噬菌体phi29 DNA包装马达磷脂膜嵌合体在单分子检测及 ... - 生命科学

第 23 卷 第 11 期2011 年 11 月生 命 科 学Chinese Bulletin of Life SciencesVol. 23, No. 11Nov., 2011文 章 编 号 :1004-0374(2011)11-1114-16噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用耿 佳 , 郭 培 宣 *( 美 国 辛 辛 那 提 大 学 医 学 院 / 工 程 学 院 , 纳 米 生 物 医 学 中 心 , 辛 辛 那 提 45267, 美 国 )摘 要 : 生 命 系 统 包 含 了 具 有 不 同 功 能 的 纳 米 机 器 和 高 度 有 序 的 大 分 子 结 构 。 所 有 的 双 链 线 性 DNA 病 毒使 用 由 ATP 驱 动 的 纳 米 分 子 马 达 将 其 基 因 包 装 在 蛋 白 质 外 壳 内 。 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 的 核 心 组 成 部分 连 接 器 已 被 成 功 嵌 入 到 脂 双 层 中 , 极 为 稳 定 且 可 用 于 离 子 和 DNA 转 运 的 精 确 测 量 。 它 在 包 装 DNA 时 具有 单 向 通 行 的 阀 门 机 制 , 同 时 其 关 闭 和 打 开 可 由 人 工 控 制 。 这 对 于 详 细 研 究 分 子 马 达 的 操 作 机 制 及 未 来 医药 应 用 中 DNA 的 包 装 、 测 序 、 采 样 和 投 递 都 具 有 重 要 意 义 。关 键 词 : 纳 米 马 达 ; 连 接 器 ; 离 子 通 道 ; 单 通 道 电 导 ; 病 毒 组 装 ; 计 量 定 量 化 ; 生 物 纳 米 技 术 ; 纳 米 生 物技 术中 图 分 类 号 :Q735; TB383 文 献 标 志 码 :AMembrane-embedded channel of bacteriophage phi29 DNA-packagingmotor for single molecule sensing and nanomedicineGENG Jia, GUO Pei-Xuan*(Nanobiomedical Center, College of Engineering and College of Medicine, University of Cincinnati,Cincinnati, OH 45267, USA)Abstract: The genome of linear double-stranded DNA (dsDNA) viruses is packaged into a preformed procapsidfueled by ATP hydrolysis. The central channel component of the bacteriophage phi29 motor is a connector protein,which has been successfully inserted into a lipid bilayer and exhibited robust capability for extremely reliable andprecise assessment of the transportation of ions and DNA by single channel studies. The motor channel exercised aone-way traffic property for dsDNA translocation with a valve mechanism in DNA-packaging. In addition, theopening and closure of the channel was also reversible and controllable. These findings have important implicationssince this artificial membrane-embedded channel would allow detailed investigations into discrete mechanisms ofmotor operation as well as future avenues for therapeutic dsDNA packaging, sampling, delivery and single moleculesensing.Key words: nanomotor; connector; ion channel; single channel conductance; viral assembly; stoichiometryquantification; bionanotechnology; nanobiotechnology病 毒 基 因 组 封 装 在 蛋 白 质 衣 壳 即 外 壳 中 。 生 物合 成 后 , 病 毒 结 构 蛋 白 和 基 因 组 相 互 作 用 形 成 一 个完 整 的 病 毒 粒 子 , 这 个 过 程 被 称 为 DNA 或 RNA 的包 装[1-2] 。 所 有 线 性 双 链 DNA 或 RNA 病 毒 , 包 括收 稿 日 期 :2011-07-11基 金 项 目 :National Institutes of Health Grants (GM059944, EB003730, EB012135, PN2 EY 018230)* 通 信 作 者 :E-mail: guop@purdue.edu, guopn@ucmail.uc.edu; Tel: +001-(513)558-0041; Fax: +001-(513)558-6079

第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1115双 链 DNA 噬 菌 体[1] 、 腺 病 毒[3] 、 痘 病 毒[4] 、 人 巨细 胞 病 毒[5] 、 单 纯 疱 疹 病 毒[6]和 双 链 RNA 噬 菌 体都 具 有 一 个 共 同 的 特 点 , 即 其 基 因 组 被 包 装 到 一 个预 先 形 成 的 原 壳 体 中 。 这 个 克 服 能 量 阻 力 的 过 程 ,由 从 ATP 水 解 获 得 能 量 的 包 装 马 达 完 成[1,8-10] 。 一个 DNA 包 装 的 有 趣 例 子 是 枯 草 杆 菌 (Bacillus subtilis)噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 , 其 在 包 装 过 程 中 涉 及了 蛋 白 质 、RNA 和 DNA [9,11-14] 。噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 包 括 一 个 由 12 个gp10 亚 基 组 成 的 连 接 器[15-16] ,6 个 与 ATP 结 合 的DNA 包 装 RNA(pRNA) [11,17-18] , 以 及 提 供 DNA 转 运所 需 化 学 能 的 ATP 酶 蛋 白 gp16 [19-20] ( 图 1A、B)。这 些 纯 化 组 分 可 在 体 外 结 合 并 组 装 成 为 迄 今 发 现 的最 有 力 的 纳 米 器 件 之 一[21] 。 连 接 器 由 12 个 gp10 亚基 组 成 , 各 含 有 3 个 α- 螺 旋 , 共 同 形 成 一 个 中 央通 道 , 宽 端 开 口 直 径 6.0 nm, 窄 端 3.6 nm( 图 1C、D)。该 通 道 宽 端 的 横 截 面 积 为 28 nm 2 , 窄 端 为 10 nm 2 。连 接 器 嵌 入 病 毒 衣 壳 及 定 位 是 由 疏 水 区 及 蛋 白 质 相互 作 用 调 节 的 。 许 多 病 毒 的 门 户 蛋 白 具 有 相 似 形 态 ,及 DNA 转 运 的 类 似 特 征 , 但 在 序 列 同 源 性 和 相 对分 子 质 量 上 具 有 较 大 差 异[22] 。高 度 敏 感 的 检 测 系 统 的 开 发 在 许 多 领 域 具 有 重要 性 , 例 如 病 原 鉴 定 、 疾 病 诊 断 、 环 境 监 测 和 国 家安 全 等 。 电 生 理 测 量 用 于 检 测 许 多 物 质 的 转 运 过 程 ,例 如 DNA、RNA、 多 肽 、 蛋 白 质 等 生 物 大 分 子 ,及 无 机 物 小 分 子 和 药 剂 等[23-27] 。 利 用 金 黄 色 葡 萄 球菌 的 α- 溶 血 素 通 道 , 可 以 测 定 单 链 RNA 或 DNA的 长 度[28] 。 随 后 , 发 夹 DNA 分 子 被 用 于 降 低 通 过 α-溶 血 素 的 转 运 速 率 , 表 明 纳 米 孔 可 以 区 分 单 核 苷 酸多 态 性[29] 。 一 种 由 DNA 寡 核 苷 酸 共 价 结 合 至 纳 米孔 内 腔 开 发 出 的 杂 交 传 感 器 被 用 于 检 测 单 碱 基 对 的差 异[30] 。 也 有 关 于 检 测 纳 米 孔 内 碱 基 对 堆 积 和 链方 向 的 报 道[31] 。 其 他 研 究 的 蛋 白 质 通 道 包 括 用 于检 测 聚 乙 二 醇 的 丙 甲 菌 素[32] , 以 及 耻 垢 分 枝 杆 菌(Mycobacterium smegmatis) 中 转 运 单 链 DNA 的 细胞 外 膜 孔 道 蛋 白 A [33] 等 。由 于 纳 米 孔 尺 寸 的 限 制 , 迄 今 为 止 大 部 分 的 研究 都 集 中 于 单 链 DNA 的 转 运 。 其 他 一 些 研 究 虽 然已 经 显 示 了 双 链 DNA 转 运 的 证 据[34-36] , 但 其 因 电压 门 控 和 信 号 波 动 而 在 传 感 用 途 上 应 用 有 限 。 于 是一 些 研 究 人 员 转 向 人 工 合 成 纳 米 孔 用 于 双 链 DNA测 序[37-39] 。 在 纳 米 尺 度 内 , 合 成 纳 米 孔 大 小 很 难 一致 , 并 且 较 难 进 行 生 物 化 学 修 饰 或 结 合 。 因 此 , 研究 人 员 仍 不 断 探 索 其 他 合 适 的 纳 米 孔 。[7]phi29 连 接 器 马 达 通 道 的 最 大 优 势 是 孔 道 大 ,故 可 允 许 双 链 DNA 通 过 。 本 文 将 论 述 脂 质 内 嵌phi29 纳 米 孔 的 各 种 用 途 。 由 于 phi29 连 接 器 蛋 白 晶体 结 构 已 知 , 所 以 对 其 进 行 重 组 较 为 容 易[40-41] 。 研 究人 员 已 经 通 过 修 饰 phi29 连 接 器 蛋 白 , 将 其 嵌 入 脂质 双 层 膜[42] 。 这 是 第 一 例 膜 蛋 白 和 离 子 通 道 之 外 嵌入 人 工 质 膜 的 蛋 白 质 。 结 合 电 生 理 膜 片 钳 技 术 , 可以 实 时 观 测 并 记 录 单 个 蛋 白 嵌 入 脂 质 双 层 膜 的 过 程以 及 通 过 纳 米 孔 的 电 流 。 在 双 层 脂 膜 中 , 每 个 孔 中的 电 导 几 乎 完 全 相 同 , 并 完 全 符 合 与 外 加 电 压 的 线性 关 系 。 电 压 驱 动 下 ,DNA 可 以 被 转 运 通 过 通 道 ,并 且 产 生 瞬 时 电 流 阻 断 信 号 。 这 些 电 流 阻 断 与 通 过单 个 孔 道 峰 值 电 流 的 比 例 , 与 DNA 和 孔 道 内 腔 横截 面 积 的 比 值 相 符 。 此 外 , 在 包 括 极 端 酸 碱 度 和 高盐 等 多 种 实 验 条 件 下 , 该 连 接 器 通 道 也 极 为 稳 定[43] 。基 于 连 接 器 纳 米 孔 的 稳 定 性 能 , 可 以 开 发 一 种 简 单 、可 重 复 的 纳 米 孔 数 量 测 定 技 术[43] 。 最 近 , 本 课 题 组研 究 表 明 双 链 DNA 通 过 phi29 连 接 器 通 道 的 转 运是 单 向 性 的[44] 。 这 个 系 统 与 其 他 系 统 相 比 较 为 显 著的 优 势 在 于 较 大 的 通 道 , 并 且 允 许 双 链 和 单 链 DNA通 过 。 较 大 的 孔 径 也 使 其 更 容 易 通 过 插 入 或 结 合 化学 基 团 进 行 通 道 修 饰 以 增 强 传 感 应 用 。 这 些 发 现 具有 重 要 意 义 , 因 为 对 于 DNA 包 装 马 达 的 人 工 膜 结构 研 究 , 有 利 于 详 细 研 究 马 达 的 操 作 机 制 以 及 未 来治 疗 用 途 DNA 的 包 装 、 测 序 、 采 样 和 投 递 。1 phi29 连 接 器 的 重 组 、 表 达 、 纯 化 及 包 含 重组 连 接 器 蛋 白 的 脂 质 囊 泡 的 制 备1.1 phi29 连 接 器 的 重 组 、 表 达 及 纯 化表 达 连 接 器 蛋 白 及 其 十 二 聚 体 组 装 的 质 粒 已被 构 建[41] , 关 于 连 接 器 蛋 白 末 端 的 修 改 也 有 研究[40,45-46] 。 简 言 之 , 对 质 粒 的 修 改 可 通 过 两 步 聚合 酶 链 式 反 应 实 现 。 将 表 达 质 粒 转 化 到 大 肠 杆 菌(Escherichia coli) HMS174(DE3) 菌 株 中 以 表 达 蛋 白 。链 球 菌 肽 标 记 连 接 器 蛋 白 , 可 使 用 带 有 Streptactin(IBA, St. Louis, MO) 的 亲 和 色 谱 柱 纯 化 。1.2 包 含 重 组 连 接 器 蛋 白 的 脂 质 囊 泡 的 制 备将 连 接 器 蛋 白 直 接 嵌 入 双 层 脂 膜 平 面 作 为 纳 米孔 的 尝 试 均 告 失 败 , 因 此 采 用 了 一 个 两 步 间 接 策 略 :首 先 将 重 组 连 接 器 蛋 白 结 合 在 脂 质 囊 泡 中 , 其 次 通过 囊 泡 融 合 将 连 接 器 间 接 嵌 入 到 双 层 脂 膜 中[42] 。连 接 器 蛋 白 的 表 面 电 荷 分 析 表 明 , 其 中 心 表 面与 两 侧 的 宽 端 和 窄 端 相 比 具 有 轻 微 疏 水 区 域 ( 图1C) [15-16] 。 连 接 器 的 碳 端 位 于 较 宽 开 口 一 侧 , 并 嵌 入

