hepcidin - UZ Leuven

Hepcidine 

Diagnostische waarde en 

(pre)analytische aspecten 

Apr. Edith Vermeulen 

21 april 2010

• Inleiding 

Inhoud 

– Rol hepcidine in het ijzermetabolisme 

– Nood aan een nieuwe ijzermarker? 

– Vraagstelling 

• Appraisal 

– (Pre)analytische aspecten 

– Evidentie voor diagnostische waarde hepcidine 

• Conclusies 

• To do 

• Referenties

1. Inleiding 

Rol van hepcidine in het 

ijzermetabolisme

Erytropoiese Hypoxie Inflammatie Ijzer 

Bergamashi et 

al. 2009 

Makrofaag/ Enterocyt

Pietrangelo 

et al. 2004

1. Inleiding 

Nood aan een nieuwe 

ijzermarker?

Castagna et al. 2009

Nood aan een nieuwe ijzermarker? 

1. Inflammatie 

Weiss et 

al. 2005


1. Inflammatie 

Nog plaats voor hepcidin? 

• CHr (reticulocyte hemoglobin content) 

• % HYPO (% hypochrome RBC) 

Reeds ijzerdeficiënte erytropoiese 

Hepcidin gevoeliger? 

• sTfR/ log ferritin

sTfR/log ferritin 

Ferritin 

sTfR 


Inflammatie 

Ferritin 

sTfR 


Thomas et 

al. 2002


2. Kinderen hepcidine screening (in urine) ? 

Brugnara 

et al. 1999


3. Chronic kidney disease 

EPO dosis snel verbruik ijzer 

transiënte functionele ijzerdeficiëntie 

= factor bij hyporesponsiviteit aan EPO 

Opsporen: ferritine %HYPO CHr 

Hepcidine Predictor van hyporesponsiviteit?


4. Hemochromatose 

– Ferritine ↑, TSAT ↑ 

– DD/ secundaire ijzerstapeling 

– Diagnose = genetica 

– Therapie target: ferritin < 50 µg/L 

= CONSENSUSWAARDE 

Fysiologische relevantie? 

Hepcidine waarde in therapie-monitoring?

1. Inleiding 

Vraagstelling

Vraagstelling 

• Welke (pre)analytische aspecten beïnvloeden 

hepcidine-bepaling? 

• Verbetert hepcidine de diagnose van 

ijzerdeficiëntie bij kinderen of volwassenen? 

• Heeft hepcidine een waarde bij hereditaire 

hemochromatose? 

LITERATUURSTUDIE

2. Appraisal (1/3) 

1. (Pre)analytische aspecten 

van hepcidine bepaling

(Pre)analytische aspecten van 

hepcidine bepaling 

• Prohepcidine versus hepcidine 

• Kwantitatieve bepalingsmethoden 

• Urine of serum 

• Pre-analytische aspecten

(Pre)analytische aspecten 

1. Prohepcidine versus hepcidine 

Hepcidine: 

- weinig antigene epitopen 

- sterke conservering tussen species 

Bepaling lang problematisch… 

Prohepcidine als surrogaat-marker 

CAVE oudere literatuur!



Prohepcidine bij gezonde personen 

Studie 

Tiker et al. 2006 (n=42) 

26 terme, 16 aterme neonaten 

Roe et al. 2007 (n=138) 

Balogh et al. 2007 (n=20) 

Terme neonaten 

Ulukol et al. 2007 (n=74) 

Gezonde kinderen 4-12 mo 

Correlatie 

met hepcidin 

Correlatie met ijzerstatus/ anemie 

Nee (ijzer/ transferrine/ ferritine) 

Nee (Hb/ ferritine/ TSAT/ sTfR/ serum ijzer) 

Nee (serum ijzer/ TIBC/ TSAT/ ferritine/ 

WBC/ RBC/ Hb/ Hct/ MCV/ MCH/ MCHC/ 

reticulocyten) 

Nee (ferritine) 

Uitgesproken fysiologische variatie 

Kemna et al. 2008 (n=20) Nee Nee (sTfR/ TSAT/ ijzer/ NTBI/ ferritine) 

