브 (눈크(Nunc), 일리노이주 나퍼빌 소재)와 함께 

인큐베이션하였다. 선별 절차는 상기 기재된 바와 동일하였다. 2회의 선별 후, 무작위로 뽑은 단일 파지-scFv 

클론을 상기 기재된 바와 같은 효소 기반 면역흡수 검정 (ELISA)에 의해 HA1 또는 HA0에의 특이적 결합에 대해 

스크리닝하였다. HA1 또는 HA0에 1.0 초과의 A450 값으로 결합된 클론을 양성으로 스코어링한 반면, 음성 클론 

은 0.1 미만의 값을 제공하였다. HA1 또는 HA0 특이적 결합 클론에 대해, 중쇄 가변 영역 유전자 (VH) 및 경쇄 

가변 영역 유전자 (VL)를 서열분석하고, 그의 상응하는 아미노산 서열을 정렬하여, 추가 특성화를 위해 상이한 

서열을 갖는 항체를 확인하였다. 

가용성 scFv-Fc 및 전장 인간 IgG1의 발현 및 정제 

개별 클론의 파지-scFv를 파지 라이브러리의 제조 방법과 동일한 방법을 사용하여 중화 검정을 위해 

생산하였다. 파지 입자를 PEG/NaCl 침전을 사용하여 25배 농축시켰다. scFv-Fc 및 전체 인간 IgG1을 상기 기 

재된 바와 같이 생산하였다. 요컨대, 선별된 scFv를 인간 IgG1의 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 함유하지만 CH1은 

결핍된 Fc 발현 벡터 pcDNA 3.1-힌지 내로 서브클로닝하여 scFv-Fc로 전환시켰다. 전체 인간 IgG1의 경우, scFv 

의 VH 및 VL 유전자 단편을 별도로 인간 IgG1 카파 경쇄 또는 람다 경쇄 발현 벡터 TCAE5 또는 TCAE6 내로 서브 

클로닝하였다. scFv-Fc 또는 IgG1을 일시적인 형질감염에 의해 293T 또는 293F 세포 (인비트로겐 

(Invitrogen))에서 발현시키고, 단백질 A 세파로스 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 

표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석 

공개특허 10-2010-0115346 

재조합 HA0 (베트남1203/04) 트라이머에 대한 H5 HA Mab 결합의 역학 분석을 25℃에서 비아코어(Biacore) T100 

(비아코어) 상에서 수행하였다. 항-인간 IgG Fc 항체 (비아코어)를 아민 커플링 키트 (비아코어)를 사용하여 

아민-커플링에 의해 CM4 센서 칩의 개별 유동 세포 표면에 공유적으로 코팅시켰다. HA MAb를 HBS 완충액 (비아 

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코어)에서 10 μl/분의 유속으로 항-인간 IgG Fc 표면 상에 포획하여, Mab-HA0 결합이 균질한 1:1 랭뮤어 상호 

작용으로서 일어났음을 확실히 하였다. HA0를 HBS 완충액에서 30 μl/분의 유속으로, 그리고 0.31 내지 20 nM 

범위의 농도로 각각의 유동 세포 상에 주사하였다. 완충액 주사는 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 모든 

실험은, 완충액 굴절률의 변화를 설명하며 HA0와 항-인간 IgG Fc 사이의 잠재적인 비특이적 상호작용을 시험하 

기 위해 사용된 추가의 항-인간 IgG Fc 항체 대조군 표면을 함유하였다. 각각의 결합 및 해리 사이클의 

완료시, 표면을 3 M MgCl2 용액으로 재생시켰다. 결합률 (ka), 해리 속도 상수 (kd) 및 친화성 상수 (KD)를 비 

아코어 T100 평가 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 각각의 적합도 성질은 실험 데이타와 계산된 적합도 사 

이의 일치를 기준으로 하였으며, 여기서 Chi 2 

값은 1.0 미만이었다. HA0에 대한 Mab의 표면 밀도를 최적화하여 

질량 전달을 최소화하고 결합력(avidity) 효과의 임의의 기여를 방지하였다. 본원에 보고된 모든 ka, kd, KD는 

3개 실험의 평균 및 표준오차를 나타낸다. 

바이러스 및 세포 

야생형 인플루엔자 A/베트남/1203/2004 (H5N1; H5-VN04), A/홍콩/483/1997 (H5N1; H5-HK97), A/네덜란드 

/219/2003 (H7N7; H7-NL03) 및 A/오하이오/4/1983 (H1N1; H1-OH83) 바이러스, 및 A/앤 아버/6/1960 (H2N2)의 

냉각-적응된 백신 균주를 WHO 글로벌 인플루엔자 서베일런스 네트워크(WHO Global Influenza Surveillance 

Network)로부터 입수하고, 알렉산더 클리모브(Alexander Klimov) (CDC, 미국 아틀란타 소재)에 의해 

제공받았다. H1-PR34 및 마딘-다르비(Madin-Darby) 개 신장 (MDCK) 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 

(American Type Culture Collection)으로부터 입수하고, 10% 소태아 혈청을 함유한 둘베코 개질 이글스 배지 

(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)에서 증식시켰다. 바이러스 감염성을 MDCK 세포 상에서 플라크 

검정에 의해 결정하였다. 살아있는 야생형 H5N1 바이러스를 미국 농림부(U.S. Department of Agriculture) 및 

작용제 선택 프로그램(Select Agents program) http://www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm에서 요 

구되는 증진을 비롯한 생체안정성 수준 3의 한계내에서 취급하였다. 

HA-슈도유형의 바이러스를 이용한 중화 검정 

플라스미드 및 제작물 

A/태국/2(SP-33)/2004(H5N1))의 전장 HA 유전자, H5-SP33 및 A/베트남 1203/2004의 뉴라미다제 유전자 N1을 코 

돈 최적화하고, pcDNA3.1 벡터 내로 클로닝하여, 별도로 pcDNA3.1-H5-SP33 및 pcDNA3.1-N1 발현 플라스미드를 

수득하였다. A/사우스 캐롤라이나/1/1918 (H1N1) 전장 HA 단백질을 코딩하는 pCAGGS-H1(SC) 플라스미드를 피. 

팔레스 박사(Dr. P. Palese) (마운트 시나이 스쿨 오브 메디신(Mount Sinai School of Medicine), 미국 소재) 

로부터 친절하게 제공받았다. A/푸에르토 리코/8/34 (H1N1) HA 단백질을 코딩하는 pCAGGS-H1(PR) 플라스미드는 

엠. 파르잔 박사(Dr. M. Farzan) (하바드 메디칼 스쿨(Harvard Medical School), 미국 소재)로부터 관대하게 

증정되었다. 

HA-슈도유형 바이러스의 제조. 

H5-SP33, H1-SC/1918 또는 H1-PR/34에 의한 슈도유형 H5N1 또는 H1N1의 단일회 HIV 루시퍼라제 리포터 바이러 

스를 pcDNA3.1-H5-SP33, HIV-1 Gag-Pol 57 

을 코딩하는 HIV 패키징 벡터 pCMVΔR 8.2, HIV-1 LTR의 제어 하에 개 

똥벌레 루시퍼라제 리포터 유전자를 코딩하는 전달 벡터 pHIV-Luc 및 발현 플라스미드 pcDNA3.1-N1인 4개의 플 

라스미드로 293T 세포를 동시-형질감염시켜 제조하였다. 형질감염 36시간 후, 바이러스 상등액을 수확하고, 4 

℃에서 저장하였다. 

중화 검정. 

세포를 형질도입하기 전에, H1-SC/1918 또는 H1-PR/34F 슈도유형 바이러스의 바이러스 상등액을 16 μg/mL 

TPCK-처리된 트립신과 함께 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 트립신 중화 용액 (TNS, 캄브렉스 

(Cambrex))을 이용하여 1:1 (V/V)의 비율로 중화시켰다. 시험 항체 또는 혈청을 적절한 양의 H5-SP33 슈도유형 

또는 트립신-처리된 H1 슈도유형 바이러스와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 96 

웰 플레이트 내 293T 세포에 첨가하고, 48시간 동안 계속 배양하였다. 바이러스 진입 수준을 마이크로플레이트 

발광측정계로 표적 세포에서의 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 평가하였다. 

항체 8, 10 및 66의 에피토프 맵핑(mapping) 

플라스미드 및 제작물. 

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pcDNA3.1-H5-SP33, pCAGGS-H1(SC) 및 pCAGGS-H1(PR)은 상기 기재된 바와 같다. A/FPV/로스탁/34 (H7N1)에 대 

한 HA 단백질을 코딩하는 pCAGGS-H7 (FPV)을 엑스. 양 박사(Dr. X. Yang) (베트 이스라엘 데아코니스 메디컬 센 

터(Beth Israel Deaconess Medical Center))에 의해 친절하게 제공받았다. pcDNA3.1-H5-SP33 또는 pCAGGS-H7 

(FPV)의 모든 돌연변이체를 퀵체인지(QuikChange) 방법 (스트라타젠(Stratagene))에 의해 제작하였다. HA 발현 

세포에 대한 항-H5 항체의 결합을 유세포 분석하였다. H1, H5 또는 H7에 대한 플라스미드를 발현하는 다양한 

전장 야생형 HA 및 HA 돌연변이체를 293T 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 항-H5 항체 

(10 μg/ml)를 형질감염된 293T 세포와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.5% BSA 

및 0.1% NaN3을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. HA 형질감염된 세포에 대한 항-H5 항체의 결합의 검출을 위 

해, FITC-표지된 염소 항-인간 IgG (피어스(Pierce))를 2차 항체로서 사용하고, 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 

인큐베이션하였다. 세포를 상기와 같이 다시 세척하고, 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어를 갖는 벡톤 딕킨슨 

FACS칼리버(Becton Dickinson FACScaliber)를 사용하여 분석하였다. 

마이크로중화 검정 

상기 48 

기재된 바와 같이 방법을 수행하였다. 요컨대, 100 TCID50 (중간값의 조직 배양 감염 투여량)의 바이러 

스를 96-웰 조직 배양 플레이트에서 항체 스탁 용액 (1 mg/ml)의 log2 희석액과 동일한 부피로 혼합하고, 37℃ 

에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 지시자 MDCK 세포 (1.5 x 10 4 

세포/웰)를 플레이트에 첨가한 후, 37℃에서 

20시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 종말점을 설정하기 위해, 세포 단일층을 PBS로 세척하고, 아세톤에 고 

정시키고, 바이러스 항원을 인플루엔자 A NP (A-3, 아큐레이트(Accurate))에 대한 mAb를 이용하여 간접적인 

ELISA에 의해 검출하였다. 