1116生 命 科 学第 23 卷A,phi29 DNA 包 装 马 达 ;B, 整 个 马 达 , 显 示 了 DNA 转 运 通 过 连 接 器 [42] ;C,phi29 连 接 器 的 侧 视 图 , 显 示 疏 水 性 和 亲 水层 [15-16,40-41] ;D, 连 接 器 的 顶 视 图 , 显 示 通 道 较 宽 和 较 窄 部 分 的 直 径 [42] ;E, 考 马 斯 亮 蓝 染 色 的 SDS- 凝 胶 , 显 示 野 生 型 和 改 造型 的 连 接 器[42] ;F~H, 经 纯 化 的 改 造 连 接 器 组 成 的 阵 列 , 这 是 由 透 射 电 子 显 微 镜 (F、G) [42] 和 原 子 力 显 微 镜 (H) [43]观 测 到 的 。图 片 A 引 自 文 献 [44], 图 片 B~G 引 自 文 献 [42], 图 片 H 引 自 文 献 [43]。图 1 噬 菌 体 phi29 包 装 马 达 和 连 接 器 蛋 白 的 结 构在 病 毒 原 壳 体 中 。 疏 水 层 与 原 壳 体 的 壳 接 触 ( 图1A)。脂 质 双 层 通 常 包 含 亲 水 - 疏 水 - 亲 水 的 结 构 。为 了 促 进 嵌 入 脂 质 膜 , 通 过 使 用 碱 性 多 肽 取 代 gp10碳 端 25 个 残 基 , 连 接 器 的 亲 水 - 疏 水 - 亲 水 结 构 得到 加 强 。 重 组 的 gp10 经 纯 化 后 自 组 装 为 十 二 聚 体结 构 , 经 过 原 子 力 显 微 镜 、 透 射 电 镜 和 十 二 烷 基 硫酸 钠 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (SDS-PAGE) 实 验 , 表明 其 与 野 生 型 连 接 器 蛋 白 形 态 、 大 小 类 似 ( 图1E~H)。 重 组 连 接 器 蛋 白 能 够 纳 入 原 壳 体 并 包 装 双链 DNA, 并 组 装 产 生 具 有 感 染 力 的 phi29 病 毒 的 实验 , 证 实 了 该 重 组 蛋 白 具 有 正 确 的 结 构 。蛋 白 连 接 器 在 脂 质 膜 中 的 嵌 入 通 过 荧 光 显 微镜 、 渗 滤 检 测 和 沉 降 分 析 得 到 了 证 实 ( 图 2)。 环 形绕 脂 质 体 形 成 的 荧 光 环 , 证 实 了 荧 光 标 记 连 接 器 蛋白 的 存 在 ( 图 2A i)。 该 环 形 荧 光 与 荧 光 脂 质 体NBD-PE 形 成 的 荧 光 环 相 似 ( 图 2A ii)。 当 把 荧 光 标记 的 连 接 器 与 脂 质 体 非 特 异 性 混 合 时 , 没 有 环 形 荧光 出 现 ( 图 2A iii)。 蛋 白 通 过 使 用 0.45 μm 滤 膜 过 滤 ,或 5% ~20% 蔗 糖 梯 度 离 心 法 将 游 离 的 连 接 器 蛋 白 去除 ( 图 2B、C)。 此 外 通 过 荧 光 漂 白 恢 复 证 实 , 嵌 入连 接 器 蛋 白 的 脂 质 体 膜 仍 然 保 持 其 流 动 性 ( 图 2D)。

