Certificate of - IRMM - Europa

Application Note4
使用标准物质进行食物和饲料中 GMO 的量
化
关于进行了特定转基因事件的转基因质量分数定值的 IRMM 标准物质的正
确使用,本应用说明提供指南。
以下详细信息主要是指 CRM ERM-BF410、ERM-BF411、ERM-BF412、
ERM-BF413、ERM-BF414、ERM-BF415、ERM-BF416、ERM-BF417、
ERM-BF418 和 ERM-BF423 的使用。
引言
假设转基因生物 (GMO) 已按照欧盟立法投入欧洲
市场,1830/2003 号法规 (EC) 要求对组成成分为
GMO 或包含 GMO 超过 0.9% 的食品和饲料产品
进行标记。因此,必须以一种可靠的方式,对这些
产品中的转基因进行定量。对于这个目的,合适的
标准物质 (CRM) 是不可缺少的质量保证工具。
GMO CRM 特征
上述 CRM 标准值的基础是在计量学重量制备中使
用的干燥基因修改籽粉和干燥非基因修改籽粉质量。
这些质量经过水分和纯度估计校正。转基因质量分
数的计算方式如下:
corrected
corrected mass GM powder
mass GM powder + corrected mass
non - GM
powder
每种 GMO CRM 都进行了特定基因修改事件(如
证书所示)的质量分数定值。因此,CRM 只能用
于量化证书所示事件,相应的空白样品只能用于证
明在低于证书所给阈值情况下,没有该事件。
1507 maize
ERM ® - BF41 8 c
DRIED MAIZE POWDER
Certified value 1)
[ g / kg]
Mass Fraction
图 1:GM CRM ERM-BF418c 证书局部。
9.9
2)
Uncertainty
[ g / kg]
- 0.6 ; +0.8
1) The certified value is based on the mass fraction of dried non - genetically modified powder and dried
genetically modified powder mixed and corrected for the water content. The certified value is
traceable to the SI.
2) The certified uncertainty is the expanded uncertainty estimated in accordance with the Guide to the
Expression of Uncertainty in Me asurement (GUM) with a coverage factor k = 2, corresponding to a
level of confidence of about 95 %.
最近发布的 IRMM GMO CRM 均已进行了不对称
不确定性范围定值。如果将这类 CRM 用于偏差控
制(请参阅 ERM 应用说明 1),则在平均测量结
果超过标准值的情况下,要使用“ 正不确定性” ,
而在平均测量结果低于标准值的情况下,应使用
“ 负不确定性” 。
使用实时 PCR
实时聚合酶链式反应 (rt-PCR) 广泛用于对食品和饲
料样品中的转基因分数进行定量。该基于 DNA 的
定量法测量转基因脱氧核糖核酸 (DNA)(即从基因
修改中获得)和生物物种特有的内生性 DNA 之间
的比率。
由于单子叶植物籽的不同部分(例如玉米胚乳、种
皮和胚芽)的基因组成不同,标准物质中的 DNA
率值可能与定值的粉物质分数的值不同。因此,即
使两种 DNA 种类具有可比的提取产量,可提取转
基因 DNA / 提取的内生性 DNA 之比不一定等于转
基因玉米质量/总玉米质量之比。
在 GMO CRM 制备过程中,必须特别小心,确保
转基因和非 GMO 粉的颗粒大小分布相似。这对于
两种粉末中可提取 DNA 的量尤其重要。转基因和
非转基因粉末的不同 DNA 提取效率会影响 rt-PCR
测量的转基因浓度值。因此,只能使用已经证明能
够满足该要求的提取方法。
在定值过程中,CRM 的转基因质量分数使用事件
专用的 rt-PCR 方法进行验证。但是,在用未知样
品的测量值得出定量结论时必须小心,因为基于
DNA 的转基因定量会随测试的特定品种而变。如
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following information.
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September 2006
Author: Stefanie Trapmann
European Commission- Joint Research Centre
Institute for Reference Materials and
Measurements (IRMM)
Retieseweg 111, 2440 Geel, Belgium
Email: stefanie.trapmann@ec.europa.eu
www.erm-crm.org

果无法从其它地方获得,建议在内部验证期间,对
不同品种对 rt-PCR 结果的影响进行调查[1]。
公众可以通过欧盟转基因食品与饲料参考实验室的
主页获取按照 1829/2003 号法规 (EC) 的规定提交
和验证的实时 PCR 检测方法:
(http://gmo-crl.jrc.it/detectionmethods.htm).
