Jül-4192

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Suche nach neuen Wirkstoffen für ... - JuSER

Forschungszentrum Jülich

in der Helmholtz-Gemeinschaft

Institut für Biologische Informationsverarbeitung 1

Suche nach neuen Wirkstoffen für

Hyperpolarisationsaktivierte und zyklisch

Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle

Timo Strünker

Jül-4192


Berichte des Forschungszentrums Jülich 4192


Suche nach neuen Wirkstoffen für

Hyperpolarisationsaktivierte und zyklisch

Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle

Timo Strünker


Berichte des Forschungszentrums Jülich ; 4192

ISSN 0944-2952

Institut für Biologische Informationsverarbeitung 1 Jül-4192

D 38 (Diss., Köln, Univ., 2005)

Zu beziehen durch: Forschungszentrum Jülich GmbH · Zentralbibliothek

D-52425 Jülich · Bundesrepublik Deutschland

02461 61-5220 · Telefax: 02461 61-6103 · e-mail: zb-publikation@fz-juelich.de


Zusammenfassung

Rhythmische Aktivität einzelner Zellen oder zellulärer Netzwerke findet man bei nahezu allen

Organismen. Aktivitätsrhythmen steuern die Atmung, die Hormonausschüttung, den Schlaf-

Wach-Zyklus und den Herzschlag. Die endogene rhythmische Aktivität von Herzzellen und

vieler Neurone entsteht durch ein komplexes Zusammenspiel von verschiedenen

Ionenkänalen. Sogenannte „Schrittmacher“-Kanäle spielen eine wichtige Rolle bei der

Kontrolle rhythmischer elektrischer Erregung, da sie die Frequenz bestimmen. Vor einiger

Zeit wurden die Gene, die für die „Schrittmacher“-Kanäle kodieren, identifiziert. Da

Hyperpolarisation und zyklische Nukleotide (cyclic nucleotides) die Aktivität dieser

Ionenkanäle entscheidend beeinflussen, werden sie auch als HCN-Kanäle bezeichnet. Sowohl

aus wissenschaftlicher als auch aus medizinischer Sicht sind spezifische Wirkstoffe für HCN-

Kanäle sehr interessant. Bisher sind nur wenige Substanzen bekannt, die die Aktivität von

HCN-Kanälen beeinflussen. In dieser Arbeit wurde für HCN1- und HCN4-Kanäle ein

Hochdurchsatz-Testverfahren (HTS-Assay) im Mikrotiterplattenformat entwickelt. Mit

diesem Testverfahren wurden bekannte Wirkstoffe für HCN-Kanäle charakterisiert. Weiterhin

wurden Gifte von Schnecken, Spinnen, Skorpionen und Schlangen auf HCN-spezifische

Wirkstoffe untersucht. In diesem Wirkstoffscreening wurden einige Gifte identifiziert, die

möglicherweise auf HCN-Kanäle wirken.


Abstract

Rhythmic activity of single cells or cellular networks is a common feature of most organisms.

Cellular rhythms govern the beating of the heart, cycles of sleep and wakefulness, breathing,

and the release of hormones. The endogenous rhythmic activity of many neurons and cardiac

relies on a complex interplay between several distinct ion channels. In particular, one type of

ion channel plays a prominent role in the control of rhythmic electrical activity because it

determines the frequency of the oscillations. The activity of the channels is thus setting the

"pace" of the activity; therefore, these channels are often referred to as "pacemaker" channels.

Despite their obvious physiological importance it hasn´t been until a few years ago that the

genes encoding pacemaker channels have been identified. Because both hyperpolarization and

cyclic nucleotides are key elements that control their activity, pacemaker channels have now

been designated hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated (HCN) channels.

From a scientific as well as medical point of view, HCN channels are interesting drug targets.

Only a few substances are known that specifically affect HCN channels. In the present study,

a microtiter plate-based high throughput screening assay for HCN1 and HCN4 channels was

developed. With this assay, known drugs for HCN channels were characterized.

Subsequently, venoms of snails, spiders, scorpions, and snakes were screened for toxins

affecting HCN channel activity. A few venoms were identified that possibly contain drugs

that act on HCN channels.