第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1117A, 包 含 连 接 器 的 巨 脂 质 体 (~ 50 μm) 的 荧 光 图 像 :(i)NBD-PE 标 记 的 脂 质 体 , 不 含 连 接 器 ;(ii) 含 有 FITC 标 记 的 连 接 器 的 蛋 白脂 质 体 ;(iii)FITC 标 记 连 接 器 与 脂 质 体 非 特 异 性 的 混 合 。B, 膜 过 滤 分 离 掉 大 部 分 游 离 的 连 接 器 。C, 使 用 蔗 糖 梯 度 沉 淀 分离 脂 质 体 / FITC 标 记 连 接 器 复 合 物 。 游 离 的 连 接 部 位 出 现 在 顶 部 , 而 在 蛋 白 脂 质 体 保 持 在 底 部 。 馏 分 #1-12 未 显 示 。D, 荧光 漂 白 恢 复 (FRAP) 实 验 证 实 荧 光 ( 红 色 ) 标 记 脂 双 层 的 流 动 性 , 漂 白 区 域 ( 黑 色 ) 的 荧 光 强 度 由 于 脂 质 扩 散 随 时 间 推 移 而 逐 渐 增加 。E, 通 过 囊 泡 融 合 , 连 接 器 嵌 入 到 平 面 脂 双 层 的 示 意 图 。 图 片 引 自 文 献 [42]。图 2 连 接 器 - 脂 质 体 嵌 合 体 的 图 像上 述 实 验 并 不 能 区 分 连 接 器 蛋 白 在 膜 表 面 简 单附 着 , 或 是 嵌 入 膜 内 形 成 一 个 通 道 。 蛋 白 通 道 是 否嵌 入 脂 质 体 膜 内 , 将 由 下 一 节 所 述 的 单 通 道 电 导 检测 方 法 确 认 。2 单 通 道 电 生 理 检 测 phi29 连 接 器 蛋 白 通 道2.1 连 接 器 蛋 白 嵌 入 平 面 脂 双 层用 于 单 通 道 电 生 理 测 量 的 装 置 , 由 水 平 脂 双 层腔 以 及 带 有 一 个 直 径 100~200 μm 孔 的 聚 四 氟 乙 烯薄 膜 组 成 。 该 膜 将 腔 分 为 顺 式 腔 室 ( 上 腔 ,250 μL容 量 ) 和 反 式 腔 室 ( 下 腔 ,2.5 mL 容 量 ) 两 部 分 。将 稀 释 的 连 接 器 蛋 白 脂 质 体 直 接 加 入 顺 式 腔 室 , 并等 待 嵌 入 脂 双 层 膜 。 电 流 放 大 器 的 首 级 信 号 采 集 片上 直 接 连 接 有 一 对 银 / 氯 化 银 电 极 , 用 于 测 量 通 过双 层 类 脂 膜 的 电 流 。 该 电 流 用 膜 片 钳 放 大 器 与 模 拟数 字 转 换 器 耦 合 。 数 据 由 软 件 收 集 并 分 析 。将 连 接 器 蛋 白 直 接 加 入 平 面 脂 质 双 层 , 或 将 脂质 体 加 入 平 面 脂 质 双 层 , 并 不 能 在 双 层 膜 上 形 成 通道 ( 图 3A)。 只 有 将 带 有 连 接 器 蛋 白 的 脂 质 体 与 脂双 层 融 合 后 , 才 能 观 测 到 通 道 嵌 入 ( 原 理 见 图 2E)。如 连 续 电 流 跟 踪 ( 图 3B) 所 示 , 通 道 嵌 入 具 体 表 现为 电 导 的 分 步 增 加 ( 每 一 步 代 表 一 个 蛋 白 通 道 嵌入 )。 在 施 加 正 电 或 施 加 负 电 情 况 下 , 嵌 入 均 可 发生 ( 图 3C)。 嵌 入 到 膜 内 的 蛋 白 通 道 数 量 可 以 简 单地 通 过 电 流 增 加 步 数 来 计 算 。一 系 列 多 种 溶 液 条 件 下 的 实 验 证 实 , 每 个 蛋 白通 道 嵌 入 引 发 的 电 流 几 乎 完 全 相 同 ( 图 3E), 形 成一 个 较 窄 、 锋 利 的 高 斯 分 布 。 例 如 在 -75 mV、5mmol/L Tris、pH 值 7.9、1 mol/L 氯 化 钠 的 条 件 下 ,一 个 蛋 白 通 道 在 脂 双 层 膜 的 插 入 增 加 约 220 pA 的电 流 ( 相 当 于 ~3 nS)。 有 时 可 以 观 测 到 单 步 嵌 入 2个 和 3 个 蛋 白 通 道 , 其 几 率 大 约 分 别 为 5% 和 2%。2.2 单 一 ( 或 多 个 ) 蛋 白 通 道 的 电 流 电 压 关 系对 含 有 一 个 或 者 多 个 连 接 器 的 脂 双 层 膜 施 加 一个 从 -100 mV 到 +100 mV 的 斜 坡 电 压 (2.2 mV/s),电 流 - 电 压 曲 线 显 示 良 好 的 线 性 关 系 , 从 而 展 示了 该 通 道 性 能 稳 定 且 电 导 一 致 。 图 3D 展 示 了 在5 mmol/L Trips、2 mol/L 氯 化 钠 (pH 7.8) 溶 液 中 ,1个 、2 个 、3 个 连 接 器 嵌 入 的 电 流 轨 迹 。 连 接 器 增加 的 数 目 与 斜 率 的 增 加 相 关 , 但 每 个 通 道 的 电 导 相同 , 这 进 一 步 表 明 了 phi29 连 接 器 通 道 在 脂 双 层 膜中 的 统 一 尺 寸 和 稳 定 性 。除 连 接 器 通 道 的 数 量 , 电 导 还 取 决 于 离 子 浓 度和 离 子 种 类 ( 图 4)。 从 电 流 - 电 压 曲 线 中 可 以 得 出 ,在 0.5 、1.0 、1.5 和 2.0 mol/L 氯 化 钠 中 , 电 导 分 别测 定 为 1.75 ± 0.11 nS、3.03 ± 0.02 nS、4.07 ± 0.26

1118生 命 科 学第 23 卷A, 仅 加 入 连 接 器 ( 上 部 ) 或 脂 质 体 ( 底 部 ) 的 脂 双 层 。B, 施 加 含 有 连 接 器 的 蛋 白 脂 质 体 , 引 发 的 多 步 嵌 入 。 插 图 , 一 个 ( 上 ) 和两 个 ( 底 部 ) 连 接 器 同 时 嵌 入 。C, 连 接 器 在 正 电 压 ( 顶 部 ) 和 负 电 压 ( 底 部 ) 下 嵌 入 。D, 线 性 电 流 - 电 压 关 系 的 数 据 说 明 连 接 器 的稳 定 性 质 。 斜 率 随 连 接 器 数 量 的 增 加 而 增 加 , 且 每 个 通 道 的 电 导 相 同 。E, 直 方 图 显 示 膜 内 的 连 接 器 电 导 均 一 。 图 片 A~C 引自 文 献 [42], 图 片 D~E 引 用 自 文 献 [43]。图 3 电 导 检 测 确 认 连 接 器 的 嵌 入 脂 质 双 层 膜 (BLM)nS、4.60 ± 0.05 nS, 表 明 随 着 盐 浓 度 增 加 , 电 导 增加 ( 图 4A、C)。 相 同 浓 度 下 , 在 氯 化 钾 溶 液 中 的 电导 值 比 在 氯 化 钠 溶 液 中 高 : 在 0.5、1.0、1.5 和 2.0mol/L 氯 化 钾 中 , 电 导 分 别 为 2.70 ± 0.21 nS、4.65 ±0.11 nS、6.23 ± 0.32 nS、7.83 ±0.20 nS( 图 4B、D)。2.3 用 于 确 定 嵌 入 脂 双 层 的 连 接 器 数 量膜 / 连 接 器 复 合 物 的 电 导 G m , 可 以 通 过 以 下两 种 方 法 计 算 。(1) 在 一 特 定 电 压 下 , 由 连 接 器 嵌入 引 起 的 电 流 跳 跃 的 大 小 。 在 此 情 况 下 , 测 量 的 电流 值 与 所 加 电 压 之 比 即 为 电 导 值 。(2) 在 斜 坡 电 压下 , 电 流 痕 迹 的 斜 率[47] 。 第 二 种 方 法 中 , 因 为 斜 率包 含 了 许 多 数 据 点 , 并 且 考 虑 了 银 / 氯 化 银 电 极 的表 面 电 势 以 及 膜 接 触 电 势 等 因 素 , 所 以 给 出 的 值 更精 确 。可 使 用 相 同 的 方 法 , 测 量 脂 双 层 中 一 个 通 道 的电 导 G c 。 由 于 phi29 连 接 通 道 大 小 均 匀 , 且 在 较 大盐 浓 度 范 围 内 稳 定 , 由 此 推 断 膜 / 连 接 器 的 电 导 与膜 中 连 接 器 的 数 目 有 线 性 关 系 ( 图 4C、D)。 事 实 上 ,在 氯 化 钠 和 氯 化 钾 缓 冲 溶 液 中 都 呈 线 性 关 系 。 表 1显 示 了 采 用 独 立 电 流 计 算 所 得 的 单 通 道 电 导 。因 此 脂 双 层 内 通 道 的 数 量 可 通 过 测 量 溶 液 电 导率 及 计 算 脂 双 层 的 电 导 , 由 I-V 关 系 图 的 斜 率 得 出 。通 道 电 导 的 计 算 值 ( 从 派 生 方 程 ) 与 在 同 样 缓 冲 溶液 条 件 下 使 用 电 流 跳 跃 所 获 得 的 值 吻 合 较 好 。2.4 phi29 连 接 通 道 与 α- 溶 血 素 的 电 导 比 较连 接 器 通 道 的 窄 端 直 径 为 3.6 nm, 而 α-HL 形成 的 通 道 直 径 只 有 1.5 nm [48] 。 可 以 计 算 出 连 接 器 和α-HL 通 道 截 面 积 的 比 例 为 5.7。 连 接 器 与 α-HL 的

