Equivalency testing of TTC Equivalency testing of TTC

watermicro.gr

Equivalency testing of TTC Equivalency testing of TTC

Equivalency testing of TTC-

Tergitol Agar (ISO 9308-1:2000)

with 5 culture media for the

detection of E. coli in water

samples in Greece

Mavridou A, E. Smeti, P. Boufa, M. Vagiona-

Arvanitidou,

A. Vantarakis, G. Mandilara, G. Vassilandonopoulou,

O. Pappa, V. Roussia, A. Tzouanopoulos, M. Livadara,

I Aisopou, V. Maraka, E. Nikolaou, V. Karaouli, and

A. Vatopoulos.


ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

Η σύγκριση µεθόδων για την καταµέτρηση E.coli σε

σύγκριση µε την επίσηµη µεθοδο που προτείνει η

Ευρωπαϊκή οδηγία για την ποιότητα του πόσιµου

νερού.

Η σύγκριση των µεθόδων σύµφωνα µε

συγκεκριµένο πρωτόκολλο αποτελεί µιά εναλλακτική

δυνατότητα για τα εργαστήρια που δεν θέλουν για

διάφορους λόγους να χρησιµοποιήσουν την µέθοδο

αναφοράς.

Eπισης µπορεί να χρησιµοποιηθεί σαν ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ

των µεθόδων. Εποµένως τα εργαστήρια που θέλουν

να διαπιστευθπούν γαι µια από αυτές τις µεθόδους

πρέπει να κανουν απλώς επαλήθευση


Προβλήµατα µεθόδου αναφοράς

Για καθαρά δείγµατα!

Χαµηλή αναγνωριµότητα «κανονικών»

δειγµάτων µε χλωρίδα

Μεγάλος χρόνος τελικού αποτελέσµατος

Τα περισσότερα ελληνικά εργαστήρια

προτιµούν άλλες µεθόδους

Η διαπίστευση ή οι υποχρεώσεις προς τα

Υποουργεία υποχρεώνει την χρήση της

µεθόδου αναφοράς


Επιλογή µεθόδων

Εγινε σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα διερεύνησης που

πραγµατοποιήθηκε από το διεργαστηριακό σχήµα

EQUASE–Greece (www.watermicro.gr

www.watermicro.gr, 2003).

Εργαστήρια %

µέθοδος

41.2% TTC- Tergitol agar

29.4% LSA,

11.7% TBX,

11.7% MFc

6% Chromocult Coliform Agar

Επίσης προστέθηκε το Colilert-18/ Quantitray επειδή

πολλά εργαστήτιαδήλωσαν ότι σκοπεύουν να το

χρησιµοποιήσουν


Τα εργαστήρια που συµµετείχαν

ΚΕ∆Υ

ΕΥ∆ΑΠ

ΕΣ∆Υ

Εργαστήριο Υγιεινής ΑΠΘ

Εργαστήριο Υγιεινής ∆ηµοκρίτειο

Γεν Χηµείο Ρόδου

∆ΕΥΑ Χανίων

∆ΕΥΑ Ηρακλείου

ΕΛΚΕΘΕ Ηράκλειο

Εργαστήριο ελέγχου τροφίµων (ιδιωτικό)

Η εργασία συντονίστηκε και χρηµατοδοτήθηκε από

το ΤΕΙ Αθήνας (Τµήµα Ιατρικών Εργαστηρίων)


Προετοιµασία δειγµάτων

Χρησιµοποιήθηκε διεθνές πρωτόκολλο

“The Microbiology of Drinking Water – Part 3”

(Standing Committee of Analysts, 2002).

∆ηµιουργήθηκαν χλωριωµένα και µή- χλωριωµένα

δείγµατα. . Tην παραµονή νερό έµεινε στο ψυγείο για

να καθιζάνουν τα αιωρούενα στερεά.

Μη Χλωριωµένα: : εµβολιάστηκαν µε λύµατα ώστε η

τελική συγκέντρωση E.coli και είανι 10-90

cfus/100ml

Xλωριωµένα: εµβολίαστηκαν χλωριοµένα δείγµατα

και προστέθηκε επι πλέον χλώριο ώστε η τελική

συγκέντρωση να είανι 0.1-0.5

0.5 ppm


Test method (reference) Incubation Interpretation, confirmation

TTC Tergitol 7 agar

(ISO 9308-1)

Membrane Faecal coliforms

agar

(APHA,9222D,1998)

Chromocult

Coliform agar

Membrane Lauryl Sulfate

agar

(HPA,W2,2005)

TBX (Tryptone Bile

x-glucoronide)

(ISO 16649-1)

Colilert 18/Quantitray

(DWI,2000)