I

I Inhaltsverzeichnis

I INHALTSVERZEICHNIS

I

II ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

IV

1. EINLEITUNG 1

1.1 IONENKANÄLE 1

1.2 HYPERPOLARISATIONSAKTIVIERTE UND ZYKLISCH NUKLEOTID-GESTEUERTE

IONENKANÄLE 2

1.2.1 I H -STRÖME IN KARDIALEN SCHRITTMACHERZELLEN 3

1.2.2 I H -STRÖME UND RHYTHMISCHE AKTIVITÄT IN NEURONEN 4

1.3 DIE MOLEKULAREN EIGENSCHAFTEN VON I H -KANÄLEN 6

1.3.1 EIGENSCHAFTEN VON HCN-KANÄLEN 6

1.3.2 PHARMAKOLOGIE VON HCN-KANÄLEN 9

1.4 PHARMAKOLOGISCHES POTENZIAL VON TIERGIFTEN 10

1.4.1 DAS GIFT DER KEGELSCHNECKEN 10

1.4.2 SPINNENGIFTE 11

1.4.3 SKORPIONGIFTE 12

1.4.4 SCHLANGENGIFTE 13

1.5 ZIELSETZUNG MEINER ARBEIT 14

2.MATERIAL UND METHODEN 15

2.1 LÖSUNGEN UND MEDIEN 15

2.1.1 LÖSUNGEN FÜR DIE ZELLKULTUR 15

2.1.2 LÖSUNGEN FÜR DIE ELEKTROPHYSIOLOGIE 16

2.1.3 LÖSUNGEN FÜR MESSUNGEN IN MULTIWELLPLATTEN 16

2.1.4 LÖSUNGEN FÜR DIE RP-HPLC 16

2.2 SPANNUNGSSENSITIVE FLUORESZENZFARBSTOFFE 17


II

2.3 HETEROLOGE GENEXPRESSION IN HEK 293-FLPIN ZELLEN 18

2.3.1 KULTURBEDINGUNGEN DER ZELLLINIEN 19

2.3.2 STABILE TRANSFEKTION VON HEK 293-FLPIN ZELLEN 20

2.4 FLUORESZENZOPTISCHE MESSUNGEN IN MULTIWELLPLATTEN 22

2.4.3 AUSPLATTIEREN VON HEK 293-FLPIN ZELLEN AUF MULTIWELLPLATTEN 23

2.5 MESSUNG DER FLUORESZENZLEBENSDAUER 24

2.5.1 MESSSTAND ZUR DETEKTION DER FLUORESZENZLEBENSZEIT 26

2.5.2 VORBEREITUNG DER ZELLEN 27

2.6 ELEKTROPHYSIOLOGIE UND FLUORIMETRIE 27

2.6.1 DETEKTION VON FLUORESZENZ MIT EINEM PHOTONENZÄHLER 27

2.6.2 KOMBINIERTE PATCH-CLAMP- UND FLUORIMETRIEEXPERIMENTE 28

2.6.3 VORBEREITUNG DER ZELLEN 29

2.7 HIGH-PERFORMANCE-LIQUID-CHROMATOGRAPHY (HPLC) 30

2.7.1 UMKEHRPHASEN (REVERSED PHASE)- HPLC 31

2.7.2 AUFBAU DER RP-HPLC-ANLAGE 31

2.8 SDS-POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 32

2.9 TIERGIFTE 33

2.9.1 KEGELSCHNECKENGIFTE 33

2.9.2 SCHLANGENGIFTE 34

2.9.3 SPINNEN- UND SKORPIONGIFTE DER FIRMA SPIDERPHARM 34

2.10 GLEICHUNGEN 36

3. ERGEBNISSE 37

3.1 ENTWICKLUNG EINES FLUORESZENZBASIERTEN HTS-ASSAYS 37

3.1.1 EIGENSCHAFTEN SPANNUNGSABHÄNGIGER FLUORESZENZFARBSTOFFE 38

3.1.2 CHARAKTERISIERUNG DES MEMBRANEKITS 40

3.1.3 FLUORESZENZLEBENSDAUER SPANNUNGSSENSITIVER FARBSTOFFE 41

3.1.4 CHARAKTERISIERUNG DER ZELLLINIEN 45

3.1.4.1 Untersuchungen zum Membranpotenzial der Zellen 45

3.1.4.2 Untersuchungen mit bekannten HCN-Kanalblockern 49

3.1.4.3 Untersuchungen der Wirkung von Colforsin 68

3.1.4.4 Zusammenfassung 72

3.1.5 BESTIMMUNG DES Z-FAKTORS 73


III

3.2 WIRKSTOFFSCREENING MIT TIERGIFTEN 76

3.2.1 PRAKTISCHE DURCHFÜHRUNG UND ANALYSE DER DATEN 77

3.2.2 KEGELSCHNECKENGIFTE 81

3.2.3 GIFTE VON SPINNEN UND SKORPIONEN 83

3.2.4 SCHLANGENGIFTE 87

3.2.4.1 Gift der Puffotter Bitis arietans 88

3.2.4.2 Gift der Wiesenotter Vipera ursinii 90

3.2.4.3 Gift der Königskobra (Ophiophagus hannah) 92

3.2.4.4 Gift der „Ägyptischen Kobra“ (Naja haje) 94

3.2.4.5 Gift der Kobra Naja siamensis 95

4. DISKUSSION 100

4.1 ENTWICKLUNG EINES HTS-ASSAYS 100

4.2 WIRTSCHAFTLICHKEIT DES HTS-ASSAYS 103

4.3 CHARAKTERISIERUNG VON HCN-KANAL BLOCKERN 105

4.4 ZELLBASIERTE ASSAYS FÜR G-PROTEIN GEKOPPELTE REZEPTOREN 107

4.5 SUCHE NACH SPEZIFISCHEN WIRKSTOFFEN IN TIERGIFTEN 109

5. LITERATURVERZEICHNIS 112

6. ANHANG 119


IV

II Abkürzungsverzeichnis


Durchmesser

A/D

Analog/Digital

Abb.

Abbildung

ATP

Adenosintriphosphat

ca.

circa

cAMP

3´,5´-zyklisches Adenosinmonophosphat

cDNA

revers transkribierte DNA (complementary DNA)

cGMP

3´,5´-zyklisches Guanosinmonophosphat

cNMP

zyklisches Nukleosid-Monophosphat

DNA

Desoxyribonukleinsäure

EC50

apparente Konzentration mit halbmaximaler

Wirkung

EDTA

Ethylendiamintetraacetat

EGTA

Ethylenglykoldiamintetraacetat

ES

extrazelluläre Lösung (extracellular solution)

eV

Elektronen-Volt

FlpIn- 293-Zellen human embryonal kidney cells, Zelllinie 293

HEPES

N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazin-N´-

(2-Ethansulfonsäure)

IS

intrazelluläre Lösung (intracellular Solution)

K D

NA

ND-Filter

o.g.

Dissoziationskonstante

Numerische-Apertur

neutral-density-filter (Graufilter)

oben genannt

pH negativer dekadischer Logarithmus der H + -

Konzentration

R

elektrischer Widerstand

s.o.

siehe oben

SR

sampling rate

Tab.

Tabelle

V m

wt

Membranpotenzial

Wildtyp


V

C-Terminus

N-Terminus

Carboxy-Terminus

Amino-Terminus

Es wurden die üblichen Abkürzungen des „Systeme International“ und dessen Vorsätze zur

Bezeichnung von Dezimalen und Teilen verwendet.


Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Ionenkanäle

Ionenkanäle sind für die Funktion von Nerven- und Muskelzellen sowie der meisten anderen

somatischen Zellen essentiell. Sie ermöglichen Ionen die hydrophobe Lipiddoppelschicht der

Zellmembran zu passieren, was entscheidend für die Entstehung und Weiterleitung

elektrischer Signale in lebenden Zellen ist (HILLE, 2001).

Voraussetzung für transmembranalen Ionenfluss ist ein elektrochemisches Potenzial über

der Zellmembran. Dieses sogenannte „Membranpotenzial“ ist ein Diffusionspotenzial und

kommt durch die Ungleichverteilung verschiedener Ionensorten – v.a. Kalium (K + ), Natrium

(Na + ), Chlorid (Cl - ) und organischer Anionen – beiderseits der Zellmembran zu Stande. Zwei

Arten integraler Membranproteine bestimmen das Membranpotenzial: „Pumpen“, die Ionen

unter Energieverbrauch entgegen ihres elektrochemischen Gradienten transportieren und

"Ionenkanäle", die Ionen entlang des elektrochemischen Gradienten die Membran überqueren

lassen. Das Membranpotenzial einer Nervenzelle in Ruhe liegt zwischen -40 und -90 mV. Die

elektrische Erregung der Nervenzelle entsteht meist durch einen Einstrom von Na + -Ionen in

das Zellinnere. Dadurch wird die Membran depolarisiert.

Ionenkanäle können anhand ihres Aktivierungsmechanismus unterschieden werden.