第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1119A~B, 单 个 连 接 通 道 在 不 同 盐 浓 度 下 的 电 流 - 电 压 曲 线 。A, 含 有 5 mmol/L Tris 的 不 同 浓 度 的 氯 化 钠 溶 液 ,pH 值 7.8;B, 含有 5 mmol/L HEPES 的 不 同 浓 度 的 氯 化 钾 溶 液 ,pH 值 7.8。C~D, 不 同 盐 浓 度 条 件 下 电 导 - 连 接 器 数 目 的 关 系 曲 线 。C, 含 有5 mmol/L Tris 的 不 同 浓 度 的 氯 化 钠 溶 液 ,pH 值 7.8;D, 含 有 5 mmol/L HEPES 的 不 同 浓 度 的 氯 化 钾 溶 液 。 所 有 测 得 的 电 导 均来 自 三 个 以 上 的 独 立 实 验 。 误 差 线 代 表 测 量 的 标 准 差 。 在 氯 化 钠 溶 液 中 的 回 归 方 程 为 分 别 为 :0.5 mol/L 氯 化 钠 中 ,G m / nS =1.73 × N + 0.01;1.0 mol/L 氯 化 钠 中 ,G m / nS = 2.77 × N + 0.26;1.5 mol/L 氯 化 钠 中 ,G m / nS = 3.81 × N + 0.26;2.0 mol/L 氯 化钠 中 ,G m / nS = 4.62 × N - 0.00。 在 氯 化 钾 溶 液 中 的 回 归 方 程 为 分 别 为 :0.5 mol/L 氯 化 钾 中 G m / nS = 2.60 × N + 0.11;1.0 mol/L 氯 化钾 中 G m / nS = 4.73 × N - 0.10;1.5 mol/L 氯 化 钾 中 G m / nS = 6.35 × N - 0.16;2.0 mol/L 氯 化 钾 中 G m / nS = 7.86 × N - 0.01。E~F,在 含 有 5 mmol/L Tris 的 0.5~2.0 mol/L 氯 化 钠 溶 液 (E) 和 含 有 5 mmol/L HEPES 的 0.5 ~2.0 mol/L 氯 化 钾 溶 液 (F) 中 , 溶 液 电 导 率 与单 个 连 接 器 电 导 的 关 系 。 图 片 引 自 文 献 [43]。图 4 不 同 条 件 下 phi29 连 接 器 通 道 的 电 导

1120生 命 科 学第 23 卷表 1 从 离 散 电 流 跳 跃 测 量 及 经 验 公 式 计 算 所 得 的 单 通 道 电 导 比 较独 立 实 验 缓 冲 溶 液 经 离 散 步 数 计 算 的 缓 冲 溶 液 电 导 (mS/cm) 使 用 经 验 公 式 计 算的 数 目 单 通 道 的 电 导 (nS) 的 单 通 道 电 导 (nS)2 5 mmol/L Tris + 0.5 mol/L NaCl 1.65 ± 0.07 (n=62) 44.6 1.726 5 mmol/L Tris + 1 mol/L NaCl 3.04 ± 0.56 (n=52) 76.3 2.793 5 mmol/L Tris + 2 mol/L NaCl 4.71 ± 0.18 (n=45) 130.9 4.6440 TMS + 1 mol/L NaCl 3.14 ± 0.36 (n=500) 80.5 2.942 5 mmol/L HEPES + 0.5 mol/L KCl 2.48 ± 0.13 (n=10) 54.4 2.734 5 mmol/L HEPES + 1 mol/L KCl 4.73 ± 0.20 (n=9) 99.7 4.49注 : 表 1 中 的 电 导 同 在 施 加 电 压 下 所 测 得 的 离 散 步 骤 的 电 流 跳 跃 之 比 进 行 计 算 , 第 三 列 中 的 数 值 “n” 代 表 嵌 入 连 接 器 的 数 目 。所 测 电 导 的 比 率 为 5.1( 见 表 2)。 由 于 通 道 的 电 导 与其 横 截 面 面 积 成 正 比 , 因 此 可 以 得 出 结 论 认 为 , 在缓 冲 溶 液 内 连 接 器 的 横 截 面 面 积 约 为 α-HL 的 5.1倍 , 这 与 两 个 蛋 白 晶 体 数 据 较 为 相 符 。3 双 链 DNA 的 转 运3.1 通 过 phi29 连 接 器 通 道 转 运 双 链 DNA早 在 15 年 前 , 已 通 过 α- 溶 血 素 通 道 证 实 , 可利 用 纳 米 孔 来 转 运 DNA。 其 概 念 源 于 经 典 的 “ 库 尔特 计 数 器 ”, 即 检 测 非 电 解 质 逆 向 通 过 电 化 学 势 梯 度穿 过 一 个 孔 所 阻 碍 的 离 子 流 。 长 短 不 一 (12~5 000bp) 线 性 双 链 DNA 存 在 下 , 可 以 观 测 到 大 量 的 瞬 时电 流 阻 断 事 件 ( 每 个 代 表 一 个 DNA 分 子 的 转 运 )( 图5B)。 加 入 环 形 质 粒 DNA(Cx43) 后 , 没 有 观 测 到 这样 的 阻 断 事 件 , 其 原 因 大 概 是 由 于 质 粒 DNA 的 超螺 旋 性 质 。 然 而 经 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 I (DNase I) 消 化A, 双 链 DNA 通 过 脂 双 层 中 的 连 接 器 孔 转 运 的 示 意 图 。B, 双 链 DNA 通 过 纳 米 孔 转 运 的 典 型 电 流 阻 断 事 件 。 插 图 : 放 大 的 电流 阻 断 事 件 , 显 示 电 流 的 深 度 和 转 运 的 驻 留 时 间 。45 pM 双 链 环 状 质 粒 DNA 引 发 的 典 型 阻 断 :C, 无 DNA 酶 消 化 ;D, 经 过DNA 酶 消 化 。 图 片 C 和 D 引 自 文 献 [42]。图 5 通 过 phi29 连 接 器 孔 道 检 测 双 链 DNA 的 转 运 事 件