플라크 감소 검정 

A/베트남 1203/2004 (H5N1) 또는 A/네덜란드/219/03 (H7N7) 바이러스 (10,000 pfu)를 항-H5 scFv-Fc와 3개의 

상이한 농도 100 μg/ml, 10 μg/ml 및 1 μg/ml로 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 바이러스-항체 혼합 

물을 12-웰 플레이트에서 MDCK 세포 단일층 상에 전달하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 세포를 세 

척하고, 한천으로 덮었다. 인큐베이션 4일 후, 한천 덮개를 폐기하고, 플라크를 크리스탈 바이올렛 염색에 의 

해 가시화하였다. 

헤마글루티닌화 억제 (HI) 검정 

조류 인플루엔자 바이러스는 N-아세틸뉴라민산 α2,3-갈락토스 (α2,3Gal) 연결을 함유하는 시알산 수용체에 우 

선적으로 결합하는 반면, 인간 바이러스는 N-아세틸뉴라민산 α2,6-갈락토스 (α2,6Gal) 연결을 함유하는 시알 

산 수용체에 우선적으로 결합한다. 수용체 특이성에 대한 분자 기초는 바이러스 HA에서 잔기의 복합 세트에 의 

해 대부분 결정될 것이다. 헤마글루티닌화-억제 (HI) 시험은 인플루엔자 헤마글루티닌에 대한 항체 반응을 평 

가하기 위한 간단하며 폭넓게 사용되는 방법이다. 스테펜손 등(Stephenson et al.)은, 말 적혈구를 사용하여 

결합에 이용가능한 α2,3Gal 연결의 비율을 증가시킴으로써 헤마글루티닌화 검정의 민감도를 개선시켰음을 보고 

하였다. 또한, HI 검정의 역가는 마이크로중화 검정의 역가와 많은 상관관계가 있었다. 먼저, 슈도유형 바이 

러스를 기재된 바와 같은 말 적혈구의 헤마글루틴화를 이용하여 역가측정할 것이다. 말 적혈구 현탁액을 사용 

하고, 역가측정된 H5/N1 바이러스의 HI 종말점을 억제하는 파지 항체의 능력을 검정하여, 초기 고-처리량 스크 

린을 유사하게 수행할 것이다. 일시적으로 형질감염된 293T 세포에 의해 생산되며 단백질 A 비드에 의해 정제 

된 가용성 scFvFc 단백질을 이용한 투여 반응 연구를 사용하여 H5N1 리포터 바이러스 진입의 억제 및 HI에 대한 

보다 상세한 2차 스크린을 수행할 것이다. 

바이러스 결합 억제 검정 

0.5x10 6 

개 293T 세포를 4℃에서 0.5% BSA 및 0.02% NaN3을 함유하는 PBS 완충액 중 항-H5 mAb, 대조군 mAb의 

존재 하에 또는 항체의 부재 하에 H5-TH04-슈도유형 HIV 바이러스 (~ 500 ng의 p24)와 함께 인큐베이션하였다. 

인큐베이션 1시간 후, 세포를 스핀 다운시켰다. 상등액을 수집하고, HIV-1 p24 CA 

포획 ELISA 키트 (NCI, 프레 

더릭, NIH)를 사용하여 p24 수준에 대해 시험함으로써 비결합 바이러스를 정량화하였다. 이어서, 세포를 1회 

또는 2회 세척하고, 용해시켜, 동일한 방법을 사용하여 세포-결합 바이러스를 정량화하였다. 

세포 융합 억제 검정 

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6-웰 플레이트에서 ~90% 전면성장한 293T 세포를 리포펙타민 2000 (인비트로겐)을 사용하여 4:1 비율의 

pcDNA3.1-H5-TH04 플라스미드 및 pcDNA 3.1-N1 (웰 당 총 DNA 3 μg)로 형질감염시켰다. 형질감염 6시간 후 

배양 배지를 1 ml의 항-H5, 대조군 또는 모의 mAb로 보충하고, 세포를 36시간 동안 배양하였다. 세포를 위상차 

현미경을 이용하여 합포체 형성에 대해 관찰하였다. 현미경사진을 10배 배율로 찍었다. 

패닝을 위한 다양한 HA 단백질의 발현 및 제조 

HA1은 H5N1 A/태국/2(SP-33)/2004 (H5-TH04)의 HA의 N-말단 단편, 잔기 11 내지 325 (H3 넘버링)이다. 유전자 

를 코돈-최적화하고, C-말단 9개 아미노산 태그 (C9-태그:GTETSQVAPA)를 갖는 융합 단백질로서 발현시켰다. 융 

합 단백질 HA1-C9을 293T 세포에서 일시적으로 발현시키고, 상등액 중 분비된 단백질을 형질감염 48시간 후 수 

확하고, 항-C9 항체 1D4와 공유적으로 커플링된 단백질 A 세파로스 (내쇼날 셀 컬쳐 센터)를 사용하는 친화성 

크로마토그래피에 의해 상등액으로부터 정제하였다. H5-VN04의 HA0 단백질을 생산하는 방법은 H5-F10 복합체의 

결정화에 대해 하기 기재한 바와 동일하지만, 단 푸린-절단을 위해 바큘로바이러스 동시감염을 이용한다. 

ELISA 

순수 H5 HA 단백질 0.2 μg을 밤새 4℃에서 PBS 중 2 μg/mL로 96-웰 맥시소르브(Maxisorb) ELISA 플 

레이트 (눈크, 뉴욕 소재) 상에 코팅하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척하여 코팅되지 않은 단백질을 제거하였 

다. 통상의 ELISA의 경우, 1 μg/mL의 항-H5 scFv-Fc, 이어서 HRP-항-인간 IgG1을 사용하여 H5 HA 단백질에 

대한 항-H5 scFv-Fc의 결합을 검출하였다. 경쟁 ELISA의 경우, 50 μL (10 12 

pfu)의 항-H5 파지-scFv를 5 μ 

g/mL의 항-H5 scFv-Fc와 혼합하고, H5-VN04 HA 코팅된 ELISA 플레이트에 도포하였다. HA0에의 파지-scFv의 결 

합에 대한 scFv-Fc의 경쟁은 HRP-항-M13을 사용하여 남아있는 파지-scFv의 결합을 측정함으로써 결정하였다. 

퍼옥시다제 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 시스템 (KPL, 메릴랜드주 가이터스부르그 소재)의 인큐베이션 후 450 

nm에서의 광학 밀도를 측정하였다. 

H5-F10 복합체의 발현, 정제 및 결정화 

단일 쇄 (VH-링커-VL) F10 (scFv)을 코딩하는 유전자를 N-말단 주변세포질 분비 신호 pelB 및 C-말단 6xHis 태 

그를 함유하는 pSynI 벡터 내로 클로닝하였다. F10 scFv를 25℃에서 15시간 동안 0.5 mM IPTG와 함께 0.1% 

글루코스 (w/v)를 함유하는 2YT 배지 중 XL10 세포에서 발현시켰다. 단백질을 먼저 히스바인드(Hisbind) Ni- 

NTA (노바겐(Novagen))에 의해 제조자 설명서에 따라 정제한 다음, 50 mM 트리스-HCl, 0.5 M NaCl (pH 8) 중 

슈퍼덱스 200 (아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))에 의해 정제하였다. 

H5-VN04 HA 유전자의 엑토도메인을 상기 6 

기재된 프로토콜을 변형시켜 곤충 세포에서 융합 단백질로서 발현시켰 

다. 이러한 제작물은 트리메릭 구조를 안정화시키기 위한 박테리오파지 T4 피브리틴으로부터의 C-말단 트라이 

머화 '폴돈' 서열, 이어서 트롬빈 부위 및 His6 태그를 함유한다. 융합 단백질의 cDNA를 바큘로바이러스 전달 

벡터인 pAcGP67A (BD 바이오사이언시즈, 매사추세츠주 베드포드 소재) 내로 클로닝하여 재조합 단백질의 효율적 

인 선별을 가능케 하였다. 완전히 절단된 HA를 (HA1-HA2 트라이머로서) 수득하기 위해, sf9 세포를 실험적으로 

유래된 비율의 HA0 및 푸린의 바큘로바이러스 스탁으로 동시 감염시켰다. 푸린 cDNA는 로버트 풀러 박사(Dr. 

Robert Fuller) (유니버시티 오브 미시간(University of Michigan))으로부터 증정되었다. 감염 3일 후, 세포 

를 스핀 다운시키고, 상등액을 Ni-NTA 비드 (키아젠 인크., 캘리포니아주 발렌시아 소재)와 함께 인큐베이션하 

였다. 비드를 10 mM 이미다졸 함유 TBS 완충액 (10 mM 트리스.HCl, 80 mM NaCl, pH 8.0)으로 세척하고, 250 

mM 이미다졸 함유 TBS로 용출시켰다. 용출된 H5 단백질을 TBS 완충액에 대해 투석하고, 모노 Q HR10/10 컬럼 

(지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 이온-교환에 의해 추가로 정제하였다. 정제된 H5를 

밤새 트롬빈에 의해 소화시키고, TBS 완충액에서 슈퍼덱스 200 컬럼에 의해 추가로 정제하였다. 

H5-F10 복합체를 2개의 정제된 성분을 혼합하여 형성하고, TBS 완충액에서 슈퍼덱스 200에 의해 단리하였다 (보 

충 도 1b). 피크 분획을 모으고, ~11 mg/ml로 농축시켰다. H5 트라이머의 완전성을 겔 여과 (슈퍼덱스 200 컬 

럼) 및 SDS-PAGE를 사용하여 조사하였다. 22℃에서 부유 방울 증기 확산 방법에 의해 결정을 성장시켰다. 2 

μL의 H5-F10을 동일한 부피의 12.5% PEG 1K, 25% 에틸렌 글리콜, 100 mM 트리스 (pH 8.5)와 혼합하였다. 

데이타 수집 전에 결정을 액체 질소에서 급속-냉동시켰다. 

H5-F10 복합체의 동시-결정화 

공개특허 10-2010-0115346 

H5-F10 복합체의 동시-결정화를 위해, F10을 이. 콜라이(E. coli)에서 발현시키고, Ni-NTA 및 겔 여과에 의해 

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정제하였다. H5를 sf9 세포에서 H5 및 푸린 바큘로바이러스 스탁의 동시-감염에 의해 발현시키고, Ni-NTA, 음 

이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제하였다. H5를 과량의 F10과 혼합하여 H5-F10 복합체를 수득 

하고, 이를 겔 여과에 의해 단리하였다. 22℃에서 부유 방울 증기 확산 방법을 사용하여 2 □L의 복합체 (~11 

mg/ml)를 동일한 부피의 12.5% PEG 1K, 25% 에틸렌 글리콜, 100 mM 트리스 (pH 8.5)와 혼합함으로써 결정을 

성장시켰다. 결정 구조를 몰레큘라 리플레이스먼트(Molecular Replacement)에 의해 3.2 Å 해상도로 측정하고, 

특별한 기하구조를 갖는 RFREE 0.29로 보정하였다. 