Ligandenabhängige Ionenkanäle werden durch die direkte Bindung intra- oder extrazellulärer

Liganden kontrolliert. Spannungsabhängige Ionenkanäle reagieren auf Änderungen des

Membranpotenzials (HILLE, 2001). Bei vielen spannungsabhängigen Ionenkanälen bewirkt

eine Depolarisation des Membranpotenzials die Öffnung der Kanalpore. Eine weitere

Möglichkeit Ionenkanäle zu klassifizieren, ist ihre Ionenselektivität. Einige Ionenkanäle sind

nur für eine ganz bestimmte Ionensorte durchlässig, z.B. für Natrium- (Na + ), Kalium- (K + )

oder für Kalzium-Ionen (Ca 2+ ). Andere Kanäle wiederum können nicht, oder nur schlecht,

zwischen verschiedenen Ionensorten unterscheiden (HILLE, 2001). Sie werden als nichtselektive

Ionenkanäle bezeichnet. Hierzu gehören die ligandengesteuerten Acetylcholin- und

Glutamatrezeptoren, die TRP (transient-receptor-potential)-Kanäle, die zyklisch Nukleotidgesteuerten

Ionenkanäle (cyclic nucleotide-gated channels, CNG-Kanäle) (Übersicht: KAUPP

& SEIFERT, 2002) und die hyperpolarisationsaktivierten und zyklisch Nukleotid-gesteuerten

Ionenkanäle (HCN-Kanäle) (Übersicht: KAUPP & SEIFERT, 2001).


Einleitung 2

1.2 Hyperpolarisationsaktivierte und zyklisch Nukleotidgesteuerte

Ionenkanäle

Ionenströme über die Zellmembran, die durch Hyperpolarisation aktiviert und durch

zyklische Nukleotide reguliert werden, wurden erstmals vor ca. dreißig Jahren in Neuronen

des Hippocampus und in Myozyten des Herzens beschrieben. Dieser durch Hyperpolarisation

der Membran aktivierte Einwärtsstrom wurde als I h (h steht für „hyperpolarisationactivated“),

I f (funny) oder I q (queer) bezeichnet. Er depolarisiert die Zellmembran und

fördert so die Entstehung von Aktionspotenzialen. I h Ströme wurden später in vielen

unterschiedlichen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen entdeckt. In einigen Zellen, wie

z.B. in Zellen des Sinusknotens oder Neuronen des Thalamus, führt das Zusammenspiel von

I h und anderen Ionenkanälen zu spontaner rhythmischer Aktivität (ROBINSON & SIEGELBAUM,

2003). In diesen Zellen ist die Frequenz der Aktionspotenziale abhängig von I h . Deshalb

werden die Ionenkanäle, die dem I h -Strom zugrunde liegen, auch als „Schrittmacher“-Kanäle

bezeichnet. Die für I h verantwortlichen „Schrittmacher“-Kanäle haben einige ungewöhnliche

Eigenschaften (KAUPP & SEIFERT, 2001):

- Im Gegensatz zu den meisten anderen spannungsaktivierten Ionenkanälen werden sie nicht

durch Depolarisation sondern durch Hyperpolarisation der Membran aktiviert.

- Sie werden durch cAMP und cGMP direkt moduliert.

- Sie sind sowohl für Na + - als auch für K + -Ionen permeabel. Unter physiologischen

Bedingungen leiten die Kanäle einen depolarisierenden Na + -Einwärtsstrom

- Die relative Permeabilität P Na /P K hängt von der extrazellulären K + -Konzentration ab und

liegt zwischen 0,2 und 0,4.

- Geringe Konzentrationen von extrazellulärem Cs + blockieren den Strom durch diese

Kanäle.

- Extrazelluläres Cl - moduliert die Permeation der Kationen.


Einleitung 3

1.2.1 I h -Ströme in kardialen Schrittmacherzellen

Die kleinen, wenig kontraktilen Zellen des

Sinusknoten

Sinusknotens (Abb.1.1), dem primären

2

Schrittmacherzentrum des Vertebratenherzens, erzeugen

3

spontan Aktionspotenziale. Die elektrische Erregung

breitet sich über das Reizleitungssystem des Herzens

(AV-Knoten, His´sche Bündel, Purkinjefasern) auf dem

Abb.1.1:Schematische Darstellung

gesamten Herzen aus (Abb1.1) und führt zur des Vertebratenherzens. (1) AV-

Knoten, (2) His´sche Bündel, (3)

Kontraktion des Herzmuskels. Die rhythmische Purkinjefasern. Sinusknoten rot

Aktivität der Sinusknotenmyozyten beruht auf einem unterlegt und umrandet.

(www.sinnesphysiologie.de)

Zusammenspiel mehrerer Ionenkanäle (Abb.1.2).

Der „Aufstrich“ des Aktionspotenzials wird durch Ca 2+ verursacht: Spannungsabhängige

Ca 2+ -Kanäle vom T- und L-Typ öffnen, Ca 2+ -Ionen strömen in die Zelle und depolarisieren

die Zellmembran. Daraufhin aktivieren, mit zeitlicher Verzögerung, K + -Kanäle und die Zelle

repolarisiert. Am Ende des Aktionspotenzials ist das Membranpotenzial der Zelle nahezu

gleich dem K + -Gleichgewichtspotenzial (ca. -80 mV). Bei dieser Spannung werden die

Schrittmacher-Kanäle aktiviert, die einen langsam depolarisierenden I h -Strom leiten. Der I h -

Strom depolarisiert die Zelle soweit, bis die Schwelle für ein neues Aktionspotenzial erreicht

ist (Überblick, DIFRANCESCO, 1993). Diese Schrittmacher-Depolarisation bestimmt die Zeit

zwischen den Aktionspotenzialen (Abb. 1.2). Ob der I h -Strom allein für die sogenannte

„spontane diastolische Depolarisation" verantwortlich ist, wird zur Zeit noch kontrovers

diskutiert.

1

Membranspannung (mV)

0

-50

-70

2+

Ca -Einstrom

I-Strom

h

"Schrittmacher

Depolarisation"

+

K-Ausstrom

nach Stimulation

mit Adrenalin

0 1

2

Zeit (s)

Abb.1.2: Zeitverlauf des Membranpotenzials einer Sinusknoten-Zelle, vor und nach (rot)

Stimulation mit Adrenalin.


Einleitung 4

Wahrscheinlich sind auch noch andere Ionenkanäle daran beteiligt. Unzweifelhaft ist die

entscheidende Rolle von I h bei der Regulation der Herzschlagfrequenz. Der positiv

chronotrope Effekt bei Stimulation der β-Rezeptoren am Herzen wird durch Modulation der

Schrittmacher-Kanäle vermittelt. Die Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration

durch die adrenerge Stimulation verschiebt die Aktivierungskurve der Schrittmacher-Kanäle

zu positiveren Membranpotenzialen. Das führt dazu, dass die Schrittmacher-Kanäle früher

öffnen. Die Zelle erreicht dadurch schneller die Schwelle für ein neues Aktionspotenzial

(Abb.1.2). Die Frequenz der Aktionspotenziale nimmt zu und das Herz schlägt schneller

(GAUSS & SEIFERT, 2000; KAUPP & SEIFERT 2001). Neben dieser entscheidenden

physiologischen Funktion werden aber auch einige pathologische Prozesse mit den

Schrittmacher-Kanälen in Verbindung gebracht. Dazu gehören Sinustachykardien und andere

Formen von Herzrhythmusstörungen sowie Herzversagen (STIEBER ET AL., 2004; OPTHOF,

1998; CERBAI ET AL., 2001; LUDWIG ET AL., 2003; BORLAK & THUM, 2003; UEDA ET AL.,

2003).