Huang et al. 2008 (n=45) Nee Wel met sTfR, niet met ferritin



Prohepcidine bij stoornissen ijzer 

Studie 

Kulaksiz et al. 2004 (n=35 HH, n=59 

nierinsufficiëntie met hemodialyse) 

Roe et al. 2007 (91 WT, 47 

heterozygoot C282, 6 homozygoot) 

Orhon et al. 2007 (kinderen van 4-6 

mo: n=16 ferriprieve anemie 

n=54 gezond) 

Kemna et al. 2008 

(n=20 gezond, n=6 ferriprieve anemie, 

n=16 inflammatie, n=5 thalassemie) 

Correlatie met ijzerstatus/ anemie 

Significante verschillen tussen HH, gezonde 

controles, nierinsufficiëntie met/zonder 

renale anemie 

Geen associatie met ferritine of TSAT, geen 

verschillen tussen de genotypes 

Geen verschillen met/zonder anemie 

Wijde fysiologische variatie 

Geen verschillen tussen de groepen



Kemna et al. 

2008 

Kulaksiz et al. 

2003 

Definitie cut-off?



• Prohepcidine: geen correlatie met ijzerabsorptie 

Luukkonen et al. 2006, Hadley et al. 2006, Young et al. 2009, Roe et al. 2007 

• Geen correlatie met hepcidine in inflammatie 

Kemna et al. 2005, Kemna et al. 2008, Hoppe et al. 2009 

• Andere aandoeningen: Hepatitis, hemodialyse, 

familiale amyloidose,… 

Geen verband met hepcidine of ijzerstatus







2009 2008 2007 2005 2004 


2. Kwantitatieve bepalingsmethoden 

• Immunodot (Nemeth et al. 2004) 

• Kwantitatieve (pro!)hepcidin ELISA DRG commercieel 

beschikbaar (2004) 

• Semikwantitatieve SELDI-TOF methoden door gebrek 

interne standaard 

• Kwantitatieve SELDI-TOF, LC MS/MS, HPLC MS/MS 

• Kwantitatieve ELISA (Ganz et al. 2008), RIA methoden 

• Kwantitatieve ELISA DRG commercieel beschikbaar (2009) 

• “Round robin” van 8 analysemethoden (Kroot et al. 2009)



Detail resultaten Kroot et al. 

WIE IS WIE? 

Ganz et al. 

Ashby et al. 

Koliaraki et al.



- “Most methods are similar in both analytical 

variation and between-sample variation” 

- Analytische variabiliteit is klein i.v.m totale variatie 

MAAR 

Sterke verschillen in absolute waarden



Detail resultaten Kroot et al.



Detail resultaten Kroot et al.



Verklaring sterke verschillen? 

(i) 

Verschillende calibratoren 

(ii) Hepcidine aggregatie in staal of standaard? 

(iii) Meten van verschillende fracties? (vrij/ gebonden/ 

totaal) (90% is α2-macroglobuline gebonden) 

(iv) Interferentie van hepcidin-20 of hepcidin-22 

Welke fractie biologisch relevant?








3. Urine of serum? 

Urine: 

-Verschillen tussen klinische 

groepen significant 

-Bredere variatie 

Kemna et al. 2007



r =0.55 

Ganz et al. 2008 (n=24) 

(Idem bij Kemna et al.) 

Kroot et al. 2009 (n=24)



Confounding factors bij hepcidine-bepaling in urine en implicaties 

Discrepanties tussen studies i.v.m. 

de correlatie met serumwaarden 

Isovormen hepcidine-20 en 

hepcidine-22 

Correlatie met serumwaarden onduidelijk 

Dragen bij tot intermethode-verschillen 

Biologische relevantie twijfelachtig 

Gewijzigde eigenschappen van 

hepcidine in urine? 

Nierkinetiek nog niet opgehelderd 

Meer invloed vries/dooi cycli 

Verschillend diurnaal patroon 

Hogere between-sample CV bij urine 

dan serum, bij 6 verschillende 

methoden 

“Hepcidine-activiteit” (binding aan 

ferroportin) onmeetbaar in urine 

Interpretatie in nieraandoeningen 

onduidelijk 

Minder stabiel dan in serum 

Verschillend afnameprotocol nodig 

Interpretatie onduidelijk 

Discrepantie met andere studie








4. Pre-analytische aspecten 

• Diurnale variatie



• Trend naar hogere waarden bij ouderen? 