데이타 수집, 구조 결정 및 보정 

X-선 회절 데이타를 스탠포드 신크로트론 래디에이션 래보러토리(Synchrotron Radiation Laboratory (SSRL)) 

빔-라인 7.1 및 9.2에서 수집하였다. 데이타를 XDS 7 

및 HKL2000 패키지로 처리하였다. 

H5-F10 복합체의 구조를 조사 모델로서 H5의 구조 (A/베트남/1194/04; PDB 코드 2IBX) 및 SARS nAb 80R의 

scFv 구조 (PDB 코드 2GHW)를 사용하여 PHASER에 의한 분자 치환에 의해 결정하였다. scFv 구조 상동체 모델을 

WHATIF 9 

로 제작하였다. 비대칭 단위는 2개의 H5 트라이머 및 6개의 F10 분자를 함유한다. 

분자 치환으로부터의 용액을, CNS에서의 모의실험 어닐링과 쿠트(Coot) 및 엑스탤뷰(Xtalview)에 의한 수동 모 

델 재건을 갖는 프로그램 REFMAC5로 수회 보정하였다. 최종 모델은 각각 HA의 6개 독립적 카피에 대한 

506/503/503/496/495/496 잔기, 각각의 nAb10, 24 N-아세틸-d-글루코사민 및 6β-d-만노스에 대한 233 잔기, 0 

물 분자를 포함한다. 기하구조 파라미터를 PROCHECK 및 람파지(Rampage)에 의해 평가하였다. 

H5에 대한 hMab로의 마우스 보호 

모든 마우스 연구를 USDA 및 CDC 공인 생체안전성 수준 3 (BSL3) 동물 시설에서 CDC 동물실험윤리위원회(Animal 

Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. 암컷 8 내지 10주령 Balb/C 마우스 (군 

당 5마리)를 모든 실험에서 사용하였다. 모든 군에 대해, 마우스를 2주 동안 관찰하고, 칭량하고, 매일 사망에 

대해 관찰하였다. 

예방적 마우스 연구. 3개의 hMab (D8-IgG1, F10-IgG1 및 A66-IgG1) 또는 대조군 hMab 80R-IgG1를 10 mg/kg 및 

2.5 mg/kg 53 

의 2회 투여량으로 마우스에게 복강내 (i.p.) 투여하였다. hMab 투여 24시간 후, 모든 군의 마우 

스를 광 마취 하에 10 MLD50 (50% 마우스 치사량) 바이러스의 투여량으로 A/베트남/1203/04(H5N1) 또는 

A/HK/483/97 (H5N1)에 의해 비내 (i.n.) 접종하였다. 

치료적 마우스 연구. 마우스를 먼저 10 MLD50의 A/베트남/1203/04(H5N1) 또는 A/HK/483/97 (H5N1)로 비내 감염 

시켰다. 이어서, A/베트남/1203/04(H5N1) 감염 24시간, 48시간 및 72시간 후에, H5에 대한 3개의 hMab 또는 

대조군 hMab를 10 mg/kg으로 마우스에게 복강내 투여하였다. A/HK/483/97 (H5N1) 감염된 마우스의 경우, 바이 

러스 접종 24시간 후에 hMab만을 주사하였다. 

항-H5 파지 항체의 확인 

HA1에 대한 항체. 정제된 재조합 HA1을 사용하여 2개의 비-면역 인간 scFv 라이브러리로부터 별도로 항체를 선 

별하였다. HA1 상에서 2회의 선별 후, ELISA에 의해 스크리닝된 96개의 클론 중 58개는 HA1 특이적 양성 클론 

이었다. 58개의 HA1-양성 클론의 스크리닝 분석에 의해 3개의 고유한 항-HA1 scFv를 확인하였다 (38B 및 1C). 

유사한 선별 및 스크리닝 실험을 반복하였으며; 새로운 클론은 확인되지 않았지만 상기 기재된 바와 같은 동일 

한 3개의 scFv를 수득하였다. 2A의 아미노산 서열은 도 4에 도시되어 있다. 

H5의 엑토도메인 (HA0)에 대한 항체. 정제된 재조합 트리메릭 HA0을 사용하여 HA1에 대해 사용된 것과 동일한 

항체 라이브러리를 선별하였다. HA0 상에서 2회의 선별 후, 총 392개의 클론을 ELISA에 의한 HA0 특이적 결합 

에 대해 스크리닝하였다. 97개의 클론이 HA0 단백질을 특이적으로 인식하였다. 10개의 고유한 항-HA0 scFv 

(7, 8, 10, 17, 40, 66, 80, 88, 90 및 98)를 서열 분석에 의해 확인하였다. 6개의 상이한 VH 및 10개의 상이 

한 VL 유전자가 밝혀졌다 (일부 scFv는 동일한 VH 유전자를 공유하였다). 6개의 상이한 VH 중 5개는 한 유전자 

부류 IGHV1-69에 속한다. VL 유전자는 VH 유전자보다 훨씬 다양하였으며, 10개의 VL 중 3개는 카파 쇄이다 (도 

4). 

신뢰성 있는 단일회 리포터 바이러스 시스템의 확립 

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H5-SP33, H1-SC/1918 또는 H1-PR/34에 의한 슈도유형 H5N1 또는 H1N1의 단일회 HIV 루시퍼라제 리포터 바이러 

스를 pcDNA3.1-H5-SP33, HIV-1 Gag-Pol을 코딩하는 HIV 패키징 벡터 pCMVΔR 8.2, HIV-1 LTR의 제어 하에 개똥 

벌레 루시퍼라제 리포터 유전자를 코딩하는 전달 벡터 pHIV-Luc 및 발현 플라스미드 pcDNA3.1-N1인 4개의 플라 

스미드로 293T 세포를 동시-형질감염시켜 제조하였다. 형질감염 36시간 후, 바이러스 상등액을 수확하고, 4℃ 

에서 저장하였다. 293T 세포를 감염시켜 HA0-슈도유형 바이러스의 역가를 측정하였다. 슈도유형 바이러스를 

제조하는 형질감염에 N1 발현 플라스미드를 포함시키는 것은 H5-슈도유형 바이러스의 역가를 극적으로 증가시킬 

수 있다. H5-슈도유형 바이러스의 적절한 거동을 H5N1 (A/베트남/2004)에 대한 페럿 면역 혈청을 사용하여 조 

사하였다. 이들 바이러스는 예비-출혈 혈청에 의해서는 아니지만 항-혈청에 의해서는 강력하게 중화될 수 

있다. 따라서, 신뢰성 있는 단일회 고효율 리포터 바이러스 시스템을 항체 중화의 효율적인 스크리닝을 위해 

확립하였다. 

실시예 2: H5-SP33과의 슈도유형 바이러스 및 마이크로중화 검정을 사용하는 H5N1에 대한 중화 항체의 확인 

슈도유형 바이러스를 사용한 중화 검정의 결과 

항-H5 항체의 2가 scFvFc를 생산하고, HA0-슈도유형 바이러스에 대한 중화 활성에 대해 시험하였다. 본 발명자 

들은 2A가 적당한 중화 항체이고, 38B 및 1C는 비-중화 항체라는 것을 발견하였다 (데이타는 나타내지 않음). 

2A 항체는 하기에 기재된 다른 검정 (에피토프 맵핑)을 위한 유용한 항-HA 시약으로서 사용되어 왔다. 표적으 

로서 HA0 트라이머를 사용하여, 본 발명자들은 HA0에 대한 10개의 새로운 고유 항체를 확인하였다. 이들 Ab를, 

최근에 본 발명자들의 실험실에서 설정한 신규 고처리량 파지-scFv 스크리닝 방법을 사용하여 중화 활성에 대해 

스크리닝하였다. 요컨대, 개별 클론의 파지-scFv를 96-웰 플레이트에서 양성 클론에 대해 ELISA로 스크리닝한 

직후에 중화 검정에 직접 사용하였다. 이 개요에서, 중화 활성은 48시간 내에 알려질 것이다. 이를 수행함으 

로써, 본 발명자들은 시간-소모적인 가용성 Ab의 서브클로닝 및 발현 단계를 피하였다. 

도면에 도시된 바와 같이, 파지-scFv에 의해 나타난 중화 Ab (도 6 상부 왼쪽 패널)는 가용성 scFvFc Ab (도 6 

상부 중간 패널)에 의해 확인되었을 때 강력하게 중화되는 것으로 입증되었다. 파지-scFv에 의해 스크리닝된 

10개의 항체 모두는 강력한 중화 Ab이다. 본 발명자들은 또한 10개의 항체 중 3개 (D8, F10 및 A66)를 전장 인 

간 IgG1으로 전환시켰으며, H5-SP33 슈도유형 바이러스에 의해 강력한 중화 활성을 다시 관찰하였다 (도 6 하부 

왼쪽 패널). 또한, 3개의 항체는 H1N1을 교차-중화시켰다: 강력하게 중화된 H1-SC/1918 균주 (도 6 하부 왼쪽 

패널) 및 적당하게 중화된 H1-PR/34 균주 (도 6 하부 오른쪽 패널). 

마이크로중화 검정의 결과. 도 6 상부 오른쪽 패널에 도시된 바와 같이, 10개의 항-H5 항체는 상이한 수준의 

중화를 나타냈다. F10-Fc, A66-Fc, E88-Fc 및 E90-Fc는 10,000 pfu 바이러스 중 95% 초과의 바이러스를 10 

μg/ml로, 50% 초과의 바이러스를 1 μg/ml로 중화시키는 가장 강력한 억제제인 것처럼 보였다. 본 발명자들 

은 또한 이들 4개의 항체에 대해 100 pfu를 10 μg/ml 또는 1 μg/ml로 사용하였을 때 완전한 플라크 감소를 관 

찰하였다 (데이타는 나타내지 않음). 