1.2.2 I h -Ströme und rhythmische Aktivität in Neuronen

Ein gut untersuchtes Beispiel für die

APs

Funktion von Schrittmacher-Kanälen im

Gehirn ist die Generierung schneller

I h -Strom

Abfolgen (bursts) von

Aktionspotenzialen in Relay-Neuronen

des Thalamus (BAL & MCCORMICK, Abb. 1.3: Rhythmogenese schneller Abfolgen von

Aktionspotenzialen (APs) in einem thalamischen

1996). Der Thalamus ist die wichtigste Relay-Neuron.

Durchgangsstation für sensorische Information von der Körper-Peripherie zum cerebralen

Cortex. Im Thalamus wird unter anderem der Schlaf-Wach-Rhythmus gesteuert. Im

Wachzustand feuern die Neurone mit hoher Frequenz Aktionspotenziale (Abb. 1.3). Auch

hier wird die „Schrittmacher-Depolarisation“ von den I h -Kanälen vermittelt. Im Schlaf wird

dieses Aktivitätsmuster allerdings von langsamen, synchronisierten Rhythmen abgelöst. Die

physiologische Bedeutung dieser unterschiedlichen Oszillationsmuster ist unklar

(MCCORMICK & BAL, 1997).


Einleitung 5

Neben seiner Schrittmacherfunktion ist I h an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen

beteiligt. So wird z.B. die Hyperpolarisation von Photorezeptoren nach starken Lichtreizen

von I h begrenzt (z.B. ATTWELL & WILSON, 1980). I h -Kanäle bestimmen unter anderem,

gemeinsam mit K + -Kanälen, das Ruhemembranpotenzial und die Membranleitfähigkeit in

peripheren und zentralen Neuronen (PAPE, 1996; ROBINSON & SIEGELBAUM, 2003). I h

beeinflusst so das integrative Verhalten dieser Neuronen und deren Antwort auf synaptische

Eingänge (z.B.: PAPE, 1996). Neben seinen verschiedenen Funktionen auf zellulärem Niveau

spielt I h damit auch eine wichtige Rolle in neuronalen Netzwerken.

Fehlregulation der Schrittmacherkanäle oder Defekte in den Genen, die für I h -Kanäle

kodieren, können zur Entstehung von Epilepsien beitragen (STRAUSS ET AL, 2004; KITAYAMA

ET AL., 2003; LUDWIG ET AL., 2003; CHEN ET AL., 2001). I h -Ströme scheinen auch an der

Entstehung neuropathischer Schmerzen beteiligt zu sein (CHAPLAN ET AL., 2003).


Einleitung 6

1.3 Die molekularen Eigenschaften von I h -Kanälen

Obwohl I h -Ströme bereits seit mehr als dreißig Jahren bekannt sind, konnten die Gene der

Schrittmacher-Kanäle erst vor ca. sieben Jahren identifiziert werden (SANTORO ET AL., 1998;

GAUSS ET AL., 1998; LUDWIG ET AL., 1998; SEIFERT ET AL., 1999). Aus Säugern wurden vier

HCN-Subtypen kloniert, die mit HCN1-HCN4 bezeichnet werden (SANTORO ET AL., 1998;

SANTORO ET AL., 1998; LUDWIG ET AL., 1998; SEIFERT ET AL. 1999).

1.3.1 Eigenschaften von HCN-Kanälen

Abb. 1.4: Topologie der HCN-Kanäle. Der obere Teil der Abbildung zeigt die Topologie einer HCN-

Kanaluntereinheit. Mit S1-S6 sind die transmembranalen Segmente bezeichnet. Im Spannungsfühler

(S4) sind die basischen Aminosäuren mit (+) markiert. Die Bindestelle für zyklische Nukleotide

(„cNMP-Bindestelle“) befindet sich im C-Terminus. Im unteren Teil der Abbildung ist die tetramere

Struktur des Kanals dargestellt. Der Pfeil zeigt die Richtung des Na + -Ionenflusses an.

Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der HCN-Kanalgene sind sowohl den

spannungsabhängigen K + -Kanälen vom „Shaker“-Typ (JAN & JAN, 1997) als auch den CNG-

Ionenkanälen ähnlich (KAUPP & SEIFERT, 2002).

HCN-Kanaluntereinheiten haben wahrscheinlich eine ähnliche Membrantopologie wie CNGbzw.

K + -Kanäle. Sie bestehen aus sechs transmembranalen Segmenten (S1-S6), einem

Porenabschnitt zwischen S5 und S6, einem zytosolischen N- und C-Terminus sowie einer

Bindestelle für zyklische Nukleotide (cNMP-Bindestelle) im C-terminalen Bereich

(Übersicht: KAUPP & SEIFERT, 2001). Native HCN-Kanäle bestehen vermutlich aus vier

Untereinheiten, die sich zu homooligomeren oder auch heterooligomeren Komplexen


Einleitung 7

zusammenlagern. Ein Modell der transmembranalen Topologie einer HCN-Kanaluntereinheit

zeigt Abbildung 1.4. Zwischen den vier verschiedenen HCN-Kanalgenen aus Säugetieren

besteht eine hohe Sequenzähnlichkeit. Am stärksten konserviert sind die sechs

transmembranalen Segmente und die cNMP-Bindestelle. In diesem Bereich sind 80 bis 90 %

der Aminosäuren identisch oder konserviert (Übersicht: KAUPP & SEIFERT, 2001).

Die vier HCN-Kanal-Isoformen wurden in heterologen Expressionssystemen untersucht.

Alle Eigenschaften, die native I h -Ströme auszeichnen, finden sich bei HCN-Kanälen wieder:

• HCN-Kanäle werden durch Hyperpolarisation aktiviert.

• Sie werden durch cAMP und cGMP direkt moduliert.

• Sie leiten einen depolarisierenden Na + - und K + -Strom. Die Permeabilität von Na + -

gegenüber K + -Ionen (P Na /P K ) ist abhängig von der Konzentration extrazellulärer K + -

Ionen und beträgt 0,2 bis 0,4.

• Geringe Konzentrationen von extrazellulärem Cs + blockieren den Strom durch HCN-

Kanäle

• Extrazelluläres Cl - moduliert die Permeation.

normalisierte P o

Abb. 1.5: Modulation der HCN4-Kanalaktivität durch cAMP. Aufgetragen ist die normalisierte

Offenwahrscheinlichkeit der Kanäle (P o ), in Abhängigkeit der Membranspannung (V m ). Die

Aktivierungskurve wurde in Abwesenheit (○) und in Anwesenheit von cAMP (5 µM; ●) in der

Pipettenlösung gemessen.