Ganz et al. 

2008 

Wordt niet bevestigd



Pre-analytische factoren bij (serum) hepcidine bepaling 

Diurnale variatie 

Interindividuele variatie 

Vries/dooi cycli, stabiliteit 

Hepcidin aggregatie 

Circadiaans ritme, correleert met serum ijzer 

Significante verschillen tussen waarden man/ vrouw 

Trend naar hogere waarden bij ouderen? 

Correlatie met lichaamsgewicht (obesitas) 

Invloed van inspanning 

Afname door vries/dooi cycli is verwaarloosbaar. 

Hepcidine blijft 8 maand stabiel op -80°C (niet -20°C) 

Geen invloed van toevoeging protease-inhibitor 

Beschreven bij hoge concentraties 

Adhesie aan plastic 

Beschreven bij hoge concentraties

2. Appraisal 

2. Evidentie voor de diagnostische 

waarde van hepcidine

Vraagstelling 






hemochromatose?

Diagnostische waarde van hepcidine 

bepaling 

• Opsporen van ijzerdeficiëntie 

– Anemie van chronische ziekte 

– Chronische nieraandoeningen 

– Kinderen 

IRON DEFICIENCY

Diagnostische waarde: Ijzerdeficiëntie 

1. Anemie van chronische ziekte 

Kemna et al. 

2005 

Hepcidine is een acute fase eiwit: meerwaarde?



• 3 studies in infectie/ inflammatie 

1) Cherian et al. 2008 

- 147 Afrikaanse vluchtelingen



2) Theurl et al. 2009 

IDA n=12 Hb ↓ Geen inflammatie Ferritine 100 ng/mL 

Ferritine 30-100 ng/mL sTfR/log ferritine < 1 

ACD + IDA 

n=14 

Hb ↓ 

Chronische 

inflammatie 

Ferritine 30-100 ng/mL sTfR/log ferritine > 2 

Controles 

n=26 

Hb 

normaal 

Geen inflammatie 

Normale ijzerstatus 

Hepcidine ACD > Controles > IDA 

ACD > ACD +IDA 

ACD+IDA = IDA



Theurl et al. 

2009



3) Lasocki et al. 2010 

48 ICU patienten, >1 week verblijf, Hb < 100 g/L 

Ijzerdeficiëntie “eminence based” 

Patiënten met ID: hepcidine-val, ondanks CRP↑ 

Cut-off via 100 ROC-curves: 

129.5 µg/L (sensitiviteit 50%; specificiteit 85%)


2. Chronische nieraandoeningen 

Babitt et al. 

2010



• Hepcidine ↑ bij CKD 

• Hepcidine ↑ bij hemodialyse 

Ashby, Li, Zaritsky 

Ashby, Valenti, Costa



r = -0.12 

Verband met eGFR: 

verdere opheldering 

nodig 

Peters et al. 

2010



• Hepcidine verschilt niet significant tussen EPOresponders 

en niet-responders 

(Ashby, Malyszko, Kato, Costa) 

Significant 

hogere EPO 

doses bij deze 

patiënten 

Costa et al.



Predictie ESA responders versus non-responders? 

Hepcidin ~ EPO dosis 

Ashby, et al. 

2009 

Kinetische bepaling?


3. Pediatrie 

• Screening tool (in urine): ijzerdeficiëntie 

detecteren vóór het ontwikkelen van anemie 

Geen data 

Regulatie ijzerabsorptie > 9 maand 

vb. ferroportin gen expressie

Pediatrie 

• TMPRSS6 : Iron-refractory Iron-Deficiency anemia 

hepcidin onaangepast hoog 

vroege opsporing van belang 

Cui et al. 

2009

Vraagstelling 






hemochromatose?