36±2°C/21±3

h

44.5±0.2°C/2

4±2 h

yellow or yellow-green, oxidase-negative,

produce acid from lactose, produce indole from

tryptophan at 44.0±0.5 °C

β-glucuronidase production Colilert medium

36±2°C 18 h

various shades of blue, oxidase-negative,

produce acid from lactose, produce indole from

tryptophan at 44.0±0.5 °C

36±1°C/24±2

dark-blue to violet colonies (Salmon-GAL and

h

X-glucuronide reaction),

positive indole formation after coating the

typical colonies with KOVACS' indole reagent

44.5±0.2°

/24±2 h

yellow colonies, oxidase-negative, produce acid

from lactose, produce indole from tryptophan at

44.0±0.5 °C

44° C/ 4±3 h blue/green colonies oxidase-negative, produce

acid from lactose, produce indole from

tryptophan at 44.0±0.5 °C

36±2°C/18 h

yellow colour with fluorescence oxidasenegative,

produce acid from lactose produce


Eπιβεβαίωση

Ως προς το είδος των αποικιών: µόνο της

τυπικές από κάθε θρεπτικό υπόστρωµα

Ως προς τον αριθµό: τουλάχιστον το 5%

οπως ορίζει το ISO 8199. Ορισµένα

εργαστήρια επιβεβαίωσαν µεγαλύτερο

αριθµό αποικιών

Ως προς την µέθοδο: οξειδάση, ινδόλη.


Συµπληρωµατική επιβεβαιωτική

δοκιµή

Ορισµένες µέθοδοι βασίζονται στην ανίχνευση

της β-glucuronidase

Πολλοί ερευνητές θεωρούν αυτή την δοκιµασία

σταθερότερο κριτήριο ταυτοποίησης της Ε.coli

λόγω της Klebsiella oxytoca που δίνει Ινδόλη +

Αποφασίστηκε η δοκιµασία αυτή να προστεθεί

στις µεθόδους σαν επιπλέον κριτήριο

ταυτοποίησης.

Εκ των υστέρων εκδόθηκε το ISO 9308-1: 2000

Technical corrigentum1 που προτείνει την

ανίχνευση β-glucuronidase

(οχι υποχρεωτικά).


ISO 17994

αριθµός των εργαστηρίων και των δειγµάτων

αποφασίστηκε µε βάση τις επιταγές του ISO 17994

«for the establishment of equivalence between

quantitative microbiological methods».

Κάθε εργαστήριο εξέτασε > 30 δείγµατα µε 3 - 4

methods (MLSA, MFc, TBX, Chromocult Coliform

Agar,) παράλληλα µε την µέθοδο αναφοράς.

Ενα

εργαστήριο

ανάλυσε 76 δείγµατα µε

Chromocult Coliform Agar παράλληλα µε την µέθοδο

αναφοράς.

Ενα εργαστήριο ανάλυσε 76 δειγµατα µε Colilert 18/

Quantitray παράλληλα µε την µέθοδο αναφοράς.


Στατιστική επεξεργασία

Η στατιστική επεξεργασία που προτείνεται από το ISO 17994 is

based στην µέση σχετική διαφορά των µετρήσεων (RD) µετά

από επιβεβαίωση λογαριθµοποίηση και χρησιµοποιεί

παραµετρικές σταατιστικές µεθόδους.

Επειδή είναι συνηθισµένη η έλλειψη κανονικότητας

χρησιµοποιούντάι και µη παραµετρικές µέθοδοι ή συνδιασµός

των δύο

Χρησιµοποιήθηκε το Shapiro-Wilk Normality test για τον

υπολογισµό του RD%

Η εναλλακτική µέθοδος θεωρήθηκε καλύτερη όταν η µέση της

απόδοση ήταν ίση ή υψηλότερη από την µέθοδο αναφοράς.

Η εναλλακτική µέθοδος θεωρήθηκε ότι έδινε καλύτερη

αναζωογόνηση αν η διευρηµένη αβεβαιότητα περί το RD ήταν

>0.

Ισότιµη όταν αν η διευρηµένη αβεβαιότητα περί το RD ήταν =0.

Η εναλλακτική µεθοδος δεν έπρεπε να παρουσιάζει >10%

λιγότερη αναζωογόνηση από την µέθοδο αναφοράς.


Μη κανονική κατανοµή

Η αξιολόγηση χρησιµοποίησε το Wilcoxon

signed rank test (Lehmann, 1975),

µεχρήση του διάµεσου RD% αντί του

µέσου RD% .