第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1121表 2 GP-10 连 接 器 和 α- 溶 血 素 的 单 通 道 电 导 的 比 较蛋 白 质 孔 直 径 (nm) 截 面 积 (nm 2 ) 电 导 (nS/ 孔 ) a0.5 mol/L 氯 化 钠 1 mol/L 氯 化 钾连 接 器 3.6 10.2 1.57 ± 0.16 4.84 ± 0.15α- 溶 血 素 1.5 [48] 1.8 0.31 ± 0.05 b 0.94 ± 0.01 c比 值 ( 连 接 器 /α-HL) 2.4 5.7 5.1 5.1a0.5 mol/L 氯 化 钠 及 1 mol/L 氯 化 钾 中 的 连 接 器 电 导 的 数 据 分 别 来 自 总 计 38 和 36 个 实 验 。0.5 mol/L 氯 化 钠 及 1 mol/L 氯 化 钾 中 的连 接 器 电 导 的 数 据 分 别 来 自 总 计 4 个 实 验 。b据 报 道 , 在 1 mol/L 氯 化 钠 条 件 下 ,α-HL 的 电 导 为 0.68 nS/ 孔 [66] 。c[67]据 报 道 , 在 1 mol/L 氯 化 钾 条 件 下 ,α-HL 的 电 导 为 0.80 nS/ 孔 或 1.0 nS/ 孔 [29] 。后 , 可 以 观 测 到 大 量 的 DNA 转 运 事 件 , 表 明 phi29通 道 仅 能 转 运 线 性 双 链 DNA( 图 5A、C、D)。在 多 个 通 道 存 在 的 情 况 下 , 偶 尔 可 以 观 测 到 一个 或 多 个 平 台 的 阻 断 事 件 , 显 示 了 通 过 多 个 通 道 的同 时 转 运 。 观 测 中 , 阻 断 事 件 的 发 生 概 率 随 DNA浓 度 增 加 及 电 压 升 高 而 增 长 , 这 与 预 期 相 符 。3.2 DNA 电 流 阻 断 事 件 的 表 征单 个 通 道 阻 断 事 件 的 一 个 参 数 为 电 流 阻 断 的 深度 , 使 用 电 流 阻 断 百 分 比 来 表 示 , 计 算 方 法 如 下 :DNA 转 运 产 生 的 电 流 阻 碍 除 以 单 个 连 接 器 嵌 入 所 产生 电 流 的 步 幅 。 在 双 链 DNA 存 在 的 情 况 下 , 通 道阻 断 的 中 值 为 ~32% ( 图 6A), 这 与 通 道 ( 最 窄 处 3.6nm) 和 双 链 DNA ( 直 径 ~2 nm) 的 尺 寸 相 一 致 。 也 就是 说 , 阻 断 % =[π·(2÷2) 2 /π·(3.6÷2) 2 ]×100。 此 外 ,观 察 到 的 每 一 个 瞬 间 电 流 阻 断 事 件 几 乎 相 同 , 呈 较窄 的 高 斯 分 布 ( 图 6A)。另 一 个 DNA 转 运 事 件 的 参 数 是 驻 留 时 间 (τp),它 代 表 DNA 通 过 通 道 转 运 所 需 的 时 间 ( 图 6B)。 驻留 时 间 分 布 呈 指 数 衰 减 函 数 。 峰 值 驻 留 时 间 代 表 最有 可 能 的 转 运 持 续 时 间 。 例 如 , 在 -75 mV 和 -40mV 下 ,5 kb 的 双 链 DNA 峰 值 驻 留 时 间 分 别 为 9.2ms 和 22.1 ms, 证 明 了 DNA 转 运 驻 留 时 间 受 到 外加 电 压 的 影 响 。 此 外 , 如 图 6B 所 示 ,35 bp 和 5 kb的 双 链 DNA 的 驻 留 时 间 相 比 , 长 度 较 短 的 DNA具 有 较 短 的 驻 留 时 间 。3.3 pH 值 对 连 接 器 通 道 稳 定 性 和 转 运 行 为 的 影 响在 极 端 pH 值 条 件 下 , 在 两 个 腔 室 加 入 20 bp的 双 链 DNA, 对 连 接 器 通 道 的 稳 定 性 进 行 了 测 试 。在 1mol/L NaCl 溶 液 中 , 在 不 同 pH 值 条 件 下 , 纪录 恒 定 电 压 下 的 电 流 踪 迹 。 电 导 值 分 别 为 :pH = 2(5 mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 ) 时 为 2.50 ± 0.11 nS (6 例 ),pH = 7 (5 mmol/L Na 2 HPO 4 缓 冲 液 ) 时 为 2.73 ± 0.07nS (6 例 ),pH = 12 (5 mmol/L Na 2 HPO 4·7H 2 O 缓 冲 )时 为 2.78 ± 0.12 nS。 极 端 pH 下 的 通 道 仍 然 打 开 ,并 且 具 有 一 致 的 通 道 电 导 。 此 外 , 也 观 测 到 了 DNA转 运 事 件 。 在 pH = 2 时 , 嘌 呤 酸 形 成 , 导 致 较 短 阻断 事 件 的 发 生 。 虽 然 DNA 的 结 构 受 到 极 端 pH 条件 的 影 响 , 但 phi29 连 接 器 通 道 在 强 酸 性 或 碱 性 条件 下 仍 然 稳 定 。3.4 电 流 信 号 中 可 能 的 信 号 失 真随 机 噪 声 可 能 产 生 失 真 。 连 接 器 通 道 本 身 非 常稳 定 , 其 电 导 均 一 , 且 在 -150 mV 到 +150 mV 范围 内 不 显 示 电 压 门 控 。 有 时 能 观 测 到 与 采 样 频 率 极限 时 间 接 近 的 非 特 异 性 阻 断 事 件 。 因 为 在 未 加 入DNA 时 , 这 些 事 件 也 同 样 出 现 , 因 此 归 因 于 包 含连 接 器 的 脂 质 体 与 平 面 脂 双 层 膜 相 互 作 用 的 结 果 。此 外 , 在 向 腔 室 中 加 入 更 多 脂 质 体 后 其 出 现 频 率 增加 。 可 以 通 过 稀 释 含 有 连 接 器 的 脂 质 体 来 减 小 此 类事 件 的 发 生 。DNA 也 可 与 通 道 碰 撞 , 而 实 际 上 不 被 转 运 通过 。 这 也 增 加 了 非 特 异 性 阻 断 事 件 。 较 长 的 DNA尤 其 容 易 发 生 该 现 象 , 因 为 在 转 运 开 始 前 需 要 一 个最 佳 的 构 象 。 然 而 , 一 旦 转 运 开 始 ,DNA 逆 向 电场 梯 度 的 向 回 扩 散 是 很 难 发 生 的 。3.5 定 量 PCR 验 证 双 链 DNA 的 转 运为 验 证 电 流 阻 断 事 件 确 为 双 链 DNA 转 运 通 过连 接 器 通 道 , 用 荧 光 染 料 试 剂 盒 (SYBR Green, Bio-Rad) 进 行 定 量 PCR, 以 量 化 在 恒 定 电 压 下 DNA 的转 运 ( 图 6C, 上 )。 在 反 式 腔 室 加 入 141 bp 的 DNA,并 每 隔 30 min 从 顺 式 腔 室 取 样 用 于 定 量 。 在 顺 式 腔室 里 的 DNA 分 子 数 目 随 着 时 间 的 增 加 而 增 加 (9 例实 验 ), 并 且 DNA 转 运 的 速 率 受 到 嵌 入 连 接 器 的 数目 影 响 。 为 了 便 于 比 较 , 在 没 有 连 接 器 的 条 件 下 进行 了 对 照 实 验 ( 图 6C, 下 )。 在 对 照 条 件 下 , 顺 式腔 室 内 的 DNA 分 子 数 目 在 90 min 内 均 在 可 检 测 范围 (4 例 实 验 )。 此 外 还 观 测 到 , 电 流 踪 迹 的 阻 断 事件 数 目 与 Q-PCR 检 测 的 转 运 通 过 通 道 的 DNA 数 目( 图 6D) 呈 正 相 关 。

1122生 命 科 学第 23 卷A, 在 -75 mV 恒 定 电 压 下 ,1 mol/L 氯 化 钠 ,pH 值 7.8 的 溶 液 中 , 线 性 双 链 DNA(2 kb) 引 起 的 电 流 阻 断 事 件 的 直 方 图 ( 总 计 3 264个 事 件 )。B,38 bp 和 5 500 bp 双 链 DNA 转 运 事 件 驻 留 时 间 的 比 较 。C~D, 定 量 PCR 分 析 DNA 转 运 事 件 。C, 定 量 分 析 DNA 通过 脂 双 层 中 的 连 接 器 从 反 式 腔 室 转 运 到 顺 式 腔 室 ( 顶 部 ) 的 总 数 量 。 在 同 样 条 件 但 没 有 连 接 器 的 情 况 下 , 进 行 了 阴 性 对 照 ( 底部 ) 实 验 。 误 差 线 代 表 9 个 独 立 实 验 和 4 个 阴 性 对 照 实 验 的 平 均 值 的 标 准 偏 差 。D, 两 组 独 立 试 验 中 比 较 通 过 两 种 方 法 测 量 的DNA 转 运 拷 贝 数 : 定 量 PCR 和 从 记 录 电 流 踪 迹 中 阻 断 事 件 的 计 数 。 误 差 线 代 表 3 个 独 立 定 量 PCR 的 标 准 差 。 图 片 A 和 D 引 自 文献 [43], 图 片 B 和 C 引 自 文 献 [42]。图 6 定 量 分 析 DNA 的 转 运 时 间 及 数 目为 了 排 除 顺 式 腔 室 中 DNA 数 目 增 加 可 能 由 膜泄 漏 导 致 , 在 脂 双 层 或 隔 膜 泄 漏 的 情 形 下 , 进 行 了另 外 三 组 实 验 。 当 泄 漏 发 生 时 , 在 顺 式 腔 室 中 每 微升 溶 液 中 的 DNA 拷 贝 数 目 大 约 比 没 有 泄 漏 的 实 验高 10 4 ~10 5 倍 。4 phi29 分 子 马 达 通 道 的 单 向 DNA 转 运 机 制通 过 斜 坡 电 压 、 电 流 方 向 切 换 以 及 沉 降 力 实 验 ,证 实 了 该 连 接 器 通 道 对 于 双 链 DNA 显 示 单 向 转 运机 制 , 即 从 氮 端 ( 窄 端 ) 入 口 到 碳 端 ( 宽 端 ) 出 口 。这 是 第 一 个 针 对 DNA 转 运 展 现 整 流 行 为 的 野 生 型蛋 白 通 道 的 例 子 。 但 该 连 接 器 通 道 对 离 子 仍 展 现 双向 转 运 性 质 , 即 在 正 负 跨 膜 电 压 下 的 电 导 相 同 。4.1 对 单 一 通 道 施 加 斜 坡 电 压 展 示 的 双 链 DNA 的单 向 转 运如 前 所 述 , 连 接 器 通 道 通 过 脂 质 体 / 连 接 器 复合 物 与 平 面 磷 脂 膜 的 融 合 而 嵌 入 脂 双 层 。 因 此 , 连接 器 通 道 在 脂 双 层 中 的 方 向 是 随 机 的 , 即 碳 端 朝 向顺 式 腔 室 , 或 氮 端 朝 向 顺 式 腔 室 。对 包 含 单 个 连 接 器 的 脂 双 层 施 加 -100 mV 到+100 mV 斜 坡 电 压 (2.2 mV/s), 揭 示 了 双 链 DNA 的单 向 转 运 ( 图 7A~C)。 由 于 DNA 的 磷 酸 骨 架 带 负电 荷 , 所 以 DNA 倾 向 于 从 负 电 势 迁 移 到 正 电 势 。图 7A 展 示 了 未 加 DNA 的 对 照 实 验 。 双 链 DNA 在顺 式 和 反 式 两 个 腔 室 中 预 先 混 合 为 同 样 浓 度 , 并 根据 脂 双 层 内 连 接 器 的 取 向 施 加 负 电 压 ( 图 7B) 或 正