10개의 항체 (scFv-Fc)는 이 경우 분기군 1 바이러스, A/태국/2-SP-33/2004 (H5N1) ("H5-TH04")로부터 H5 슈도 

유형-바이러스 (표면 상에 H5를 디스플레이하는 유일한 코어 HIV-1을 갖는 바이러스-유사 입자)를 중화시키는 

것으로 밝혀졌다. 또한, 10개의 항체 모두는 엄격한 플라크 감소 검정에서 H5-VN04 (분기군 1) 및 A/인도네시 

아/5/2005 ("H5-IN05", 분기군 2.1)에 대해 높지만 상이한 수준의 중화를 나타냈으며 (도 9), 이는 중화 에피토 

프(들)이 상이한 H5 분기군에 대해 보존됨을 제시한다. 그러나, Ab는 그룹 2 바이러스, HPAI H7N7 균주, A/네 

덜란드/219/03 (H7N7) (H7-NL03)을 중화시키지 않았다 (도 4). 

10개의 nAb는 모두 트리메릭 H5에 결합하고 서로에 대해 교차-경쟁하였으며 (도 16), 이는 그들이 중복되는 에 

피토프를 인식함을 나타낸다. 이러한 발견 및 VH 서열 다양성 및 중화 효능을 기준으로, 3개의 Ab (D8, F10 및 

A66)를 선별하고, 전장 인간 IgG1으로 전환시켰다. 3개의 nAb IgG1 모두는 시험관내에서 재조합 H5 (H5- 

VN04)에 고친화성 (Kd ~100-200 pM) 및 매우 낮은 해리 속도 (kd ~10 -4 

s -1 

)로 결합하였다 (도 17). 

실시예 3: 비아코어 T-100을 사용한 D8-IgG1, F10-IgG1 및 A66-IgG1에 대한 HA0 (A/베트남1203/04의 HA의 엑토 

도메인)의 결합의 역학 특성화 

공개특허 10-2010-0115346 

Mab를 항-인간 IgG1을 통해 CM4 칩 상에 포획하고, 트리메릭 HA0를 다양한 농도 (20, 10, 5, 2.5, 2.5, 1.25, 

0.625 nM)로 칩 표면 상에 주입하였다. 결합 역학을 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 평가하였다. 기록된 결 

합 곡선 (블랭크 참조는 차감됨)을 흑색으로 도시하고, 계산된 곡선을 적색으로 도시하였다. 모든 ka, kd, KD 

는 3개 실험의 평균 및 표준오차를 나타낸다. 비아코어 T100 및 비아코어 T100 평가 소프트웨어를 사용하여, 

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본 발명자들은 3개의 항-HA MAb에 대한 운동 속도 및 친화성 상수를 1:1 랭뮤어 모델에 적합시킴으로써 결정하 

였다. 하기 도면에 도시된 바와 같이, D8 및 F10의 유사한 ka, kd 및 KD를 관찰하였고, A66은 다른 두 항체보 

다 비교적 더 빠른 해리 속도로 인해 8 및 10보다 1.8배 더 낮은 KD를 가졌다. Mab와 HA0 사이의 복합체는 매 

우 느린 해리 속도 (8.8±1.1x10 -5 

s -1 

에 의해 예시된 바와 같이 안정하였다 (도 7). 

~ 1.8±0.3x10 -4 

실시예 4: 항-H5 항체의 예방적 및 치료적 효과 

s -1 

) 및 pM 수준에서 H5 트라이머와의 높은 친화성 결합 

H5N1 및 H1N1 바이러스 감염에 대한 인간 nAb의 보호 효능을 BALB/c 마우스 모델에서 평가하였다. 마우스를 치 

사 바이러스 접종 전 또는 후에 상이한 투여량의 nAb로 처리하였다. 

예방적 효능 (도 7 a, b, g 및 h). 마우스를 10개 중간 치사량 (MLD50)의 H5N1 또는 H1N1에 의해 비내 (i.n.) 

로 치사 접종하기 24시간 전에 항-H5 nAb 또는 대조군 mAb로 처리하였다. 3개의 nAb 중 임의의 nAb 10 mg/kg을 

복강내 (i.p.) 주사하여 H5-VN04 (A/베트남/1203/04 (H5N1), 분기군 1)로 접종된 마우스의 완전한 보호를 제공 

하였다. 보다 낮은 항체 투여량 (2.5 mg/kg)도 높은 보호를 제공하였다 (도 7a). H5-HK97 (A/홍콩/483/97 

(H5N1), 분기군 0) 바이러스에 대한 예방적 보호를 3개의 nAb 중 임의의 nAb 10 mg/kg으로 처리된 마우스의 80 

% 내지 100%에서 관찰하였다 (도 7b). 3개의 nAb 중 임의의 nAb (10 mg/kg의 단일 주사)는 H1-WSN33 

(A/WSN/1933(H1N1)) 바이러스로 접종된 마우스의 완전한 보호를 제공하였다 (도 7g). D8 및 F10은 10 mg/kg의 

단일 주사가 제공된 경우 H1-PR34 (A/푸에르토 리코/8/34 (H1N1))로 접종된 마우스를 완전히 보호하였다. A66 

은 25 mg/kg의 항체가 단일 주사로서 제공된 경우 마우스의 완전한 보호를 제공하였다 (도 7h). 

치료적 효능 (도 7c-f). 마우스를 H5-VN04로 접종하고, nAb를 24, 48, 72 hpi에 (도 7c, e 및 f) 또는 H5- 

HK97을 24 hpi에 (도 7d) 주사하였다. 접종후 24시간 (hpi)에 3개의 nAb 중 임의의 nAb 15 mg/kg (인간에서 

치료적으로 달성가능한 투여량)으로 복강내 처리하여 H5-VN04 또는 H5-HK97 바이러스의 MLD50의 10배로 접종된 

마우스의 80% 내지 100%를 보호하였다 (도 7c-d). H5-VN04로 접종되고 48 또는 72 hpi에 동일한 투여량의 

nAb로 처리된 마우스는 유사한 수준 또는 보다 높은 수준의 보호를 나타냈다 (도 7 2e-f). 모든 항-H5 nAb 처 

리군에서 생존한 마우스는 건강하게 남아있었고, 2주 관찰 기간에 걸쳐 최소의 체중 감소를 보였다 (데이타는 

나타내지 않음). 

실시예 5: 치료적 동물 연구에서 항-H5 항체에 의한 조직 중 바이러스 역가의 억제 

치료적으로 사용된 nAb의 항-바이러스 효과는 폐에서 국부 복제 억제의 지시자로서 또는 비장 및 뇌에서 H5N1 

감염을 특징으로 하는 전신 전파의 지시자로서 접종 4일 후에 바이러스 역가를 측정함으로써 추가로 

연구하였다. nAb는 접종 48시간 이내에 제공된 경우, 대조군에 비해 H5 nAb 처리된 마우스의 폐에서 바이러스 

복제의 유의한 억제를 매개하였다 (도 12). 현저하게, nAb 중 2개의 nAb, D8 및 F10은 또한 72 hpi에 제공된 

경우 항바이러스 효과를 보였다. 임의의 nAb 치료 효과를 방해하는 뇌로의 전신 바이러스 전파는 대조군 동물 

에서 낮았다. 그러나, 전신 전파에 대한 nAB 요법의 영향은, 심지어 3개의 nAb가 72 hpi 이내에 제공된 경우에 

도 비장으로의 바이러스 전파의 1000배 이상 억제에 의해 극적으로 입증되었다. 

실시예 6: 항체 D8, F10 및 A66의 초기 에피토프 맵핑 

H5-SP33에 대한 플라스미드를 발현하는 다양한 전장 야생형 HA 및 HA 돌연변이체를 293T 세포에 일시적으로 형 

질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 항-H5 항체 (10 μg/ml)를 형질감염된 293T 세포와 함께 4℃에서 1시간 동 

안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.5% BSA 및 0.1% NaN3을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. HA 형질감 

염된 세포에 대한 항-H5 항체의 결합의 검출을 위해, FITC-표지된 염소 항-인간 IgG (피어스)를 2차 항체로서 

사용하고, 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 항체 2A를 대조군 항체로서 사용하여 각각의 돌 

연변이체의 발현을 나타냈다. 하기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, Mab D8, 1F0 및 A66에 대한 에피토프는 유 

사하며, HA1의 위치 307 및 HA2의 위치 52, 59, 65, 93에 자리한다. 이들 아미노산의 위치를 H5 (A/베트남 

/1203/04(H5N1))의 결정 구조에 강조표시하였다. 

실시예 7: 클러스터 H1 바이러스의 결합 및 중화 

공개특허 10-2010-0115346 

H5N1 바이러스의 교차-분기군 중화는 (도 4) 그룹 1 H1 클러스터 내의 다른 HA 아형의 중화에 대한 시험을 촉발 

시켰다 (도 11). 3종의 모든 nAb가 전장 H1 ((A/사우스 캐롤라이나/1/1918 (H1N1) ("H1-SC1918") 및 A/푸에르 

토 리코/8/34 (H1N1) ("H1-PR34")), H2 (A/일본/305/57(H2N2)) ("H2-JP57"), H6 (A/닭/뉴욕/14677- 

- 42 -

[0299] 

[0300] 

[0301] 

[0302] 

[0303] 

[0304] 

[0305] 

[0306] 

13/1998(H6N2)) (H6-NY98), 그러나 그룹 2 아형인 H7 ((A/FPV/로스탁/34 (H7N1) ("H7-FP34")은 제외)을 발현하 

는 세포에 결합하였다 (도 4). 이들은 또한 H1-SC1918- 및 H1-PR34-슈도유형의 바이러스 감염을 중화시켰고 

(도 4); 이에 더하여 F10은 PR34 (H1N1), A/오하이오/83 (H1N1) ("H1-OH83") 및 A/앤 아버/6/60 (H2N2) 감염을 

중화시켰다 (도 4). 이러한 결과는 이들 nAb가 H5 분기군에 고도로 보존되어 있을 뿐만 아니라, H1, H2 및 H6 

아형에도 존재하고, 잠재적으로는 다른 클러스터 내의 아형에도 존재하는 HA 상의 에피토프를 인식한다는 것을 

제시한다. 이에 본 발명자들은 바이러스 중화 메커니즘을 보다 상세하게 조사하기로 결정했다. 

실시예 8: nAb는 세포 융합을 억제하지만, 바이러스 결합은 억제하지 않는다. 