Die Mitglieder der HCN-Kanalfamilie unterscheiden sich in der Aktivierungskinetik, in der

halbmaximalen Aktivierungsspannung (V 1/2 ) und in dem Ausmaß der cAMP-Modulation. Am

schnellsten öffnen HCN1-Kanäle. Die Zeitkonstante der Aktivierung liegt bei HCN1

zwischen 100 bis 300 ms bei Membranspannungen von -130 bis -100 mV. HCN2 aktiviert im

Vergleich dazu etwas langsamer mit Zeitkonstanten zwischen 200 und 500 ms (bei -140 bis


Einleitung 8

100 mV). Am langsamsten ist die Aktivierungskinetik bei HCN4-Kanälen. Die

Zeitkonstanten für die Aktivierung für HCN4 liegen bei einigen hundert Millisekunden (bei -

150 mV), bis hin zu mehr als 30 s (bei -70 mV). HCN1-Kanäle sind bei

Membranspannungen von etwa -70 mV halbmaximal aktiviert. Für HCN2- und HCN4-

Kanäle (Abb. 1.5) liegt V 1/2 mit -75 bzw. -78 mV etwas negativer. Der Effekt von cAMP auf

HCN1 ist relativ klein. Durch die Anwesenheit von cAMP verschiebt sich das V 1/2 von

HCN1-Kanälen um weniger als 5 mV zu positiveren Potenzialen. Bei HCN2-Kanälen

können Änderungen im V 1/2 von +12-14 mV beobachtet werden. Am größten ist das Ausmaß

der cAMP-Modulation bei HCN4-Kanälen. Für HCN4 wurde eine Verschiebung der

Aktivierungskurve um bis zu +20 mV beobachtet (Abb.1.5) (Übersicht: KAUPP & SEIFERT,

2002).

Alle vier Isoformen werden im Gehirn exprimiert (SEIFERT ET AL., 1999; MOOSMANG ET

AL., 2001). Das Expressionssmuster und die Expressionsstärke der HCN-Gene sind jedoch

sehr unterschiedlich (SANTORO ET AL., 2000). Transkripte des HCN1-Gens wurden vor allem

im Hippocampus und in Purkinje-Fasern des Cerebellums gefunden. HCN2 wird vor allem im

Neocortex, Hippocampus und Thalamus exprimiert (SANTORO ET AL., 1997, 1998, 2000;

MOOSMANG ET AL., 1999; MONTEGGIA ET AL., 2000). HCN3 wird in vielen Bereichen des

Gehirns exprimiert, jedoch nur schwach. HCN4 wird, im Gegensatz zu den anderen

Isoformen, nur in subcorticalen Bereichen des Gehirns exprimiert. Eine starke Expression

findet man im olfaktorischen Bulbus, der Habenula und im Thalamus (LUDWIG ET AL., 1998;

SANTORO ET AL., 1998; SEIFERT ET AL., 1999; SHI ET AL., 1999).

Außerhalb des Gehirns wird HCN1 im Sinusknoten des Herzens (SHI ET AL., 1999) gering

exprimiert. HCN2 wird im Herzen sowohl im Vorhof als auch in der Herzkammer exprimiert

(LUDWIG ET AL., 1999). HCN3 scheint im Herzen nicht exprimiert zu werden. Von allen

Isoformen wird HCN4 im Herzen am stärksten exprimiert. Die mRNA wurde vor allem im

Sinusknoten, aber auch in Purkinje Fasern nachgewiesen (LUDWIG ET AL., 1998, 1999).

Transgene Mäuse, bei denen das HCN4-Gen deletiert wurde oder die Expression des

HCN4-Gens herzspezifisch verhindert wurde, sind nicht lebensfähig. Die Tiere sterben bereits

zwischen Embryonal-Tag 9.5 und 11.5 (STIEBER ET AL, 2003). Das Herz der Embryonen

bildet keinen normalen Herzschlag aus. Man kann nur rudimentäre Schrittmacherpotenziale

beobachten. Zudem wird diese rudimentäre Herzaktivität nicht durch cAMP stimuliert (vgl.

Abb.1.2). Diese Ergebnisse unterstreichen die entscheidende Rolle des HCN4-Kanals bei der

Entstehung und Modulation des Herzschlags.


Einleitung 9

Eine Deletion des Gens für HCN2 führt bei Mäusen unter anderem zu

Herzrhythmusstörungen und Epilepsie. LUDWIG ET AL. (2003) konnten Hinweise dafür finden,

dass ein verändertes Ruhemembranpotenzial neuronaler und kardialer Zellen die Ursache

dafür ist (LUDWIG ET AL, 2003).

HCN1 defiziente Mäuse zeigen ebenfalls einen Phänotyp. Die vollständige oder Vorderhirnspezifische

Deletion von HCN1 reduziert das Lernvermögen der Tiere (NOLAN ET AL, 2003).

Die Autoren postulieren, dass HCN1-Kanäle das Lernen und die Gedächtnisbildung

beeinflussen, indem sie die dendritische Integration bestimmer Neuronen regulieren.

1.3.2 Pharmakologie von HCN-Kanälen

Auf Grund ihrer wichtigen Funktion bei der Entstehung rhythmischer Aktivität und ihrer

Beteiligung an pathologischen Prozessen, stellen HCN-Kanäle äußerst attraktive Ziele für

pharmakologische Wirkstoffe dar. Es sind bis heute allerdings nur wenige Substanzen

bekannt, die spezifisch HCN-Kanäle beeinflussen. Cs + , Ba 2+ und Capsazepin – ein Blocker

für TRPV-Kanäle - blockieren HCN-Kanäle von der extrazellulären Seite (z.B. GILL ET AL

2004). Diese Substanzen wirken jedoch nicht nur an HCN-Kanälen, sondern auch an anderen

Ionenkanälen. Alle anderen bekannten HCN-Kanal-Blocker wirken intrazellulär. Dazu

gehören die vom Ca 2+ -Kanalblocker Verapamil abgeleiteten, sog. „spezifischen bradykarden

Agenzien“. Neben Falipamil und Zatebradin sind dies DK-AH-268, DK-AH-269, UL-AH-99,

AQ-AH-208 und S16257 (PAPE 1994; KOBINGER & LILLIE 1987; REIFFEN ET AL. 1990). Auch

die wohl spezifischsten und bekanntesten HCN-Kanal-Blocker ZD7288 und Ivabradine

gehören zu dieser Wirkstoffgruppe (BOSMITH ET AL. 1993, BUCCHI ET AL., 2002). Einige

dieser Substanzen galten als vielversprechende Kandidaten für die Behandlung von

Tachykardien und anderen Herzrhythmusstörungen. Allerdings wurden bei fast allen

Wirkstoffen z.T erhebliche zentralnervöse Nebenwirkungen festgestellt.