第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1123A~C, 在 从 -100 mV 到 +100 mV 的 斜 坡 电 压 (2.2 mV/s) 下 ,DNA 通 过 脂 双 层 中 单 个 连 接 器 通 道 转 运 的 单 向 交 通 性 质 。A, 没 有DNA;B~C, 在 单 一 连 接 器 的 两 侧 加 入 DNA。D~G, 通 过 转 换 电 流 极 性 , 验 证 DNA 通 过 脂 双 层 中 单 个 连 接 器 通 道 转 运 的 单向 交 通 性 质 。D, 任 何 腔 室 均 无 DNA 室 ;E~G, 嵌 入 单 个 连 接 器 , 两 个 腔 室 均 有 DNA。 图 片 引 自 文 献 [44]。图 7 通 过 斜 坡 电 压 及 电 压 极 性 切 换 验 证 双 链 DNA 单 向 转 运电 压 ( 图 7C) 以 观 察 DNA 转 运 。 同 样 的 现 象 在 不同 长 度 的 双 链 DNA(10 bp~5.5 kb) 以 及 单 链 DNA 上也 观 测 到 。4.2 对 含 有 单 一 通 道 的 脂 双 层 施 加 恒 定 电 压 并 切 换电 流 极 性 所 展 示 的 双 链 DNA 的 单 向 转 运恒 定 电 压 下 , 切 换 电 压 极 性 揭 示 了 连 接 器 通 道只 允 许 双 链 DNA 单 向 转 运 ( 图 7D~G)。DNA 以 相同 浓 度 预 先 混 合 于 两 个 腔 室 。DNA 转 运 发 生 的 极性 依 赖 于 脂 双 层 中 连 接 器 的 取 向 。 图 7D 展 示 了 未加 DNA 的 对 照 实 验 。 例 如 , 在 正 电 势 下 没 有 DNA转 运 发 生 时 , 切 换 到 负 电 势 时 即 导 致 双 链 DNA 转运 发 生 ( 图 7E)。 相 反 , 当 在 负 电 位 下 没 有 DNA 转运 时 , 切 换 到 正 电 位 即 导 致 双 链 DNA 转 运 发 生 ( 图7F)。 同 样 , 当 在 负 电 位 下 观 测 到 DNA 转 运 时 , 切

1124生 命 科 学第 23 卷换 到 正 电 位 即 导 致 双 链 DNA 转 运 停 止 ( 图 7G)。 同样 的 结 果 在 不 同 的 电 压 下 也 得 到 证 实 。4.3 多 通 道 条 件 下 定 量 分 析 DNA 转 运 频 率 所 检 测到 的 双 链 DNA 单 向 转 运由 于 双 链 DNA 只 从 一 个 方 向 穿 过 连 接 器 通 道 ,因 此 DNA 通 过 含 有 多 通 道 脂 双 层 的 转 运 率 会 受 到连 接 器 取 向 不 同 组 合 的 影 响 , 而 与 DNA 浓 度 无 关 。因 此 , 使 用 不 同 浓 度 的 双 链 DNA 在 -75 mV 恒 定 电位 下 进 行 了 实 验 ( 图 8)。 多 个 连 接 器 嵌 入 的 电 流 痕迹 反 映 了 DNA 转 运 事 件 频 率 的 变 化 ( 图 8 中 直 方图 展 示 )。 当 另 外 一 个 连 接 器 以 适 合 DNA 转 运 的 方向 嵌 入 时 ,DNA 转 运 频 率 便 会 增 加 ( 图 8A、C、D)。当 另 外 一 个 连 接 器 以 阻 碍 DNA 转 运 的 方 向 嵌 入 时 ,DNA 转 运 频 率 便 会 不 变 ( 图 8A、B)。4.4 使 用 靶 向 碳 端 — 多 聚 组 氨 酸 标 签 的 Ni-NTA 纳米 金 粒 子 来 检 测 连 接 器 的 取 向为 了 揭 示 连 接 器 在 脂 双 层 中 的 取 向 , 使 用 了 在连 接 器 宽 出 口 每 个 亚 基 碳 端 包 含 一 个 多 聚 组 氨 酸 标签 重 新 设 计 的 连 接 器 。 导 入 的 碳 端 多 聚 组 氨 酸 标 记并 不 影 响 连 接 器 通 道 的 折 叠 和 DNA 包 装 活 性 。 在不 对 称 离 子 条 件 下 , 进 行 了 电 导 实 验 ( 图 9) [49] 。 使用 1.8 nm 的 Ni-NTA 金 粒 子 来 结 合 碳 端 的 多 聚 组 氨酸 标 记 。 实 验 设 计 中 , 仅 在 腔 室 的 一 侧 将 纳 米 金 与溶 液 混 合 。 例 如 , 在 单 个 或 多 个 连 接 器 通 道 嵌 入 的条 件 下 , 如 果 纳 米 金 仅 在 反 式 腔 室 内 ( 图 9), 那 么其 仅 与 多 聚 组 氨 酸 标 记 的 碳 端 朝 向 反 式 腔 室 的 连 接器 结 合 ( 图 9C), 并 且 不 与 氮 端 朝 向 反 式 腔 室 的 连接 器 结 合 ( 图 9A)。 在 含 有 纳 米 金 的 条 件 下 , 在 一个 单 一 连 接 器 具 有 合 适 取 向 的 情 况 下 , 可 以 观 测 到该 连 接 器 电 导 的 逐 步 阻 塞 ( 图 9D)。 每 一 个 纳 米 金结 合 导 致 均 一 的 约 30% 的 电 流 阻 塞 ( 图 9D) ; 在 膜内 具 有 多 通 道 的 情 况 下 , 也 得 到 相 同 的 结 果 ( 数 据未 显 示 )。DNA 带 负 电 的 磷 酸 盐 骨 架 使 其 仅 从 负 电 势 转运 到 正 电 势 , 所 以 在 两 侧 腔 室 内 加 入 相 同 浓 度 的 双链 DNA, 以 协 助 检 测 DNA 转 运 方 向 的 评 估 。 根 据施 加 电 压 前 , 不 同 浓 度 的 DNA 预 先 混 合 在 两 个 腔 室 。 插 图 : 对 于 单 个 实 验 (A~D), 每 一 个 连 接 器 嵌 入 脂 双 层 后 ,DNA 转 运 速率 已 经 标 出 。 图 片 来 自 文 献 [44]。图 8 在 多 通 道 条 件 下 定 量 分 析 DNA 转 运 频 率 与 脂 双 层 中 连 接 器 取 向 的 关 系 , 验 证 双 链 DNA 单 向 转 运

第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1125A、C 和 E, 实 验 策 略 图 示 。 在 顺 式 、 反 式 腔 室 中 加 入 相 等 浓 度 的 双 链 DNA, 且 每 个 实 验 使 用 相 同 浓 度 的 Ni-NTA- 纳 米 金 ;B, 一 个 30 min 的 电 流 踪 迹 , 展 示 当 Ni-NTA- 纳 米 金 加 入 反 式 腔 室 时 , 双 链 DNA 转 运 未 受 阻 碍 ;D, 一 个 电 流 踪 迹 , 展 示 当Ni-NTA- 纳 米 金 加 入 反 式 腔 室 时 ,Ni-NTA- 纳 米 金 对 碳 端 多 聚 组 氨 酸 标 记 连 接 器 的 三 步 结 合 步 骤 ;F, 一 个 电 流 踪 迹 展 示 双 链DNA 的 转 运 , 以 及 当 Ni-NTA- 纳 米 金 加 入 顺 式 腔 室 时 ,DNA 转 运 受 到 阻 碍 。 在 所 有 这 些 实 验 中 , 使 用 -75 mV 的 跨 膜 电 压 。 图片 引 自 文 献 [44]。图 9 使 用 靶 向 碳 端 — 多 聚 组 氨 酸 标 签 的 Ni-NTA 纳 米 金 粒 子 来 检 测 连 接 器 的 取 向纳 米 金 的 置 放 位 置 ( 顺 式 腔 室 或 反 式 腔 室 )( 如 图9C、E 所 示 的 实 验 设 计 ), 可 以 在 跨 膜 恒 定 负 电 势条 件 下 确 定 膜 内 所 嵌 入 的 连 接 器 的 取 向 。 结 果 发 现 ,双 链 DNA 仅 从 较 窄 的 氮 端 转 运 到 较 宽 的 碳 端 。 例如 , 将 纳 米 金 放 置 在 反 式 腔 室 , 当 DNA 转 运 时 没有 观 测 到 纳 米 金 结 合 , 表 明 在 这 种 情 况 下 , 含 有 多聚 组 氨 酸 的 碳 端 向 上 朝 向 顺 式 腔 室 , 并 且 双 链DNA 从 负 电 势 的 反 式 腔 室 通 过 连 接 器 的 氮 端 向 上转 运 ( 图 9B)。 在 相 同 条 件 下 , 在 连 接 器 的 碳 端 向下 朝 向 反 式 腔 室 时 , 没 有 DNA 转 运 发 生 且 观 测 到纳 米 金 的 逐 步 结 合 ( 图 9D)。 在 另 一 个 场 景 中 , 当纳 米 金 加 入 到 上 面 的 顺 式 腔 室 时 ,DNA 起 初 转 运但 随 后 停 止 , 表 明 多 聚 组 氨 酸 标 记 的 碳 端 朝 向 顺 式腔 室 , 并 且 纳 米 金 与 其 结 合 , 阻 止 双 链 DNA 从 朝向 底 部 反 式 腔 室 的 氮 端 转 运 ( 图 9F)。5 phi29 分 子 马 达 通 道 的 门 控 现 象许 多 研 究 报 道 表 明 噬 菌 体 DNA 的 包 装 与 噬 菌体 病 毒 原 壳 体 的 形 变 密 切 相 关 [50-57] , 且 与 连 接 器 也有 紧 密 关 联 。phi29 DNA 包 装 马 达 的 单 向 交 通 已 得到 证 实 , 这 给 病 毒 感 染 阶 段 机 理 提 出 了 一 个 问 题 ,即 菌 体 病 毒 基 因 组 如 何 被 释 放 从 而 被 注 入 到 宿 主 细胞 。 有 研 究 人 员 假 设 在 DNA 包 装 后 连 接 器 蛋 白 会发 生 构 象 变 化[52] 。 本 课 题 组 通 过 单 通 道 测 量 发 现phi29 噬 菌 体 病 毒 的 连 接 器 蛋 白 确 实 会 发 生 门 控 现象[58] 。 这 些 门 控 可 由 高 电 压 ( 图 10A、B) 或 者 亲 和