항-HA Ab가 중화를 매개할 수 있는 두 가지 방법은, 세포 수용체에 대한 HA의 결합을 차단하는 것과, HA의 낮은 

pH에서 유도되는 형태적 변화를 방해하여 바이러스-숙주의 막 융합을 억제하는 것이다. 본 발명자들은 마우스 

항-H5 nAb, 17A2.1.2 및 페럿 항-H5N1 혈청 (이들은 둘 모두 적혈구 응집반응을 억제함)이 배경 수준에 결합하 

는 것을 감소시키는 반면에, 3종의 nAb는 세포에의 바이러스 결합에 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라, 적혈구 

응집반응 (적혈구에의 결합 및 교차 결합)을 억제하지 않는다는 것을 발견하였다, 

본 발명자들은 다음으로, H5-TH04로부터의 H5- 및 N1-발현 플라스미드로 동시-형질감염시킨 고밀도의 293T 세포 

의 모델 시스템을 이용하여, nAb가 숙주 세포막의 융합을 억제하는 능력을 시험하였다. 표면에서 발현된 바이 

러스 단백질은 세포가 융합되게 하고, 합포체를 형성하게 하는데, 이는 정상 배양 조건하에서 감염 후 36 내지 

48 시간 이내에 자연적으로 일어난다. nAb를 감염 6 시간 후에 첨가하고, 36 시간 후에 관찰했을때, 3 경우 모 

두에서 합포체 형성의 완전한 억제가 관찰되었다. nAb의 부재하에서, 감염 30 시간 후 산성 매질 (pH 5)에 일 

시적으로 (3 내지 4분) 노출시킨 세포는 대규모의 합포체를 형성하였다. 또한, nAb (5 ㎍/ml)는 이러한 조건하 

에서 합포체의 형성을 완벽하게 차단하였다 (데이타는 나타내지 않음). 이러한 결과들은 모든 3종의 nAb가 수 

용체 결합을 방해하지 않으면서 막 융합을 억제한다는 것을 나타낸다. 

실시예 9: nAb 에피토프의 구조적 특징 

다음으로, 본 발명자들은 3.2 Å의 해상도에서 HA (H5-VN04)와의 복합체내 scFv 단편의 결정 구조를 해독하고, 

돌연변이를 유발시켜, nAb 중 하나인 F10의 에피토프 및 결합 방식을 측정하였다 (도 6 및 표 4). 

복합체내에서, 각각의 H5 트라이머는 3개의 F10 분자와 대칭 관계인 부위에서 항체 당 단백질 표면에 약 1500 

Å 2 

묻혀 결합하였고, H5의 자체 구조는 F10 결합에 의해 현저하게 변경되지 않았다. HA는 단일 쇄인 HA0으로 

합성되고, 이는 단백질가수분해 절단에 의해 2개의 하위단위인 HA1 및 HA2로 활성화된다. 절단은 "융합 

펩티드" (HA2의 처음 약 21개의 잔기로 구성됨)가 막-근위의 줄기에 묻히게 한다. F10의 결합은 이 영역에서만 

독점적으로 일어나며 (도 6), 이로서 그 요소가 HA1 및 HA2인 (이들은 둘 모두 이 영역의 구조에 필수적이며, 

펩티드가 중성 pH 형태로 존재하도록 고정시킴) 융합 펩티드와 밀접하게 접촉하게 되고, 뿐만 아니라 융합 펩티 

드가 바이러스의 막-근위 포켓으로부터 엔도좀 막과 융합될 수 있는 바이러스의 원위 표면으로 표출되도록 산성 

pH에서 대규모의 형태적 변화를 겪는 대형의 헬릭스 HA2 헤어핀과도 밀접하게 접촉하게 된다. 

F10의 중쇄는 H5 결합에 있어서 중요한 역할을 하는데, 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)의 말단이 이용된다. 각 

각의 F10 분자는 HA 트라이머 중 단일의 모노머내에서 HA1 및 HA2 하위단위 둘 모두와 접촉하게 된다 (도 6). 

접촉 영역은, 한쪽 면은 HA1 요소이고 다른쪽 면은 HA2의 노출된 헬릭스 αA의 면인, HA2 융합 펩티드 부분으로 

형성된 포켓으로 이루어진다 (도 4 및 6). 3위일체의 항체 잔기 - CDR H2로부터의 F55 및 M54, 및 CDR H3으로 

부터의 Y102 - 는 주 접촉 지점을 형성한다. F55의 페닐 고리는 융합 펩티드 루프의 돌출된 루프 (HA2 잔기 

DGW 192-212 (H3 넘버링 체계; 밑첨자 1 및 2는 HA1 및 HA2 쇄를 의미한다)) 및 2개의 측면에 배치된 히스티딘 

(잔기 181 및 381) 및 트립토판, W212 (이는 포켓의 뒷면을 형성함)의 방향족 측쇄에 의해 형성된 편평한 표면을 

가로질러 놓인다. M54의 측쇄는 또한 방향족 고리인 W212 및 H381과, 헬릭스 αA 유래의 I452 측쇄와 접촉하며, 

이때 그의 주쇄 카르보닐 산소는 H381의 측쇄와 수소 결합한다. Y102는 그의 측쇄가 αA 헬릭스의 4개의 측쇄 

에 의해 형성된 소수성 틈에 삽입되고, 또한 융합 펩티드의 골격 카르보닐 (D192)과 수소 결합한다. CDR H1 루 

프는 헬릭스 αA의 C-말단 끝 및 헤드 영역 기저의 HA1 루프와 다중 접촉하게 된다 (도 12d, e). 

공개특허 10-2010-0115346 

이와 병행해서 헬릭스 αA에 대한 돌연변이 유발 실험을 행하여, 에피토프의 규정을 용이하게 하였다 (도 6). 

항체: V52A/E, N53A 및 I56A에 직접적으로 접촉하는 3개의 잔기에 대한 돌연변이 유발은 항체 결합을 유의하게 

감소시키거나 없앴고, 반면 보존적 돌연변이 V52L은 어떤 영향도 미치지 않았다. 대조군으로서 헬릭스의 다른 

노출면 (항체와 접촉하지 않는 면)에 대한 돌연변이는 항체 결합에 어떤 영향도 미치지 않았다 (도 12b-c). 

- 43 -

[0307] 

[0308] 

[0309] 

[0310] 

[0311] 


[0313] 

즉, αA 헬릭스의 돌연변이 유발은 결정학상으로 규정된 F10에 대한 에피토프와 완전히 일치하였다. 또한, 구 

조 데이타가 존재하지 않는 다른 2종의 nAb도 거의 동일한 돌연변이체-nAb 결합 추이를 나타내었고, 이는 에피 

토프가 근접해서 겹치며 경쟁 결합과 일치함을 의미한다 (도 6, 도 9). 이를 취합하여, 본 발명자들은 모든 3 

종의 nAb가 융합 상태를 야기하는 형태적 변화에 대한 계기를 제공하는 (아마도 포켓으로부터 융합 펩티드를 방 

출시키는) 영역 내의 HA의 중성 pH 형태를 안정화시키는 것에 의해 바이러스를 중화시키는 것이라 결론지었다. 

실시예 10: 넓은 범위의 중화의 구조적 기반 

F10 에피토프에 의해 규정되는 HA의 영역은 16종의 HA 아형 사이에서 매우 보존적이다 (도 6 및 표 5). 융합 

펩티드는 중성 pH 형태에서, 그리고 막 융합 과정 동안 모두 잘 규정된 구조를 취해야 하고, 돌연변이 유발 연 

구는 서열 변화가 거의 용인되지 않음을 보여주었다. HA2 αA의 노출되는 헬릭스 면은 또한 두 그룹 사이에서 

거의 불변인데, 이는 아마도 이것이 재편성되어 융합 상태에서 긴 트리메릭 꼬인 코일 구조의 내부 표면을 형성 

해야 하기 때문일 것이다. 즉, 2가지의 구별되는 환경하에서 2가지의 매우 다른 구조를 취하기 위한 이들 절편 

의 필요는 아마도 서열에 대해 강한 진화적 제약을 부여하였을 것이고, 이는 16종의 HA 아형에 걸친 보존에 대 

한 명백한 근거가 된다. 

그룹 1의 아형 H1, H5, 및 H9, 및 그룹 2의 아형 H3 및 H7에 대한 결정 구조가 측정되었고, 그러한 구조는 2개 

의 별개 부류에 속하는데, 이는 계통발생학적 분석에 의해 규정된 2개의 군과 일치한다. 추가의 비교는 두 부 

류가 또한 상세화된 3-차원 수준에서 F10 에피토프에 의해 규정되는 영역 내에서 쉽게 구별가능함을 보여준다. 

각 부류에서 특징이 되는 코어에 묻혀있는 소수의 핵심 아미노산에 있어서 (예를 들어, 171 및 1112에서)의 서열 

차이는 에피토프내 몇몇 측쇄의 배향에 일관된 차이를 야기할 뿐 아니라, 헬릭스 αA에 대한 포켓의 배치에 있 

어서도 일관된 차이를 야기하였다. 

각 군/부류내 에피토프 영역은 주어진 클러스터 내에서 거의 차이가 없고, 소수의 변화만이 있을 뿐 매우 보존 

적이며, 일반적으로 클러스터 사이에서 보존적이다 (예를 들어, 위치 181 및 381, 도 6a). 3종의 nAb가 H1 클 

러스터의 모든 4가지 구성원을 인식할 수 있다는 본 발명자들의 발견은 에피토프의 주변부에서의 아미노산의 차 

이가 (예컨대 잔기 401에서, 이는 본 클러스터 내에서 K, Q 또는 V임) 결합에 있어서 중요하지 않을 수 있음을 

입증한다. 

본 발명자들이 선택한 10종의 항체는 5가지의 상이한 VH CDR1-3 세트를 가지며, 이는 서열 및 길이가 실질적으 

로 다양하다. 그럼에도 불구하고, 포켓에 삽입되는 CDR2 (M54, F55) 및 CDR3 (Y102)의 3개의 핵심 잔기는 보존 

된다. 다양화된 CDR 맥락내 핵심 잔기의 보존은 본원에서 시험한 것들 이외에, 이 nAb 군에 의해 인식되는 HA 

아형/클러스터의 범위를 확대시킬 수 있다. 그러나, 6종의 그룹 2 아형 중 4종은 F10 에피토프의 주변부에 위 

치하는 위치 381에서 글리코실화됨을 주목한다. 모델링 연구는 입체적 충돌을 예상케하는데 (CDR H1 루프에 대 

해서만), 이는 관찰되는 H7 바이러스의 결합/중화의 결핍에 기여할 수 있다. 

실시예 11: 항-H5 nAb는 광범위한 그룹 1 HA 아형에 결합한다. 