Bis heute ist Ivabradine der einzige HCN-spezifische Wirkstoff, der in weiterführenden

klinischen Studien für die Therapie von Herzerkrankungen, wie z.B. Sinustachykardien und

kardialen Ischämien, untersucht wird (BORER ET AL., 2003). Sowohl aus wissenschaftlicher als

auch aus medizinischer Sicht ist es deshalb sehr interessant, neue, hochspezifische Wirkstoffe

zu finden, die HCN-Kanäle beeinflussen.


Einleitung 10

1.4 Pharmakologisches Potenzial von Tiergiften

Gegenstand intensiver Suche nach neuen spezifischen Wirkstoffen vielerlei Art stellen seit

Jahren Gifte von Schnecken, Spinnen, Schlangen und Skorpionen dar (Übersicht: LEWIS &

GARCIA 2003). Warum sind Tiergifte so interessant für die biomedizinische Forschung? Die

Gifte dieser Tiere enthalten einen „Cocktail“ vieler verschiedener Substanzen. Neben

organischen Verbindungen, Enzymen und anderen größeren Proteinen, bestehen die Gifte vor

allem aus einem komplexen Gemisch von Peptiden. Die einzelnen Inhaltstoffe (Toxine) eines

Giftes sind gegen viele unterschiedliche Zielproteine im Beutetier gerichtet. Von einigen

„Peptidtoxinen“ ist bekannt, dass sie eine hochspezifische Wirkung auf verschiedene Typen

von Ionenkanälen haben. Es scheint so, als wären sie dafür „entwickelt“ worden, selektiv nur

eine Art von Ionenkanal zu beeinflussen. Einige der Toxine, die in Tiergiften entdeckt

wurden, finden schon medizinische Anwendung (LEWIS & GARCIA 2003).

1.4.1 Das Gift der Kegelschnecken

Schlundrohr

Kegelschnecken sind räuberisch lebende

Meeresbewohner (Abb.1.6). Ihre Beutetiere sind

Würmer oder andere Schnecken. Etwa 70

Kegelschnecken-Arten haben sich auf die Jagd

von Fischen spezialisiert. Sie erlegen die

Abb. 1.6: Kegelschnecke der Gattung

Beutetiere durch die Injektion eines Conus textile. Das Schlundrohr ist mit einem

Pfeil markiert. Aus diesem Schlundrohr

hochwirksamen Giftcocktails. In einem können Giftpfeile in die Beute geschossen

werden. (www.sinnesphysiologie.de)

sackförmigen Anhang des Schlundes sind

pfeilförmige Radulazähnchen gespeichert, die in den Schlund transportiert, mit Gift geladen

und aus dem Schlundrohr in die Beute geschossen werden. Innerhalb von Sekunden erstarrt

das Opfer in einem tetanischen Schock, der sich in der zweiten Phase der Vergiftung in eine

vollständige Paralyse umkehrt. Ausgelöst wird dieser Verlauf durch spezifische Toxin-

Wirkungen an Ionenkanälen der neuromuskulären Synapsen. Die Toxine der Kegelschnecken,

die "Conotoxine", sind kleine Peptide von nur 10 bis 30 Aminosäuren (Abb.1.7). Sie werden

anhand des jeweiligen Zielproteins im Beutetier klassifiziert:

α-Conotoxine wirken z.B. an nicotinischen Acetylcholinrezeptoren, µ-Conotoxine an

muskulären Na + Kanälen, ω-Conotoxine an neuronalen Ca 2+ Kanälen, δ-Conotoxine an

neuronalen Na + -Kanälen, κ-Conotoxine an neuronalen K + -Kanälen und Conantokine an

NMDA-Rezeptoren. Ein spezifisches Muster von Disulfidbrücken (Abb.1.7) ist das


Einleitung 11

charakteristische Strukturmerkmal jeder Conotoxin-Familie (Überblick z.B. OLIVERA &

CRUZAB, 2001). Jede der etwa 500 Kegelschneckenarten hat einen art-typischen Satz von 50-

200 individuellen Toxinen. Es gibt also vermutlich einige zehntausend unterschiedliche

Conotoxine.

Abb.1.7: Strukturmodell eines ω-Conotoxins aus dem Gift von Conus geographus. Die

Aminosäurereste sind mit Ein-Buchstaben-Symbolen angegeben (Symbol O: Hydroxyprolin).

Disulfidbrücken zwischen zwei Cysteinresten (Symbol C) sind durch schwarze Balken dargestellt.

1.4.2 Spinnengifte

Abb.1.8 Argiotoxin, ein Polyamin aus dem Gift der Spinne Argiope lobata. Es blockiert ionotrope

postsynaptische Glutamatrezeptoren.

Bis heute sind ca. 40.000 verschiedene Spinnenarten bekannt, die in 109 Familien geordnet

werden können. Alle Spinnen – mit Ausnahme einer Familie – besitzen einen Giftapparat und

produzieren Toxine, um ihre Opfer zu paralysieren und zu töten. Im Gegensatz zu den oft

tödlich verlaufenden Unfällen mit Kegelschnecken, sind die wenigsten Spinnengifte für den

Menschen gefährlich. Auch Spinnengifte sind komplexe Substanzgemische. Neben

Inhaltsstoffen wie Enzymen (z.T. mit Toxin-Wirkung), anorganischen Ionen, Salzen, Säuren,

Glucose, Aminosäuren, biogenen Aminen und Neurotransmittern, können die Toxine in


Einleitung 12

Spinnengiften in zwei große Gruppen unterteilt werden: a) Acylpolyamine und b)

Peptidtoxine (Übersicht: CORZO & ESCOUBAS, 2003; RASH & HODGSON, 2002).

Acylpolyamine sind kleine organische Moleküle, die sehr spezifisch Aminosäurerezeptoren,

wie z.B. ionotrope Glutamatrezeptoren blockieren (Abb.1.8.). Es sind auch Acylpolyamine

bekannt, die spannungsabhängige Ca 2+ -Kanäle oder Acetylcholinrezeptoren blockieren. Die

zwischen 20 - 120 Aminosäuren langen Peptidtoxine der Spinnen können nochmals unterteilt

werden. Eine Gruppe stellen Toxine dar, die ähnlich wie die Conotoxine spezifisch auf

Ionenkanäle wirken. Obwohl sie meist größer sind als die Conotoxine findet sich auch hier

ein spezifisches Muster von Disulfidbrücken. Die Nomenklatur dieser Toxine ist angelehnt an

die Nomenklatur der Conotoxine (ω-Agatoxin blockiert Ca 2+ -Kanäle usw.). Eine andere

Gruppe von Peptidtoxinen beeinflusst die Ausschüttung von Neurotransmittern. Einige dieser

Polypeptidtoxine lagern sich in präsynaptische Membranen ein, formen dort Ionenkanäle, die

Ca 2+ einströmen lassen und führen so zur Transmitterfreisetzung in den synaptischen Spalt.