用相对 DNA 拷贝数表达结果
在欧洲,使用得最频繁的 GMO 定量方法是 rt-
PCR ,因此最近的一份欧盟推荐标准
(2004/787/EC) 提议用 DNA 拷贝数表达转基因样
品测量结果。如果使用进行了转基因质量分数定值
的 GMO CRM 进行测量校准,并以相对拷贝数表
达最终结果,则应当清楚,玉米 CRM 是使用转基
因杂合 GMO 玉米生产的。在对应的定值报告中,
示例
可以找到用于生产 CRM 的籽样品接合性信息。此
外,还应当考虑到玉米的相对转基因拷贝数还受到
生产 GMO 杂交品种的方式和籽核内复制状态的影
响,这会增加胚乳组织中基因组分布的影响。考虑
极端情况,假定核内复制很密集,对胚乳的影响接
近 100%,相对转基因拷贝数可以是 33%(源于用
于杂交杂合籽的父株的转基因事件)或 66%(源于
用于杂交杂合籽的母株的转基因事件)。根据与这
些效果相比,种皮的影响可以忽略的假设,所有其
它情况(核内复制的影响更小, 胚芽组织的影响更
大),将产生 33-66%的值。
下方给出了以 g/kg 为单位的所得测量结果及其不
确定性转换为相对拷贝数的例子。
通过将进行过转基因质量分数定值的 CRM 用于校正,发现玉米样品包含 65 ± 20 g/kg 玉米事件 1507。使用范围因子 2 和 15%的
定量方法测量不确定性(在内部验证过程中估计),计算出扩展测量不确定性为 20 g/kg。为了将所得的转基因质量分数的结果转
换为拷贝数比率,需要将以 g/kg 为单位的结果除以 10,转换为百分比。必须考虑到用于校准的玉米 GMO CRM 是使用杂合玉米籽
生产的,结果需要除以 2:
x 65
= = 3.
3 对于 x = 以 g/kg 为单位的发现的平均转基因含量
10×
2 20
注意,在观察到用于生产 CRM 的非 GMO 和 GMO 基础样品的不同 DNA 萃取率的情况下,需要应用校正因子。定值报告提供了
DNA 萃取率信息。使用 CTAB,发现 GMO 粉 DNA 萃取率除以非 GMO 粉的比率为 0.7 ± 0.3。因此,所调查的样品的真实转基因
含量的拷贝数被高估,需要校正:
3 . 3*
f = 3.
3*
0.
7 = 2.
3 对于 f = 与用作 CRM 的 GMO 和非 GMO 粉的不同 DNA 萃取率相关的校正因子
在测量结果的不确定性中,需要考虑核内复制和杂合玉米事件育种的效果。不确定性需要覆盖 33%的范围(66 %减 33%),测量
值可能与 16.5%不同。为了估计拷贝数比率,需要对从调查中的玉米样品提取的 DNA 进行量化,并对玉米基因组数进行估计。为
了进行这种估计,将 DNA 浓度除以玉米基因组大小。因此,在不确定性计算中,DNA 量化的不确定性和基因组大小的不确定性需
要加以考虑。据文献记录,已知玉米基因组大小可以在直到 36%的范围内变化 [2]。在内部验证过程中,量化方法的再现性建立为
22%。因此,以拷贝数比率 (Ucc) 表达的结果的扩展组合不确定性可以按以下方式计算:
U = k u + u + u + u
cc
U cc
2
m
2
gs
2
Dq
2
2 ⎛ 18 ⎞ 2 ⎛16.
5 ⎞
= 2 15 + ⎜ ⎟ + 22 + ⎜ ⎟ % =
⎝ 3 ⎠ ⎝ 3 ⎠
2
e
2
60%
对于 k = 范围因子
um = 拷贝数量化方法不确定性贡献
ugs = 基因组大小估计不确定性贡献
uDq = DNA 量化不确定性贡献
ue = 育种和核内复制不确定性贡献
以拷贝数表达,玉米样品包含每 100 内生序列 2.3 ± 1.4 事件 1507 转基因序列。与以 65 ± 20 g/kg 的 1507 质量分数表达的结果相比
较,相对扩展不确定性从 30%增加到 60%。
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[1] IUPAC Technical Report (2002): Harmonized Guidelines for Single-Laboratory Validation of Methods of Analysis
[2] Poggio et al., Annals of Botany 85 (1998),107-115.
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