Diagnostische waarde van hepcidine 

bepaling 

• Waarde bij hemochromatose 

– Diagnose 

– Opvolging therapie 

IRON OVERLOAD

Diagnostische waarde: Hemochromatose 

Table 5: Characteristics of the hereditary forms of iron overload 

Classic 

1. Diagnose 

Juvenile 

HJV-related 

Hepcidin-related 

TfR2-related 

ferroportin 

disease 

gene HFE HJV HAMP TfR2 SLC40A1 

OMIM type 1 2a 2b 3 4 

interaction TfR1? BMP-R ferroportin transferrin hepcidin 

frequency frequent rare very rare very rare rare 

hepcidin (↓) ↓↓ ↓↓ ↓ ↑ 

severity ++ ++++ ++++ +++ + 

C282Y homozygoot ↔ C282Y/H63D : Normaal à↑ hepcidin 

HEPCIDIN/FERRITIN RATIO 

Swinkels et al. 

2006

Bozzini et al. 

2008 

Hepcidine 

onaangepast 

laag ten opzichte 

van ferritine

Swinkels et al. 

2006


2. Opvolging 

• Kan een hepcidine waarde als target worden 

gebruikt voor opvolging therapie? 

Lijkt onlogisch 

Deficiënte regulatie door hepcidin 

net aan basis ziekte


2. Opvolging 

Piperno et al. 

2007 

+ Phlebotomy


2. Opvolging 

Aderlatingen 

Ferritine 

↑ 

Ferritine 

3. Conclusies

Conclusies (1) 


• Prohepcidine 

• Serum voorkeur, urine = ? 

• Hepcidin-25 ELISA commercieel beschikbaar 

• Geen harmonisatie tussen methoden, sterke 

verschillen in absolute waarden 

• Diurnale variatie: nuchtere afname ‘s ochtends



• Hepcidine heeft potentieel om onderliggende 

ijzerdeficiëntie op te sporen 

• Geen gegevens van patiënten in “grijze zone” 

• Nood aan prospectief gevalideerde cut-off


2. Chronic kidney disease 

• Niet predictief voor slechte respons op EPO 

• Potentieel van kinetische bepaling??? 

3. Pediatrie 

• Alle data met (waardeloze) prohepcidine 

• Geen gegevens


Hemochromatose 

• Richtinggevend in protocol voor genotypering 

• Hepcidine studies aangewezen voor evalueren 

ferritine target in opvolging therapie 

(HFE mutaties)

4. To Do

Studieprotocol 

• Verzamelen stalen bij “duidelijke gevallen” 

ijzerdeficiëntie (n=50) en anemie van 

chronische ziekte (n=50) + gezonde controles 

(n=30) 

Indien populaties duidelijk verschillen: 

prospectief valideren van cut-off bij 50 

patiënten met anemie van onbekende origine

Studieprotocol 

ACD IDA Onduidelijke 

origine 

Anemie Hb < 11.5 g/dL Hb < 11.5 g/dL Hb < 11.5 g/dL 

Chronische ziekte 

CRP 

Ja 

>10 mg/L 

TSAT 100 µg/L

Bedankt voor uw aandacht

5. Referenties

5. Referenties 

• Ashby DR, Gale DP, Busbridge M, Murphy KG, Duncan ND, et al. Plasma hepcidin levels are elevated but 

responsive to erythropoietin therapy in renal disease. Kidney Int 2009; 75(9): 976-81 

• Babitt JL, Lin HY. Molecular Mechanisms of Hepcidin Regulation: Implications for the Anemia of CKD. Am 

J Kidney Dis 2010 Feb 25. [Epub ahead of print] 

• Balogh A, Szabó M, Kelen D, Bokodi G, Prechl J, et al. Prohepcidin levels during human perinatal 

adaptation. Pediatr Hematol Oncol 2007; 24(5): 361-8 

• Bergamaschi G, Villani L. Serum hepcidin: a novel diagnostic tool in disorders of iron metabolism. 