1126生 命 科 学第 23 卷A, 碳 端 多 聚 组 氨 酸 标 记 的 连 接 器 , 在 高 电 压 下 逐 步 关 闭 。 该 通 道 在 -75 mV 下 嵌 入 脂 质 双 层 膜 保 持 稳 定 , 电 压 切 换 到 较 高 时(-150 mV), 会 立 即 引 发 通 道 逐 步 关 闭 。B, 连 接 器 通 道 闭 合 与 打 开 , 是 可 调 控 且 可 切 换 的 。 当 将 电 压 降 为 0 mV 一 段 时 间 后 ,在 高 电 压 下 关 闭 的 通 道 会 重 新 打 开 。C, 连 接 器 的 变 异 克 隆 的 设 计 依 据 。 连 接 器 单 体 碳 端 、 氮 端 以 及 中 部 标 注 了 晶 体 结 构 中未 观 测 到 的 柔 性 区 域 [41] 。 图 片 引 自 文 献 [58]。图 10 phi29 连 接 器 通 道 的 门 控 现 象结 合 诱 发 。 施 加 高 电 压 后 ( 高 于 150 mV), 观 测 到的 电 导 发 生 逐 步 减 小 的 现 象 , 变 化 为 均 等 的 三 步 ,每 步 变 化 的 尺 寸 约 为 通 道 大 小 的 31% ; 三 步 减 小 之后 留 有 约 6% 的 空 隙 ( 图 10A)。 同 时 phi29 连 接 器通 道 的 关 闭 在 低 电 压 下 会 重 新 打 开 ( 图 10B)。 在 高 —低 — 高 — 低 循 环 电 压 的 驱 使 下 , 连 接 器 通 道 可 多 次打 开 关 闭 , 起 到 了 类 似 于 纳 米 阀 门 的 作 用 。通 过 对 phi29 连 接 器 单 体 的 结 构 分 析 发 现 , 它具 有 碳 端 (aa 1~14)、 氮 端 (aa 287~309) 和 中 间 (aa229~246) 三 个 柔 性 区 域 ( 图 10C) [15-16] 。 通 过 对 这 些部 位 进 行 变 异 表 达 纯 化 后 得 到 的 蛋 白 用 同 样 的 实 验条 件 进 行 单 通 道 测 量 , 结 果 显 示 切 除 中 间 (aa 229~246)柔 性 区 域 的 变 异 发 生 门 控 的 几 率 大 为 降 低 , 因 此 推断 这 个 区 域 的 氨 基 酸 对 phi29 蛋 白 通 道 的 门 控 现 象有 关 键 作 用 。门 控 现 象 在 许 多 其 他 离 子 通 道 和 膜 蛋 白 中 很 常见 [59] , 在 细 胞 跨 膜 物 质 转 运 和 信 号 转 导 方 面 具 有 重要 的 生 理 意 义 。phi29 病 毒 蛋 白 通 道 门 控 现 象 的 发现 , 为 在 分 子 水 平 上 研 究 核 酸 转 运 和 病 毒 信 号 转 导方 面 提 供 了 新 的 证 据 和 手 段 。6 phi29 分 子 马 达 通 道 的 应 用 和 未 来 展 望连 接 器 巧 妙 和 复 杂 的 设 计 推 动 了 其 在 纳 米 技 术中 的 应 用 。 蛋 白 质 纳 米 孔 的 柔 软 性 质 、 折 叠 波 动 、动 态 结 构 以 及 信 号 的 可 重 复 性 影 响 了 其 应 用 。 本 课题 组 证 实 ,phi29 连 接 器 通 道 克 服 了 上 述 局 限 , 其通 道 在 多 种 实 验 条 件 下 稳 定 ; 其 电 导 均 一 , 在 所 施加 电 压 下 展 示 出 完 美 的 线 性 关 系 , 且 在 所 述 实 验 条件 下 不 显 示 电 压 门 控 性 质 。 双 链 DNA 通 道 的 阻 断事 件 几 乎 完 全 相 似 。 凭 借 其 通 道 尺 寸 及 独 特 性 质 ,phi29 连 接 器 非 常 适 合 在 自 然 环 境 外 对 其 进 行 工 程改 造 , 对 生 物 、 工 程 、 医 药 、 纳 米 技 术 等 领 域 有 巨大 的 潜 在 影 响 。6.1 用 于 研 究 病 毒 DNA 包 装 机 制 的 新 颖 系 统噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 的 系统 , 可 用 于 理 解 病 毒 DNA 包 装 中 的 DNA 穿 过 马 达通 道 转 运 的 机 理 。 嵌 入 脂 质 膜 连 接 器 系 统 的 单 向 交通 现 象 是 在 外 加 电 压 下 的 被 动 转 运 ,phi29 马 达 的 主动 转 运 是 否 也 有 单 向 交 通 的 机 制 值 得 研 究[44] 。在 双 链 DNA 包 装 过 程 中 , 加 入 非 水 解 ATP 的类 似 物 γ-S- 三 磷 酸 腺 苷 (ATP) 后 , 主 动 马 达 会 被 关