그룹 1 바이러스는 총 16종의 A형 인플루엔자 바이러스 아형 중 10종을 함유하고, 3종의 "클러스터", H1a, H1b, 

및 H9로 더욱 분류된다. 본 발명자들은 nAb가 새의 H5 뿐만 아니라 대부분의 통상적인 인간 인플루엔자 아형을 

포함하는 (그룹 2 아형, H3은 제외) 클러스터 H1a 및 H1b의 총 7종의 HA 아형에 결합하는지를 시험하였다. H5 

에 더하여, 본 발명자들은 모든 3종의 nAb IgG1이 1918 "스페인 독감"을 비롯한 2가지의 상이한 H1N1 균주 유래 

의 전장 H1; H2N2 유래의 H2; 및 H6N2 유래의 H6; 및 클러스터 1b 아형: H11N9 유래의 H11; H13N6 유래의 H13; 

및 H16N3 유래의 H16을 발현하는 세포에 결합한다는 것을 확인하였다. 그러나, 이들 중 어느 것도 그룹 2 

아형, H7N1 유래의 H7에는 결합하지 않았다 (도 13). 도 13에 대한 보다 상세한 설명은 다음과 같다. H1, H2, 

H5, H6 (클러스터 H1a) 및 H11, H13 및 H16 (클러스터 H1b)에 대한 항-H5 nAb 결합의 FACS 분석. 293T 세포를 

상이한 HA-발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포에 결합한 NAb를 FACS로 분석하였다. H5-특이 

적 항체 2A 및 80R은 음성 대조군이다. 그룹 2 HA, H7에 대한 결합의 결핍 역시 밝혀졌다. 바이러스 균주에 

대한 상세는 다음과 같다: H1-SC1918 ((A/사우스 캐롤라이나/1/1918 (H1N1)), H1-PR34 (A/푸에르토 리코/8/34 

(H1N1)), H2-JP57 (A/일본/305/57 (H2N2)), H5-TH04 (A/태국/2-SP-33/2004 (H5N1)), H6-NY98 (A/닭/뉴욕 

/14677-13/1998 (H6N2)), H7-FP34 (A/FPV/로스탁/34 (H7N1)), H11-MP74 (A/오리/멤피스/546/74 (H11N9)), 

H13-MD77 (A/갈매기/MD/704/77 (H13N6)) 및 H16-DE06 (A/도요새/DE/172/06 (H16N3)). 

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[0324] 

 

그 밖의 실시양태 

본원에서 특정 실시양태들을 상세하게 개시하였지만, 이는 단지 설명하기 위한 목적으로 예를 들어 개시한 것이 

고, 이하에 첨부하는 특허청구의 범위를 제한하고자 의도되는 것은 아니다. 특히, 본 발명자들은 특허청구범위 

에 의해 규정된 바와 같은 본 발명의 관념 및 범위를 벗어남이 없이, 본 발명에 다양한 치환, 변경 및 변형이 

행해질 수 있음을 고려한다. 그 밖의 측면, 이점 및 변형이 이하의 특허청구범위 내에서 고려된다. 제시하는 

특허청구범위는 본원에서 개시하는 본 발명을 대표한다. 그 밖에, 청구하지 않는 본 발명도 역시 고려된다. 

출원인은 이하의 특허청구범위의 그러한 발명을 추구할 권리를 갖는다. 

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도면 

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도면6c 

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도면7c 

도면7d 

도면7e 

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도면7f 

도면8a 

도면8b 

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도면9a 

도면9b 

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도면13 

서 열 목 록 

SEQUENCE LISTING 

Dana-Farber Cancer Institute, Inc. 

Burnham Institute for Medical Research 

Marasco, Wayne A. 

Sui, Jianhua 

Liddington, Robert C. 

Antibodies Against Influenza Virus and Methods of Use Thereof 

20363-049001WO 

- 64 - 

공개특허 10-2010-0115346

PCT/US 2008/085876 

2008-12-08 

61/005,725 

2007-12-06 

61/091,599 

2008-08-25 

102 

PatentIn version 3.5 

1 

369 

DNA 

Homo sapiens 

1 

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagt gacaatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 

ccaggacaag ggcttgagtg gatggggggc atcattccta tctttggaaa accaaactac 180 

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt actgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 

atggacctga ggagcctgag atctgaggac acggccgttt attactgtgc gagagattca 300 

gacgcgtatt actatggttc ggggggtatg gacgtctggg gccaaggcac cctggtcacc 360 

gtctcctca 369 

2 

123 

PRT 

Homo sapiens 

2 

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 

1 5 10 15 

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Asn 

20 25 30 

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 

35 40 45 

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Lys Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 

- 65 - 

공개특허 10-2010-0115346

50 55 60 

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 

65 70 75 80 

Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 

85 90 95 

Ala Arg Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Gly Met Asp Val 

100 105 110 

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 

3 

335 

DNA 

115 120 

Homo sapiens 

3 

ctgcctgtgc tgactcaatc atcctctgcc tctgcttccc tgggatcctc ggtcaagctc 60 

acctgcactc tgagcagtgg gcatagtaac tacatcatcg catggcatca acagcagcca 120 

gggaaggccc ctcggtactt gatgaaggtt aatagtgatg gcagccacac caagggggac 180 

gggatccctg atcgcttctc aggctccagc tctggggctg accgctacct caccatctcc 240 

aacctccagt ctgaggatga ggctagttat ttctgtgaga cctgggacac taagattcat 300 

gtcttcggaa ctgggaccaa ggtctccgtc ctcag 335 

4 

111 

PRT 

Homo sapiens 

4 

Leu Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ser 

1 5 10 15 

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Asn Tyr Ile 

20 25 30 

Ile Ala Trp His Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Arg Tyr Leu Met 

35 40 45 

Lys Val Asn Ser Asp Gly Ser His Thr Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp 

- 66 - 

공개특허 10-2010-0115346

50 55 60 

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Ile Ser 

65 70 75 80 

Asn Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Ser Tyr Phe Cys Glu Thr Trp Asp 

85 90 95 

Thr Lys Ile His Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Ser Val Leu 

5 

363 

DNA 

Homo sapiens 

5 

100 105 110 


tcctgcaagg ctcctggagg tatcttcaac accaatgctt tcagctgggt ccgacaggcc 120 

cctggacaag gtcttgagtg ggtgggaggg gtcatccctt tgtttcgaac agcaagctac 180 

gcacagaacg tccagggcag agtcaccatt accgcggacg aatccacgaa cacagcctac 240 

atggagctta ccagcctgag atctgcggac acggccgtgt attactgtgc gagaagtagt 300 

ggttaccatt ttaggagtca ctttgactcc tggggcctgg gaaccctggt caccgtctcc 360 

tca 363 

6 


PRT 

Homo sapiens 

6 


1 5 10 15 

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Pro Gly Gly Ile Phe Asn Thr Asn 

20 25 30 

Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 

35 40 45 

Gly Gly Val Ile Pro Leu Phe Arg Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Asn Val 

50 55 60 

- 67 - 

공개특허 10-2010-0115346

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 

65 70 75 80 

Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 

85 90 95 

Ala Arg Ser Ser Gly Tyr His Phe Arg Ser His Phe Asp Ser Trp Gly 

100 105 110 

Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 

7 

363 

DNA 


Homo sapiens 

7 

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 

tcctgcaagg ctcctggagg tatcttcaac accaatgctt tcagctgggt ccgacaggcc 120 

cctggacaag gtcttgagtg ggtgggaggg gtcatccctt tgtttcgaac agcaagctac 180 

gcacagaacg tccagggcag agtcaccatt accgcggacg aatccacgaa cacagcctac 240 

atggagctta ccagcctgag atctgcggac acggccgtgt attactgtgc gagaagtagt 300 

ggttaccatt ttaggagtca ctttgactcc tggggcctgg gaaccctggt caccgtctcc 360 

tca 363 

8 

111 

PRT 

Homo sapiens 

8 

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Lys 

1 5 10 15 

Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ala Asn 

20 25 30 

Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val 

35 40 45 

Ile Tyr Glu Asp Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 

- 68 - 

공개특허 10-2010-0115346

50 55 60 

Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 

65 70 75 80 

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Tyr Asp Thr 

85 90 95 

Asn Asn His Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 

9 

333 

DNA 

Homo sapiens 

9 

100 105 110 

aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggcgtctc cggggaagac ggtgaccatc 60 

tcctgcaccg gcagcagtgg caacattgcc gccaactatg tgcagtggta ccaacaacgt 120 

ccgggcagtg cccccactac tgtgatctat gaggatgacc gaagaccctc tggggtccct 180 

gatcggttct ctggctccat cgacaggtcc tccaactctg cctccctcac catctcagga 240 

ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagactt atgataccaa caatcatgct 300 

gtgttcggag gaggcaccca cctgaccgtc ctc 333 

10 

110 

PRT 

Homo sapiens 

10 

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Lys His Gly Gln 

1 5 10 15 

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Thr Ser Asn Ile Gly Arg Asn 

20 25 30 

His Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 

35 40 45 

Ile Tyr Ser Asn Glu Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 

50 55 60 

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Val Ser Gly Leu Gln 

- 69 - 

공개특허 10-2010-0115346

65 70 75 80 

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Asn Leu 

85 90 95 

Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 

11 

330 

DNA 

Homo sapiens 

11 

100 105 110 

tcctatgagc tgactcagcc accctcagcg tctgggaaac acgggcagag ggtcaccatc 60 

tcttgttctg gaggcacctc caacatcgga cgtaatcatg ttaactggta ccagcaactc 120 

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaatgaac agcggccctc aggggtccct 180 

gaccgattct ctggctccaa atctggcacc tccgcctccc tggccgtgag tgggctccag 240 

tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca tcatgggatg acaacttgag tggttgggtg 300 

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 

12 


PRT 

 

Homo sapiens 



1 5 10 15 

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ala Tyr 

20 25 30 

Ala Phe Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 

35 40 45 

Gly Gly Ile Thr Gly Met Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 

50 55 60 

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Leu Thr Ser Thr Ala Tyr 

65 70 75 80 

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 

- 70 - 

공개특허 10-2010-0115346

85 90 95 

Ala Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 

100 105 110 

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 

13 

361 

DNA 


Homo sapiens 

13 


tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc gcttatgctt tcacctgggt gcggcaggcc 120 

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggc atcaccggaa tgtttggcac agcaaactac 180 

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aactcacgag cacagcctac 240 

atggagttga gctccctgac atctgaagac acggcccttt attattgtgc gagaggattg 300 

tattactatg agagtagtct tgactattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 

g 361 

14 

110 

PRT 

Homo sapiens 

14 

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 

1 5 10 15 

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 

20 25 30 

Asn Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 

35 40 45 

Met Ile Tyr Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 

50 55 60 

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 

65 70 75 80 

- 71 - 

공개특허 10-2010-0115346

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Cys Ser Tyr Ala Gly His 

85 90 95 

Ser Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 

15 

361 

DNA 

Homo sapiens 

15 

100 105 110 


tcctgcaggg cttctggagg caccttcagc gcttatgctt tcacctgggt gcggcaggcc 120 

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggc atcaccggaa tgtttggcac agcaaactac 180 