Diese Toxine besitzen keine Disulfidbrücken.

Neben den bisher bekannten Spinnenarten (40.000) sind vermutlich etwa 100.0000 Arten

noch unentdeckt. Da jedes Spinnengift ca. 50 verschiedene Toxine enthält, könnten insgesamt

ca. 4 Millionen Spinnengift-Peptidtoxine existieren (SOLLOD ET AL. 2005) - eine Vielfalt, die

im Tierreich ohne Beispiel ist. Die Tatsache, dass nur ein verschwindend kleiner Bruchteil der

Spinnentoxine bisher charakterisiert wurde, verdeutlicht, welch großes pharmakologisches

Potenzial in Spinnengiften steckt.

1.4.3 Skorpiongifte

Skorpione sind räuberische Allesfresser. Wie Kegelschnecken und Spinnen verwenden auch

Skorpione einen Giftcocktail, um ihr Opfer zu paralysieren und zu töten. Auch in

Skorpiongiften stellen, neben Neurotransmittern, Salzen usw., Disulfid-stabilisierte

Peptidtoxine die Hauptkomponente dar. Die Peptidtoxine von Skorpionen sind in der Regel

größer als die von Kegelschnecken oder Spinnen. Die sogenannten langkettigen (long-chain-)

Toxine bestehen aus 60-76 Aminosäureresten. Sie werden durch vier Disulfidbrücken

stabilisiert. Diese Toxine wirken auf spannungsabhängige Na + -Kanäle. Sie werden in α- und

β-Toxine unterteilt. Die sogennanten kurzkettigen (short-chain-) Toxine bestehen aus 29-41

Aminosäuren und besitzen 3-4 Disulfidbrücken. Sie wirken in erster Linie auf K + - und Cl - -

Kanäle. Daneben finden sich in Skorpiongiften auch Toxine, die auf Ca 2+ -Kanäle oder z.B.

Ryanodin-Rezeptoren wirken (Übersicht: SOLLOD ET AL, 2005; RICARDO ET AL, 2004;

POSSANI ET AL, 2000).


Einleitung 13

Weltweit gibt es etwa 1500 Skorpionarten, wovon ca. 25 Arten für den Menschen gefährlich

sind. Jedes Skorpiongift enthält einen Cocktail von ca. 70 Peptiden. Bei 1.500 Arten ergibt

das ca. 100.000 verschiedene Skorpion-Toxine. Bisher sind ≈ 200 Toxine und ihre

Zielproteine identifiziert.

1.4.4 Schlangengifte

Von den 3.200 Schlangenarten zählen ca. 1.300 zu den Giftschlangen. Man unterscheidet

dabei 3 Familien: Elapidae (Kobras und Mambas); Hydrophiidae (Seeschlangen) und

Viperidae (Vipern und Grubenottern). Die meisten sind für den Menschen gefährlich.

Schlangengifte enthalten eine Fülle pharmakologisch aktiver Substanzen. Im Allgemeinen

stellen Substanzen wie Amine, Kohlenhydrate, Nukleoside, Lipide und Metall-Ionen die

weniger gefährlichen Bestandteile des Giftes dar. 90 % des Trockengewichts des

Schlangengifts machen Peptide und Proteine aus. Mehr als zwanzig verschiedene Enzyme

wurden in Schlangengiften entdeckt. Sie sind zwischen 13 und 150 kDa groß. Viele dieser

Enzyme sind Hydrolasen, wie z.B. Proteinasen, Phosphodiesterasen und Phospholipasen. Die

Aktivität dieser Enzyme führt zu einer „Vorverdauung“ des Beutetiers. Phospholipasen

beispielsweise lysieren Zellen, indem sie deren Membranlipide spalten. Hyaluronidasen

zerstören Zell-Zell-Kontakte und erleichtern so das tiefe Eindringen des Giftes in das Gewebe

(Übersicht z.B.: YEE, 2004; LYANIWURA, 1991).

Die nicht-enzymatisch wirkenden Peptidtoxine in Schlangengiften können in Neurotoxine,

Cardiotoxine, Cytotoxine, Calzisepetine, Acetylcholinesterase-Inhibitoren, Proteinase-

Inhibitoren, Dendrotoxine und Myotoxine unterteilt werden. α- und κ-Neurotoxine blockieren

muskuläre bzw. neuronale Acetylcholinrezeptoren. Cardiotoxine und Cytotoxine lagern sich

in Membranen ein. Es wird vermutet, dass sie dort Poren formen und so Zellen zerstören.

Calciseptine blockieren Ca 2+ -Kanäle, während Dendrotoxine K + -Kanäle blockieren

(Übersicht: YEE ET AL. 2004, KINI 2002; HARVEY 2001). Insgesamt finden sich ca. 100

verschiedene Enzyme und Peptidtoxine in dem Gift einer Schlange. Trotz intensiver

Forschung ist erst ein kleiner Teil der Toxine bekannt. Auch in Schlangengiften liegt ein

immenser pharmakologischer Schatz verborgen, der für wissenschaftliche und medizinische

Anwendungen genutzt werden kann.


Einleitung 14

1.5 Zielsetzung meiner Arbeit

HCN-Kanäle sind unter anderem an der Erzeugung rhythmischer Aktivität im Herzen und im

Gehirn beteiligt. Sie stellen attraktive Ziele für pharmakologische Wirkstoffe dar. Bisher sind

allerdings nur wenige Substanzen bekannt, die die Aktivität von HCN-Kanälen beeinflussen.

Sowohl aus wissenschaftlicher als auch medizinischer Sicht ist es von großem Interesse, neue,

hochspezifische Wirkstoffe zu finden, die HCN-Kanäle beeinflussen.

Das Ziel dieser Doktorarbeit bestand darin, Wirkstoffe zu finden, die spezifisch HCN-

Kanäle beeinflussen. Es sollte vor allem in Giften von Schnecken, Spinnen, Schlangen und

Skorpionen nach HCN-spezifischen Wirkstoffen gesucht werden.

Eine wesentliche Aufgabe bestand darin, ein Hochdurchsatz-Testverfahren im

Mikrotiterplattenformat zu entwickeln. Dazu sollte mit Hilfe von spannungssensitiven

Fluoreszenzfarbstoffen das Membranpotenzial von Zellen, die HCN-Kanäle heterolog

exprimieren, beobachtet werden. Ziel war es, ein Zellsystem zu etablieren, in dem die

Änderung der HCN-Kanalaktivität - hervorgerufen durch Zugabe eines Wirkstoffs - eine

Änderung des Membranpotenzials dieser Zellen zur Folge hat. Bereits bekannte Wirkstoffe

sollten so untersucht und charakterisiert werden. Anschließend sollten mit diesem Verfahren

in den Tiergiften neue Wirkstoffe, die spezifisch auf HCN-Kanäle wirken, identifiziert

werden.