Haematologica 2009; 94(12): 1631-3 

• Brugnara C. Iron deficiency and erythropoiesis: new diagnostic approaches. Clin Chem 2003; 

49(10):1573-78 

• Castagna A, Campostrini N, Zaninotto F, Girelli D. Hepcidin assay in serum by SELDI-TOF-MS and other 

approaches. J Proteomics 2010; 73(3): 527-36 

• Cherian S, Forbes DA, Cook AG, Sanfilippo FM, Kemna EH, et al. An insight into the relationships 

between hepcidin, anemia, infections and inflammatory cytokines in pediatric refugees: a crosssectional 

study. PLoS One 2008; 3(12): e4030 

• Costa E, Swinkels DW, Laarakkers CM, Rocha-Pereira P, Rocha S, et al. Hepcidin serum levels and 

resistance to recombinant human erythropoietin therapy in haemodialysis patients. Acta Haematol 

2009; 122(4): 226-9 Nemeth E, Rivera S, Gabayan V, 

• Ganz T, Olbina G, Girelli D, Nemeth E, Westerman M. Immunoassay for human serum hepcidin. Blood 

2008; 112(10): 4292-7 

• Hadley KB, Johnson LK, Hunt JR. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum 

or urinary prohepcidin. Am J Clin Nutr 2006; 84(1): 150-5

• Hoppe M, Lönnerdal B, Hossain B, Olsson S, Nilsson F, et al. Hepcidin, interleukin-6 and hematological 

iron markers in males before and after heart surgery. J Nutr Biochem 2009 Jan; 20(1): 11-6 

• Huang X, Fung ET, Yip C, Zeleniuch-Jacquotte A. Serum prohepcidin is associated with soluble transferrin 

receptor-1 but not ferritin in healthy post-menopausal women. Blood Cells Mol Dis 2008; 41(3): 265-9 

• Kato A, Tsuji T, Luo J, Sakao Y, Yasuda H, et al. Association of prohepcidin and hepcidin-25 with 

erythropoietin response and ferritin in hemodialysis patients. Am J Nephrol 2008; 28(1): 115-21 

• Kemna E, Pickkers P, Nemeth E, van der Hoeven H, Swinkels D. Time-course analysis of hepcidin, serum 

iron, and plasma cytokine levels in humans injected with LPS. Blood 2005; 106(5): 1864-6 

• Kemna EH, Tjalsma H, Podust VN, Swinkels DW. Mass spectrometry-based hepcidin measurements in 

serum and urine: analytical aspects and clinical implications. Clin Chem 2007; 53(4): 620-8 

• Kemna EH, Kartikasari AE, van Tits LJ, Pickkers P, Tjalsma H, et al. Regulation of hepcidin: insights from 

biochemical analyses on human serum samples. Blood Cells Mol Dis 2008; 40(3): 339-46 

• Koliaraki V, Marinou M, Vassilakopoulos TP, Vavourakis E, Tsochatzis E, et al. A novel immunological 

assay for hepcidin quantification in human serum. PLoS One 2009; 4(2): e4581. 

• Kroot JJ, Kemna EH, Bansal SS, Busbridge M, Campostrini N, et al. Results of the first international round 

robin for the quantification of urinary and plasma hepcidin assays: need for standardization. 

Haematologica 2009; 94(12): 1748-52 

• Kroot JJ, Hendriks JC, Laarakkers CM, Klaver SM, Kemna EH, et al. (Pre)analytical imprecision, betweensubject 

variability, and daily variations in serum and urine hepcidin: implications for clinical studies. Anal 

Biochem 2009; 389(2): 124-9 

• Kulaksiz H, Gehrke S, Janetzko A, Rost D, Bruckner T, et al. Pro-hepcidin: expression and cell specific 

localisation in the liver and its regulation in hereditary haemochromatosis, chronic renal insufficiency, 

and renal anaemia. Gut 2004; 53: 735–743 

• Lasocki S, Baron G, Driss F, Westerman M, Puy H, et al. Diagnostic accuracy of serum hepcidin for iron 

deficiency in critically ill patients with anemia. Intensive Care Med 2010 Mar 6. [Epub ahead of print]

• Li H, Rose MJ, Tran L, Zhang J, Miranda LP. Development of a method for the sensitive and 

quantitative determination of hepcidin in human serum using LC-MS/MS. J Pharmacol Toxicol 

Methods 2009; 59(3): 171-80 

• Luukkonen S, Punnonen K. Serum pro-hepcidin concentrations and their responses to oral iron 

supplementation in healthy subjects manifest considerable inter-individual variation. Clin Chem Lab 

Med 2006; 44(11): 1361-2 

• Malyszko J, Malyszko JS, Mysliwiec M. Hyporesponsiveness to erythropoietin therapy in 

hemodialyzed patients: potential role of prohepcidin, hepcidin, and inflammation. Ren Fail 2009; 

31(7): 544-8. 