∆εν εγιναν συγκρίσεις µεταξύ των

εναλλακτικών µέθόδων

Χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο

SPSS 13.0 for Windows


Χλωριωµένα- µη χλωριωµένα

Για τον υπολογισµό του RD µεταξύ

χλωρωµένων και µη χλωριοµένων

δειγµάτων χρησιµοποιήθηκε το t test ή το

non-parametric Mann-Whitney


Στατιστική ανάλυση Ι

RD i % = 100*[ln(a i ) - ln(b i )]

Τυπικό σφάλµα του µέσου:

ISO 17994

Std. Error = s//√n

Εκτεταµένη Αβεβαιότητα: U = 2* s/√n

Άνω όριο διαστήµατος εµπιστοσύνης: LO = RD% - U

Κάτω όριο διαστήµατος εµπιστοσύνης: ΗΙ = RD% + U

Μέγιστη αποδεκτή απόκλιση: D = 10%

Μη παραµετρική µέθοδος: Wilcoxon signed rank test


er of comparisons derived from the tests of non-chlorinated (chlorinated) samples per participating laboratory, and per alternative method vs. referen

Laborator

y

Alternative methods compared to TTC Tergitol 7 agar

MFc*

Chromocu

lt

MLSA* TBX* Colilert Total

1 34 (0) 32 (0) 33 (0) 30 (0) 76 (0) 205 (0)

2 28 (10) 28 (9) 28 (9) 84 (28)

3 39 (0) 39 (0) 39 (0) 117 (0)

4 29 (8) 29 (8) 28 (8) 86 (24)

5 38 (0) 38 (0) 38 (0) 114 (0)

6 27 (9) 55 (19) 28

(10)

110 (38)

7 38 (0) 38 (0) 37 (0) 113 (0)

8 38 (0) 38 (0) 38 (0) 114 (0)

9 25 (12) 24 (12) 25 (12) 74 (36)

10 36 (9) 33 (9) 33 (9) 102 (27)


RD% κάθε µεθόδου vs TTC Tergitol 7 for confirmed E.coli

Ν

mean

RD%

SD

MFC 303 8.81 49.2

4

Chro

mocul

t

MLSA 302

TBX 297

Colile

rt 18/

quanti

tray

ST

err

U P-

value

Exp U

Interv

LO

2.83 5.66 0.002 3.15

Exp U

Interv

HI

3.15 14.4

7

294 5.55 57.1

3.33 6.67 0.09 -

12.2

5 7 1.12 2

302 1 74.8

7

297 -

2.78

76 18.9

1

57.4

2

44.1

8

4.31 8.62 0.81

8

3.33 6.66 0.40

4

5.07 10.1

3


Λεζάντα πίνακα

+ η εναλλακτική µεθοδος σηµαντικά

καλύτερη αναζωογόνηση αποικίων από

την µέθοδο αναφοράς

ND Not different

P-value H 0 : mean RD%=0 vs H 1 mean

RD% ≠ 0

N number of comparisons


∆ιάγραµµα διασποράς m-Fc

vs Lactose TTC agar

(σε λογαριθµική κλίµακα)


∆ιάγραµµα διασποράς Chromocult vs Lactose TTC

agar (σε λογαριθµική κλίµακα)


∆ιάγραµµα διασποράς LSA vs Lactose TTC agar (σε

λογαριθµική κλίµακα)


∆ιάγραµµα διασποράς TBX vs Lactose TTC agar

(σε λογαριθµική κλίµακα)


∆ιάγραµµα διασποράς Colilert vs Lactose TTC agar

(σε λογαριθµική κλίµακα)


Συµπεράσµατα

Οι εναλλακτικές µέθοδοι τουλάχιστον

ισοδύναµες µε την Lactose TTC agar, αν οχι

καλύτερες.


Ευχαριστίες

Ειδικός Λογαρισµός Κονδυλίων Ερευνας ΤΕΙ Αθήνας

(πρόγραµµα Θαλής) γαι την χρηµατοδότηση

Εταιρεία Metrolab για προσφορά ορισµένων

αντιδραστηρίων.

Ολο το προσωπικό των συµµετεχόντων εργαστηρίων.

Την Καθ Βαγιωνά- Αρβανιτίδου για τις εύστοχες

παρατηρήσεις

Ιδιαίτερες ευχαριστίες στην κα Ελένη Σµέτη για την

στατιστική επεξεργασία και συµµετοχή στις πολλαπλές

διορθώσεις για την δηµοσίευση.

Ιδιαίτερες ευχαριστίες στην ∆ρ Γ Μανδηλαρά για την

συµµετοχή της στην συγγραφή της δηµοσίευσης στην

αρχή και σε όλες τις φάσεις.


∆ιήθηση

ISO 9308-1 n(2000)

Rapid method

Επώαση TSA medium , 36 ± 2°C/4 C/4-5h

Μεταφορά µεµβράνης TBA medium,

44 ± 0,5°C/19

C/19-20 h

ή

Χρήση ενός υλικού διπλής στρώσης

TBA/TBA, επώαση 36 ± 2°C/4 C/4-5h

και

44 ± 0,5°C/19 C/19-20 h


Επιβεβαίωση

ISO 9308-1 n(2000)

Rapid method

Μεταφορά της µεµβράνης σε τρυβλίο που

περιέχει ένα pad µε Kovacs

Tυπικές αποικίες: κόκκινες

Υπολογισµός αποτελεσµάτων:

ISO 8199

Οριο ανίχνευσης της µεθόδου

More magazines by this user
Similar magazines