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aactcacgag cacagcctac 240 

atggagttga gctccctgac atctgaagac acggcccttt attattgtgc gagaggattg 300 

tattactatg agagtagtct tgactattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 

g 361 

16 

108 

PRT 

Homo sapiens 

16 

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 

1 5 10 15 

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ser Ser Lys 

20 25 30 

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 

35 40 45 

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 

50 55 60 

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 

65 70 75 80 

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Ser Cys Gln Gln Tyr Asp Gly Val Pro 

- 72 - 

공개특허 10-2010-0115346

85 90 95 

Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Val Glu Ile Lys 

17 

330 

DNA 

Homo sapiens 

17 

100 105 

cagtctgtgc tgactcagcc accctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60 

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact ctgtctcctg gtaccaacag 120 

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca ctaagcggcc ctcaggggtc 180 

cctgatcgct tctctgcctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccgt ctctgggctc 240 

caggctgagg atgaggctga ttatttctgc tgctcatatg caggccacag tgcttatgtc 300 

ttcggaactg ggaccaaggt caccgtcctg 330 

18 


PRT 

Homo sapiens 

18 


1 5 10 15 

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ser Ser Glu Val Thr Phe Ser Ser Phe 

20 25 30 

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 

35 40 45 

Gly Gly Ile Ser Pro Met Phe Gly Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 

50 55 60 

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Gln Ser Thr Arg Thr Ala Tyr 

65 70 75 80 

Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 

85 90 95 

Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ile Cys Ser Gly Gly Thr Cys Val Phe Asp 

- 73 - 

공개특허 10-2010-0115346

100 105 110 

His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 


324 

DNA 


Homo sapiens 


gaaattgtgc tgactcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 

ctctcctgca gggccagtca gagtcttagc agcaagtact tagcctggta tcagcagaaa 120 

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcaccatcag tagactggag 240 

cctgaagatt ttgcagtgta ttcctgtcag cagtatgatg gcgtacctcg gacgttcggc 300 

caagggacca cggtggaaat caaa 324 

20 

110 

PRT 

Homo sapiens 

20 

Gln Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Lys Gly Leu Arg Gln 

1 5 10 15 

Thr Ala Thr Leu Thr Cys Thr Gly Asn Ser Asn Asn Val Gly Asn Gln 

20 25 30 

Gly Ala Ala Trp Leu Gln Gln His Gln Gly His Pro Pro Lys Leu Leu 

35 40 45 

Ser Tyr Arg Asn Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Ser Glu Arg Phe Ser 

50 55 60 

Ala Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln 

65 70 75 80 

Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Trp Asp Ser Ser Leu 

85 90 95 

Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 

- 74 - 

공개특허 10-2010-0115346

21 

372 

DNA 

Homo sapiens 

21 

100 105 110 

caggtgcagc tggtgcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 

tcctgcacgt cctctgaagt caccttcagt agttttgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 

cctggacaag ggcttgagtg gctgggaggg atcagcccta tgtttggaac acctaattac 180 

gcgcagaagt tccaaggcag agtcaccatt accgcggacc agtccacgag gacagcctac 240 

atggacctga ggagcctgag atctgaggac acggccgtgt attattgtgc gagatctcct 300 

tcttacattt gttctggtgg aacctgcgtc tttgaccatt ggggccaggg aaccctggtc 360 

accgtctcct ca 372 

22 

107 

PRT 

Homo sapiens 

22 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 

1 5 10 15 

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 

20 25 30 

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 

35 40 45 

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 

50 55 60 

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 

65 70 75 80 

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Pro Tyr 

85 90 95 

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 

100 105 

- 75 - 

공개특허 10-2010-0115346

23 

372 

DNA 

Homo sapiens 

23 

caggtacagc tgcagcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 

tcctgcacgt cctctgaagt caccttcagt agttttgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 

cctggacaag ggcttgagtg gctgggaggg atcagcccta tgtttggaac acctaattac 180 

gcgcagaagt tccaaggcag agtcaccatt accgcggacc agtccacgag gacagcctac 240 

atggacctga ggagcctgag atctgaggac acggccgtgt attattgtgc gagatctcct 300 

tcttacattt gttctggtgg aacctgcgtc tttgaccatt ggggccaggg aaccctggtc 360 

accgtctcct ca 372 

24 


PRT 

Homo sapiens 

24 

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 

1 5 10 15 

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Val Thr Phe Ser Ser Tyr 

20 25 30 

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 

35 40 45 

Gly Gly Ile Ile Gly Val Phe Gly Val Pro Lys Tyr Ala Gln Asn Phe 

50 55 60 

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Pro Thr Ser Thr Val Tyr 

65 70 75 80 

Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 

85 90 95 

Ala Arg Glu Pro Gly Tyr Tyr Val Gly Lys Asn Gly Phe Asp Val Trp 

100 105 110 

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 

- 76 - 

공개특허 10-2010-0115346

25 

330 

DNA 


Homo sapiens 

25 

cagcctgggc tgactcagcc accctcggtg tccaagggct tgagacagac cgccacactc 60 

acctgcactg ggaacagcaa caatgttggc aaccaaggag cagcttggct gcagcagcac 120 

cagggccacc ctcccaaact cctatcctac aggaataatg accggccctc agggatctca 180 

gagagattct ctgcatccag gtcaggaaac acagcctccc tgaccattac tggactccag 240 

cctgaggacg aggctgacta ttactgctca acatgggaca gcagcctcag tgctgtggta 300 


26 

110 

PRT 

Homo sapiens 

26 

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Lys Gly Leu Arg Gln 

1 5 10 15 

Thr Ala Ile Leu Thr Cys Thr Gly Asp Ser Asn Asn Val Gly His Gln 

20 25 30 

Gly Thr Ala Trp Leu Gln Gln His Gln Gly His Pro Pro Lys Leu Leu 

35 40 45 

Ser Tyr Arg Asn Gly Asn Arg Pro Ser Gly Ile Ser Glu Arg Phe Ser 

50 55 60 

Ala Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ile Gly Leu Gln 

65 70 75 80 

Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Val Trp Asp Ser Ser Leu 

85 90 95 

Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 

27 

100 105 110 

- 77 - 

공개특허 10-2010-0115346

321 

DNA 

Homo sapiens 

27 

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagagg ggtcccatca 180 

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccattagcag cctgcagcct 240 

gaagattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatgatagtt caccgtacac ttttggccag 300 

gggaccaagg tagagatcaa a 321 

28 


PRT 

Homo sapiens 

28 

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala 

1 5 10 15 

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 

20 25 30 

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 

35 40 45 

Gly Trp Ile Asn Pro Met Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 

50 55 60 

Gln Val Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 

65 70 75 80 

Met Glu Val Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 

85 90 95 

Ala Arg Gly Ala Ser Val Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Gln Pro Glu Ala 

100 105 110 

Leu Asp Ile Trp Gly Leu Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 

29 

115 120 125 

- 78 - 

공개특허 10-2010-0115346

366 

DNA 

Homo sapiens 

29 

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 

tcctgcaaga cttctggagt caccttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120 

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcggtg tctttggtgt accaaagtac 180 

gcgcagaact tccagggcag agtcacaatt accgcggaca aaccgacgag tacagtctac 240 

atggagctga acagcctgag agctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagagccc 300 

gggtactacg taggaaagaa tggttttgat gtctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 

tcttca 366 

30 

108 

PRT 

Homo sapiens 

30 

Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 

1 5 10 15 

Thr Ala Ser Ile Pro Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Gly Tyr Ser Val 

20 25 30 

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Leu Val Ile Tyr 

35 40 45 

Asp Asp Lys Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala 

50 55 60 

Asn Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 

65 70 75 80 

Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Asn Asp Arg 

85 90 95 

Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 

31 

330 

100 105 

- 79 - 

공개특허 10-2010-0115346

DNA 

Homo sapiens 

31 

tcctatgagc tgactcagcc accctcggtg tccaagggct tgagacagac cgccatactc 60 

acctgcactg gagacagcaa caatgttggc caccaaggta cagcttggct gcaacaacac 120 

cagggccacc ctcccaaact cctatcctac aggaatggca accggccctc agggatctca 180 

gagagattct ctgcatccag gtcaggaaat acagcctccc tgaccattat tggactccag 240 

cctgaggacg aggctgacta ctactgctca gtatgggaca gcagcctcag tgcctgggtg 300 


32 


PRT 

Homo sapiens 

32 


1 5 10 15 

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Pro Phe Ser Met Thr 

20 25 30 

Ala Phe Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 

35 40 45 

Gly Gly Ile Ser Pro Ile Phe Arg Thr Pro Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 

50 55 60 

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Asn 

65 70 75 80 

Met Glu Leu Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 

85 90 95 

Ala Arg Thr Leu Ser Ser Tyr Gln Pro Asn Asn Asp Ala Phe Ala Ile 

100 105 110 

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 

33 

378 


- 80 - 

공개특허 10-2010-0115346

DNA 

Homo sapiens 

33 

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaggaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 

tcatgtaagg cttctggata caccttcacc ggttattata ttcactgggt gcgacaggcc 120 

cctggacaag gacttgagtg gatgggttgg atcaacccta tgactggtgg cacaaactat 180 

gcacagaagt ttcaggtctg ggtcaccatg acccgggaca cgtccatcaa cacagcctac 240 

atggaggtga gcaggctgac atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gaggggggct 300 

tccgtattac gatattttga ctggcagccc gaggctcttg atatctgggg cctcgggacc 360 

acggtcaccg tctcctca 378 

34 

106 

PRT 

Homo sapiens 

34 

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 

1 5 10 15 

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 

20 25 30 

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 

35 40 45 

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 

50 55 60 

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 

65 70 75 80 

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln 

85 90 95 

Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 

35 

324 

DNA 

100 105 

- 81 - 

공개특허 10-2010-0115346

Homo sapiens 

35 

cagcctgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccagcatt 60 

ccctgtgggg ggaacaacat tggaggctac agtgtacact ggtaccaaca aaagccgggc 120 

caggcccccc tcttggtcat ttatgacgat aaagaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 

ttctctggcg ccaactctgg gagcacggcc accctgacaa tcagcagggt cgaagccggg 240 

gatgagggcg actactactg tcaggtgtgg gatagtggta atgatcgtcc gctgttcggc 300 

ggagggacca agctgaccgt ccta 324 

36 


PRT 

Homo sapiens 

36 


1 5 10 15 

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Pro Phe Ser Met Thr 

20 25 30 

Ala Phe Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 

35 40 45 

Gly Gly Ile Ser Pro Ile Phe Arg Thr Pro Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 