第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1127闭[60] 。 完 全 包 装 和 部 分 留 在 原 壳 体 内 的 双 链 DNA,在 高 梯 度 离 心 力 ( 例 如 ,149 000 g) 的 测 试 下 都 没有 退 出[60-61] 。 这 与 在 DNA 包 装 中 间 体 中 所 观 测到 的 双 链 DNA 停 留 在 通 道 内 并 不 弹 出 的 现 象 一致[19,21,60] 。 马 达 包 装 DNA 是 需 要 克 服 势 能 的 过 程 ,需 要 ATP 水 解 过 程 中 产 生 的 化 学 能 来 用 于 DNA 转运[19,62] 。 随 着 越 来 越 长 的 DNA 被 包 装 , 在 原 壳 体内 空 穴 的 体 积 越 来 越 小 , 病 毒 原 壳 体 内 的 压 力 逐 渐增 大[19,21,60,63] 。为 了 论 证 在 具 有 生 物 活 性 的 phi29 马 达 内 DNA包 装 通 道 的 单 向 交 通 性 质 , 并 排 除 pRNA、gp16 和/ 或 γ-S-ATP 的 贡 献 , 本 课 题 组 对 其 进 行 了 沉 降 检 测 。使 用 DNase I 和 / 或 核 糖 核 酸 酶 A (RNase A) 对 完 全包 装 的 DNA 和 DNA 包 装 中 间 体 分 别 单 独 和 联 合进 行 处 理 。DNase I 处 理 排 除 任 何 可 能 抑 制 双 链DNA 退 出 的 与 马 达 组 件 的 接 触 , 而 RNase A 消 化排 除 了 pRNA 及 gp16 接 触 并 托 住 DNA 的 可 能 。 由于 pRNA 起 了 马 达 与 gp16 之 间 的 桥 梁 作 用[20] ,RNaseA 消 化 会 消 除 pRNA 和 gp16 对 双 链 DNA 的 可 能 的力 的 作 用 支 点 。 当 分 别 或 一 起 使 用 DNase I 和RNase A 处 理 DNA 包 装 中 间 体 ( 部 分 双 链 DNA 在通 道 内 、 部 分 双 链 DNA 在 通 道 外 ) 时 , 部 分 包 装的 双 链 DNA 停 留 在 原 壳 体 内 , 且 在 最 高 力 梯 度 离心 下 并 不 滑 出 。 这 些 数 据 强 烈 支 持 这 样 的 结 论 : 在主 动 马 达 中 , 通 道 也 展 现 单 向 交 通 的 性 质 。模 型这 些 研 究 给 Guo 和 Lee 的 “ 推 动 ” 或 “ 阀 门 ”[9]提 供 了 直 接 证 据 。 在 此 模 型 中 , 连 接 器 保 持静 止 ;DNA 转 运 由 DNA 包 装 酶 或 末 端 酶 诱 导 , 该酶 推 动 一 定 长 度 的 DNA 进 入 原 壳 体 , 随 后 转 换 结合 到 DNA 远 端 , 推 动 另 外 一 端 DNA 进 入 。 该 模型 不 排 除 由 酶 推 动 的 插 槽 — 扳 手 的 旋 转 。 单 向 交通 的 性 质 使 得 D​NA 进 入 原 壳 体 后 并 不 退 出 , 类 似于 血 液 泵 入 心 脏 及 阀 门 控 制 血 流 的 作 用 。6.2 基 于 纳 米 孔 的 随 机 单 分 子 检 测基 于 纳 米 孔 的 随 机 单 分 子 检 测 是 一 个 新 兴 的 分析 技 术 , 可 在 单 分 子 水 平 测 量 分 析 物 。 当 一 个 被 测分 子 通 过 通 道 时 , 通 过 孔 的 粒 子 电 流 将 反 映 所 得 阻断 事 件 的 幅 度 、 持 续 时 间 和 速 率 。 通 过 统 计 分 析 ,可 以 得 到 分 子 浓 度 和 种 类 的 信 息 。phi29 连 接 器 的DNA 转 运 试 验 , 揭 示 了 其 纳 米 孔 分 析 的 潜 在 应 用 。与 其 他 一 些 已 知 的 通 道 ( 例 如 直 径 1.4 nm 仅 能通 过 单 链 DNA 的 α- 溶 血 素 通 道 ) 相 比 , 连 接 器 具有 较 大 的 直 径 ( 最 窄 处 ~3.6 nm)。 更 重 要 的 是 , 对于 发 展 基 于 连 接 器 的 靶 向 选 择 性 随 机 传 感 器 ,phi29连 接 器 较 大 的 通 道 可 以 在 通 道 内 结 合 的 共 价 键 配 体的 选 择 上 更 灵 活 。 由 于 其 晶 体 结 构 已 知 , 可 以 使 用系 统 性 、 基 于 工 程 的 方 法 来 开 发 具 有 增 强 分 析 能 力的 系 统 。有 许 多 细 菌 外 膜 孔 蛋 白 具 有 较 大 的 孔 隙 , 有 用作 随 机 传 感 器 的 潜 力 。 然 而 , 由 于 电 压 或 质 子 、 阴离 子 或 阳 离 子 等 溶 液 条 件 所 引 发 的 这 些 蛋 白 通 道 的门 控 , 可 能 会 在 单 通 道 记 录 中 产 生 干 扰 分 析 物 检 测的 瞬 变 电 流 阻 断 。 例 如 ,OmpG 孔 蛋 白 在 ± 40 mV下 会 有 自 发 门 控[64] 。 与 此 相 反 ,phi29 连 接 通 道在 -100 mV 至 +100 mV 电 压 范 围 内 , 乃 至 在 极 端pH 的 条 件 下 , 也 保 持 稳 定 的 通 道 特 性 。 因 此 ,phi29 连 接 通 道 将 成 为 生 物 孔 随 机 传 感 器 的 出 色 选择 。6.3 基 于 纳 米 孔 的 DNA 测 序纳 米 孔 的 DNA 测 序 应 用 有 很 大 前 途 , 可 用 于人 类 个 体 基 因 组 的 序 列 测 定 以 鉴 定 遗 传 疾 病 的 各 种病 因 借 以 设 计 治 疗 。 同 时 , 可 以 用 于 植 物 基 因 组 的鉴 定 以 作 品 种 改 良 , 也 可 促 进 细 菌 、 真 菌 的 改 造 ,而 且 比 传 统 方 法 更 快 , 成 本 更 低 。 此 外 , 这 是 一 个无 标 记 、 单 分 子 识 别 的 方 法 , 不 需 样 品 制 备 或 放 大 。迄 今 为 止 , 已 有 一 些 使 用 蛋 白 质 孔 或 固 态 纳 米 孔 进行 核 酸 分 析 的 探 索[23-26,28-31,65] 。 不 过 , 纳 米 孔 DNA测 序 技 术 的 一 个 瓶 颈 是 DNA 穿 过 孔 的 速 率 过 快 ,超 过 了 现 有 光 学 和 电 子 技 术 的 检 测 分 辨 率 , 影 响 单个 核 苷 酸 检 测 的 灵 敏 度 和 可 信 度 。 因 此 , 关 键 的 挑战 是 能 够 以 可 控 的 速 度 减 慢 DNA 通 过 孔 道 , 同 时保 持 精 确 区 分 碱 基 对 的 高 信 号 信 噪 比 。phi29 连 接器 较 大 的 通 道 给 修 饰 、 结 合 及 放 置 障 碍 物 以 获 得 更佳 检 测 信 号 提 供 了 空 间 。7 结 论在 此 , 经 改 造 的 phi29 连 接 器 被 嵌 入 到 脂 双 层中 , 形 成 了 高 导 电 纳 米 孔 。 此 外 , 连 接 器 是 非 常 容易 重 复 制 备 且 易 于 改 造 的 生 物 孔 , 使 其 可 理 想 的 用于 未 来 生 物 医 学 中 。phi29 连 接 器 孔 径 较 大 、 尺 寸均 一 且 性 质 稳 定 , 使 这 个 病 毒 组 件 可 能 成 为 新 一 代纳 米 材 料 或 纳 米 级 的 构 造 单 元 。致 谢 : 感 谢 萧 枫 博 士 、 蔡 颖 博 士 、 方 华 明 和 张 乐 构建 重 组 连 接 器 蛋 白 , 景 鹏 博 士 和 Farzin Haque 博 士进 行 脂 双 层 电 导 实 验 , 以 及 舒 丹 博 士 进 行 体 外 包 装检 测 。 同 时 中 国 国 家 纳 米 科 学 中 心 梁 兴 杰 研 究 员 、清 华 大 学 李 景 虹 教 授 和 中 国 科 学 院 高 能 物 理 研 究 所

1128生 命 科 学第 23 卷吴 海 臣 研 究 员 对 本 文 提 出 了 仔 细 的 修 改 意 见 和 建议 , 在 此 一 并 致 以 衷 心 的 感 谢 。 感 谢 郭 教 授 与 他 人合 作 创 立 的 Kylin Therapeutics 公 司 、Viapore 公 司 及广 州 生 物 马 达 和 核 酸 纳 米 公 司 的 支 持 。[ 参 考 文 献 ][1] Black LW. DNA packaging in dsDNA bacteriophages.Annu Rev Microbiol, 1989, 43: 267-92[2] Guo P. Introduction: principles, perspectives, and potentialapplications in viral assembly. Semin Virol, 1994, 5(1):1-3[3] Zhang W, Imperiale MJ. Interaction of the adenovirusIVa2 protein with viral packaging sequences. J Virol,2000, 74(6): 2687-93[4] Moss B. Replication of poxviruses[M]// Fields BN.Virology. New York: Raven Press, 1985: 685-703[5] Scheffczik H, Savva CG, Holzenburg A, et al. Theterminase subunits pUL56 and pUL89 of humancytomegalovirus are DNA- metabolizing proteins withtoroidal structure. Nucleic Acids Res, 2002, 30(7): 1695-703[6] Salmon B, Baines JD. 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第 11 期 耿 佳 , 等 : 噬 菌 体 phi29 DNA 包 装 马 达 磷 脂 膜 嵌 合 体 在 单 分 子 检 测 及 纳 米 医 学 领 域 的 应 用1129[35] Mobasheri H, Lea EJ. Biophysics of gating phenomena involtage-dependent OmpC mutant porin channels (R74Cand R37C) of Escherichia coli outer membranes. EurBiophys J, 2002, 31: 389-99[36] Carneiro CM, Merzlyak PG, Yuldasheva LN, et al.Probing the volume changes during voltage gating ofPorin 31BM channel with nonelectrolyte polymers.Biochim Biophys Acta, 2003, 1612: 144-53[37] Smeets RM, Keyser UF, Krapf D, et al. Salt dependenceof ion transport and DNA translocation through solid-statenanopores. Nano Lett, 2006, 6(1): 89-95[38] Wang H, Branton D. Nanopores with a spark for singlemoleculedetection. Nat Biotechnol, 2001, 19(7): 622-3[39] Iqbal SM, Akin D, Bashir R. Solid-state nanoporechannels with DNA selectivity. Nat Nano, 2007, 2: 243-8[40] Cai Y, Xiao F, Guo P. 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