• Murphy AT, Witcher DR, Luan P, Wroblewski VJ. Quantitation of hepcidin from human and mouse 

serum using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Blood 2007; 110(3): 1048-54 

• Nemeth E, Keller C, Taudorf S, Pedersen BK, et al. IL-6 mediates hypoferremia of inflammation by 

inducing the synthesis of the iron regulatory hormone hepcidin. J Clin Invest 2004;113:1271–6 

• Orhon FS, Ulukol B, Hanoluk A, Akar N. Serum pro-hepcidin levels in infants with iron deficiency 

anaemia. Int J Lab Hematol 2008; 30(6): 546-7 

• Peters HP, Laarakkers CM, Swinkels DW, Wetzels JF. Serum hepcidin-25 levels in patients with chronic 

kidney disease are independent of glomerular filtration rate. Nephrol Dial Transplant 2010; 25(3): 

848-53 

• Piperno A, Girelli D, Nemeth E, Trombini P, Bozzini C, et al. Blunted hepcidin response to oral iron 

challenge in HFE-related hemochromatosis. Blood 2007; 110(12): 4096-100. 

• Roe MA, Spinks C, Heath AL, Harvey LJ, Foxall R, et al. Serum prohepcidin concentration: no 

association with iron absorption in healthy men; and no relationship with iron status in men carrying 

HFE mutations, hereditary haemochromatosis patients undergoing phlebotomy treatment, or 

pregnant women. Br J Nutr 2007; 97(3): 544-9

• Swinkels DW, Janssen MCH, Bergmans J, Marx JJM. Hereditary hemochromatosis: Genetic complexicity 

and new diagnostic approaches. Clin Chem 2006; 52(6): 950-68 

• Swinkels DW, Wetzels JF. Hepcidin: a new tool in the management of anaemia in patients with chronic 

kidney disease? Nephrol Dial Transplant 2008; 23(8): 2450-3 

• Theurl I, Aigner E, Theurl M, Nairz M, Seifert M, et al. Regulation of iron homeostasis in anemia of 

chronic disease and iron deficiency anemia: diagnostic and therapeutic implications. Blood 2009; 113: 

5277-86 

• Thomas C, Thomas L. Biochemical markers and hematologic indices in the diagnosis of functional iron 

deficiency. Clin Chem 2002; 48(7): 1066-76 

• Tiker F, Celik B, Tarcan A, Kilicdag H, Ozbek N, et al. Serum pro-hepcidin levels and relationships with iron 

parameters in healthy preterm and term newborns. Pediatr Hematol Oncol 2006; 23(4): 293-7 

• Ulukol B, Orhon FS, Hanoluk A, Akar N. Serum pro-hepcidin levels and relationship with ferritin in 

healthy non-anaemic infants. Acta Haematol 2007; 118(2): 70-2 

• Valenti L, Girelli D, Valenti GF, Castagna A, Como G, et al. HFE mutations modulate the effect of iron on 

serum hepcidin-25 in chronic hemodialysis patients. Clin J Am Soc Nephrol 2009; 4(8): 1331-7 

• Weiss G, Goodnough L. Anemia of chronic disease. N Engl J Med 2005; 352: 1011 

• Weiss G, Theurl I, Eder S, Koppelstaetter C, Kurz K, et al. Serum hepcidin concentration in chronic 

haemodialysis patients: associations and effects of dialysis, iron and erythropoietin therapy. Eur J Clin 

Invest 2009; 39(10): 883-90 

• Young MF, Glahn RP, Ariza-Nieto M, Inglis J, Olbina G, et al. Serum hepcidin is significantly associated 

with iron absorption from food and supplemental sources in healthy young women. Am J Clin Nutr 2009; 

89(2): 533-8 

• Zaritsky J, Young B, Wang HJ, Westerman M, Olbina G, et al. Hepcidin--a potential novel biomarker for 

iron status in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol 2009; 4(6): 1051-6.

hepcidin - UZ Leuven

Transform your PDFs into Flipbooks and boost your revenue!

Delete template?

Save as template ?