50 55 60 

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Asn 

65 70 75 80 

Met Glu Leu Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 

85 90 95 

Ala Arg Thr Leu Ser Ser Tyr Gln Pro Asn Asn Asp Ala Phe Ala Ile 

100 105 110 

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 

37 

369 

DNA 


- 82 - 

공개특허 10-2010-0115346

Homo sapiens 

37 

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggctcctc ggtgaaggtt 60 

tcctgcaagg cttctggagg ccccttcagc atgactgctt tcacctggct gcgacaggcc 120 

cctggacaag ggcttgagtg gatgggtggg atcagcccta tctttcgtac accgaagtac 180 

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgaa cacagccaac 240 

atggagctga ccagcctgaa atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaaccctt 300 

tcctcctacc aaccgaataa tgatgctttt gctatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 

gtctcttca 369 

38 

110 

PRT 

Homo sapiens 

38 

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 

1 5 10 15 

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 

20 25 30 

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 

35 40 45 

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 

50 55 60 

Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ile Gly Leu Arg 

65 70 75 80 

Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Arg Leu 

85 90 95 

Ser Ala Ser Leu Phe Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Leu 

39 

318 

DNA 

Homo sapiens 

100 105 110 

- 83 - 

공개특허 10-2010-0115346

39 

gaaattgtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240 

gaagattttg cagtctattt ctgtcagcag tatggtagct cacctcaatt cggccaaggg 300 

acacgactgg agattaaa 318 

40 

369 

DNA 

Homo sapiens 

40 

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggctcctc ggtgaaggtt 60 

tcctgcaagg cttctggagg ccccttcagc atgactgctt tcacctggct gcgacaggcc 120 

cctggacaag ggcttgagtg gatgggtggg atcagcccta tctttcgtac accgaagtac 180 

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgaa cacagccaac 240 

atggagctga ccagcctgaa atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaaccctt 300 

tcctcctacc aaccgaataa tgatgctttt gctatctggg gccaagggac aatggtcacc 360 

gtctcttca 369 

41 

41 

000 

42 

330 

DNA 

Homo sapiens 

42 

ctgcctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 

tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta ccagcagctc 120 

ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180 

gaccgattct ctggctccag gtcaggcacc tcagcctccc tggccatcat tggactccgg 240 

cctgaggatg aagctgatta ttactgtcag tcgtatgaca gcaggctcag tgcttctctc 300 

- 84 - 

공개특허 10-2010-0115346

ttcggaactg ggaccacggt caccgtcctc 330 

43 

5 

PRT 

Artificial Sequence 

Consensus Sequence 

43 

Ser Tyr Ala Phe Ser 

1 5 

44 

5 

PRT 

Homo sapiens 

44 

Thr Asn Ala Phe Ser 

1 5 

45 

5 

PRT 

Homo sapiens 

45 

Ala Tyr Ala Phe Thr 

1 5 

46 

5 

PRT 

Homo sapiens 

46 

Ser Phe Ala Ile Ser 

1 5 

47 

5 

PRT 

Homo sapiens 

- 85 - 

공개특허 10-2010-0115346

47 

Ser Tyr Ala Ile Ser 

1 5 

48 

5 

PRT 

Homo sapiens 

48 

Gly Tyr Tyr Ile His 

1 5 

49 

5 

PRT 

Homo sapiens 

49 

Met Thr Ala Phe Thr 

1 5 

50 

5 

PRT 

Homo sapiens 

50 

Asp Asn Ala Ile Ser 

1 5 

51 

17 

PRT 



51 

Gly Ile Ile Pro Met Phe Gly Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 

1 5 10 15 

Gly 

- 86 - 

공개특허 10-2010-0115346

52 

17 

PRT 

Homo sapiens 

52 

Gly Val Ile Pro Leu Phe Arg Thr Ala Ser Tyr Ala Gln Asn Val Gln 

1 5 10 15 

Gly 

53 

17 

PRT 

Homo sapiens 

53 

Gly Ile Ile Gly Met Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 

1 5 10 15 

Gly 

54 

17 

PRT 

Homo sapiens 

54 

Gly Ile Ser Pro Met Phe Gly Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 

1 5 10 15 

Gly 

55 

17 

PRT 

Homo sapiens 

55 

Gly Ile Ile Gly Val Phe Gly Val Pro Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 

- 87 - 

공개특허 10-2010-0115346

1 5 10 15 

Gly 

56 

17 

PRT 

Homo sapiens 

56 

Trp Ile Asn Pro Met Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 

1 5 10 15 

Val 

57 

17 

PRT 

Homo sapiens 

57 

Gly Ile Ser Pro Ile Phe Arg Thr Pro Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 

1 5 10 15 

Gly 

58 

17 

PRT 

Homo sapiens 

58 

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Lys Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 

1 5 10 15 

Gly 

59 


PRT 

- 88 - 

공개특허 10-2010-0115346



59 

Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Phe Asp Val 

1 5 10 

60 

13 

PRT 

Homo sapiens 

60 

Ser Ser Gly Tyr His Phe Gly Arg Ser His Phe Asp Ser 

1 5 10 

61 

11 

PRT 

Homo sapiens 

61 

Gly Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ser Ser Leu Asp Tyr 

1 5 10 

62 

15 

PRT 

Homo sapiens 

62 

Ser Pro Ser Tyr Ile Cys Ser Gly Gly Thr Cys Val Phe Asp His 

1 5 10 15 

63 

13 

PRT 

Homo sapiens 

63 

Glu Pro Gly Tyr Tyr Val Gly Lys Asn Gly Phe Asp Val 

1 5 10 

- 89 - 

공개특허 10-2010-0115346

64 

17 

PRT 

Homo sapiens 

64 

Gly Ala Ser Val Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Gln Pro Glu Ala Leu Asp 

1 5 10 15 

Ile 

65 

14 

PRT 

Homo sapiens 

65 

Thr Leu Ser Ser Tyr Gln Pro Asn Asn Asp Ala Phe Ala Ile 

1 5 10 

66 

14 

PRT 

Homo sapiens 

66 

Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Gly Met Asp Val 

1 5 10 

67 


PRT 

Homo sapiens 

67 

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Tyr Val Ala 

1 5 10 

68 

13 

PRT 

- 90 - 

공개특허 10-2010-0115346

Homo sapiens 

68 

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Ala Ala Asn Tyr Val Gln 

1 5 10 

69 

14 

PRT 



69 

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Ser Val Ser 

1 5 10 

70 

13 

PRT 

Homo sapiens 

70 

Thr Gly Asn Ser Asn Asn Val Gly Asn Gln Gly Ala Ala 

1 5 10 

71 

13 

PRT 

Homo sapiens 

71 

Thr Gly Asp Ser Asn Asn Val Gly His Gln Gly Thr Ala 

1 5 10 

72 

11 

PRT 

Homo sapiens 

72 

Gly Gly Asn Asn Ile Gly Gly Tyr Ser Val His 

1 5 10 

73 

- 91 - 

공개특허 10-2010-0115346

11 

PRT 

Homo sapiens 

73 

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 

1 5 10 

74 


PRT 

Homo sapiens 

74 

Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ser Ser Lys Tyr Leu Ala 

1 5 10 

75 


PRT 

Homo sapiens 

75 

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Tyr Val Ala 

1 5 10 

76 

13 

PRT 

Homo sapiens 

76 

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 

1 5 10 

77 

11 

PRT 

Homo sapiens 

77 

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 

- 92 - 

공개특허 10-2010-0115346

1 5 10 

78 


PRT 

Homo sapiens 

78 

Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Asn Tyr Ile Ile Ala 

1 5 10 

79 

7 

PRT 



79 

Ser Asn Ser Asp Arg Pro Ser 

1 5 

80 

7 

PRT 

Homo sapiens 

80 

Glu Asp Asp Arg Arg Pro Ser 

1 5 

81 

7 

PRT 

Homo sapiens 

81 

Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser 

1 5 

82 

7 

PRT 

Homo sapiens 

- 93 - 

공개특허 10-2010-0115346

82 

Arg Asn Asn Asp Arg Pro Ser 

1 5 

83 

7 

PRT 

Homo sapiens 

83 

Arg Asn Gly Asn Arg Pro Ser 

1 5 

84 

7 

PRT 

Homo sapiens 

84 

Asp Asp Lys Asp Arg Pro Ser 

1 5 

85 

7 

PRT 

Homo sapiens 

85 

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 

1 5 

86 

7 

PRT 

Homo sapiens 

86 

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 

1 5 

87 

7 

PRT 

- 94 - 

공개특허 10-2010-0115346

Homo sapiens 

87 

Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser 

1 5 

88 

7 

PRT 

Homo sapiens 

88 

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Arg 

1 5 

89 

7 

PRT 

Homo sapiens 

89 

Ser Asn Glu Gln Arg Pro Ser 

1 5 

90 

11 

PRT 

Homo sapiens 

90 

Val Asn Ser Asp Gly Ser His Thr Lys Gly Asp 

1 5 10 

91 

10 

PRT 



91 

Gln Ser Tyr Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val 

1 5 10 

- 95 - 

공개특허 10-2010-0115346

92 

10 

PRT 

Homo sapiens 

92 

Gln Ser Tyr Asp Thr Asn Asn His Ala Val 

1 5 10 

93 

10 

PRT 

Homo sapiens 

93 

Cys Ser Tyr Ala Gly His Ser Ala Tyr Val 

1 5 10 

94 

11 

PRT 

Homo sapiens 

94 

Ser Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Val Val 

1 5 10 

95 

11 

PRT 

Homo sapiens 

95 

Ser Val Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Val 

1 5 10 

96 

11 

PRT 

Homo sapiens 

96 

Gln Val Trp Asp Ser Gly Asn Asp Arg Pro Leu 

- 96 - 

공개특허 10-2010-0115346

1 5 10 

97 

9 

PRT 

Homo sapiens 

97 

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Val 

1 5 

98 

9 

PRT 

Homo sapiens 

98 

Gln Gln Tyr Asp Gly Val Pro Arg Thr 

1 5 

99 

11 

PRT 

Homo sapiens 

99 

Gln Ser Tyr Asp Ser Arg Leu Ser Ala Ser Leu 

1 5 10 

100 

9 

PRT 

Homo sapiens 

100 

Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Pro Tyr Thr 

1 5 

101 

< 

211> 11 

PRT 

Homo sapiens 

- 97 - 

공개특허 10-2010-0115346

101 

Ala Ser Trp Asp Asp Asn Leu Ser Gly Trp Val 

1 5 10 

102 

9 

PRT 

Homo sapiens 

102 

Glu Thr Trp Asp Thr Lys Ile His Val 

1 5 

- 98 - 

공개특허 10-2010-0115346

(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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