Material und Methoden 15

2.Material und Methoden

2.1 Lösungen und Medien

Die verwendeten Chemikalien wurden in p.A.-Qualität von den Firmen Amersham

Bioscience, Invitrogen, Merck und Sigma-Aldrich bezogen. Chemikalien und Fertiglösungen

für die Zellkultur wurden von der Firma Invitrogen bezogen. Soweit erforderlich wurden alle

Lösungen durch Autoklavieren (20-30 min, 121°C) sterilisiert. Für die Zellkultur wurden die

Lösungen sterilfiltriert. Als Lösungsmittel diente in allen Fällen bidestilliertes H 2 O.

2.1.1 Lösungen für die Zellkultur

DH10

Trypsin/EDTA*

10% (v/v) fötales Kälberserum* 0,05% (w/v) Trypsin

1% (v/v) Antibiotika/Antimykotika* 0,02% (w/v) EDTA

in Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM;

1x Flüssigmedium )* mit 2mM L-Glutamin

PBS

PLL-Lösung

137 mM NaCl 0,1 mg Poly-L-Lysin/ml H 2 O

10 mM Na 2 HPO 4

2,6 mM KCl

1,9 mM KH 2 PO 4

pH 7,2

2 x BBS * Diese Lösungen wurden von Invitrogen bezogen

50 mM BBS

280 mM NaCl

pH 6,95


Material und Methoden 16

2.1.2 Lösungen für die Elektrophysiologie

Extrazelluläre Lösung (ES)

Pipettenlösung (IS)

120 mM NaCl 100 mM KCl

5 mM KCl 5 mM NaCl

2 mM MgCl 2 1 mM MgCl 2

2 mM CaCl 2 10 mM EGTA

10 mM HEPES 10 mM HEPES

10 mM Glucose pH 7,2 (KOH)

pH 7,4 (NaOH)

2.1.3 Lösungen für Messungen in Multiwellplatten

Extrazelluläre Lösung (ES)

ES1K + -Lösung

120 mM NaCl 120 mM NaCl

5 mM KCl 1 mM KCl

2 mM MgCl 2 2 mM MgCl 2

2 mM CaCl 2 2 mM CaCl 2

10 mM HEPES 10 mM HEPES

10 mM Glucose 10 mM Glucose

pH 7,4 (NaOH)

pH 7,4 (NaOH)

2.1.4 Lösungen für die RP-HPLC

Lösungsmittel A

H 2 O + 0,1% TFA (v/v)

Lösungsmittel B

Acetonitril + 0,1% TFA (v/v)


Material und Methoden 17

2.2 Spannungssensitive Fluoreszenzfarbstoffe

Spannungssensitive Fluoreszenzfarbstoffe lassen

sich in zwei Klassen unterteilen: „langsame“ und

„schnelle“ Farbstoffe. Zu den „langsamen“

spannungssensitiven Farbstoffen gehören z.B.

Abb.2.1 Strukturformel des positiv geladene Farbstoffe auf Cyanin- oder

spannungssensitiven Farbstoffs bis-(1,3-

diethylthiobarbituric acid)trimethine oxonol Rhodaminbasis, oder auch anionische Oxonol-

(DiSBAC 2 (3)). Dieser anionische Oxonol-

Farbstoff gehört zur Gruppe der „langsamen“ Farbstoffe (Abb. 2.1). In der Zelle und in der

Farbstoffe

Zellmembran zeigen diese Farbstoffe eine

intensive Fluoreszenz, während sie in der wässrigen extrazellulären Phase nur sehr schwach

fluoreszieren. Eine Änderung der Membranspannung (V m ) führt bei diesen sogenannten

Nernst-Farbstoffen zu einer Umverteilung von Farbstoffmolekülen zwischen extrazellulärer

Phase, der Zellmembran und dem Zellinneren (Überblick: PLASEK & SIGLER 1996). Dadurch

lässt sich eine spannungsabhängige Änderung der Fluoreszenzintensität der Zelle beobachten.

Da der Umverteilungsprozess relativ langsam ist, betragen die Zeitkonstanten für die

Änderungen der Fluoreszenzintensität, je nach Farbstoff, ca. 1-20 Sekunden. Die absolute

Änderung der Fluoreszenzintensität beträgt bei dieser Farbstoff-Gruppe ca. 1-2% pro 1 mV

Änderung des Membranpotenzials.

Zur Klasse der „schnellen“ spannungssensitiven Farbstoffe zählen z.B. Styryl-Farbstoffe

und auch einige Oxonole. Diese amphiphatischen Moleküle fluoreszieren praktisch nicht in

wässriger Lösung. Sie lagern sich jedoch in die Membran von Zellen ein und zeigen dort eine

starke Fluoreszenz. Eine Änderung von V m führt bei den sog. elektrochromen Farbstoffen

(z.B. Styryl-Farbstoffe) zu einer Änderung der Elektronenverteilung im Farbstoffmolekül

(sog. stark shift). Dadurch verschiebt sich das Fluoreszenzspektrum der Farbstoffe. Andere

„schnelle“ Farbstoffe (z.B. Oxonole) verändern spannungsabhängig ihre Position in der

Membran, was ebenfalls zu einer

Änderung der spektralen Eigenschaften

führt. Die Zeitkonstanten für diese

Prozesse betragen weniger als eine

Abb. 2.2 Strukturformel des spannungssensitiven

Farbstoffs di-8-ANEPPS. (1- (3-sulfonatopropyl)-4- Millisekunde. Die spannungsabhängige

[beta [2-(di-n-octylamino)-6-naphtyl]vinyl] pyridinium

betaine). Dieser Styryl-Farbstoff gehört zur Gruppe der Verschiebung des Spektrums ist sehr

„schnellen“ Farbstoffe

gering. Deshalb kann selbst bei optimaler


Material und Methoden 18

Filterwahl meist nur eine geringe (ca. 0,1% pro 1 mV) Änderungen der Fluoreszenzintensität

detektiert werden (Überblick: EBNER & CHEN, 1995).

In meiner Arbeit habe ich verschiedene Farbstoffe verwendet (Tab. 2.1). Das „Membrane

Potential Kit“, DiSBAC 2 (3), DiBAC 4 (3), DiOC 2 (3); DiOC 3 (3) und Merocyanin 540 gehören

zur Klasse der „langsamen“ Farbstoffe, während di-8-ANEPPS, RH-421 und RH-237

schnelle Farbstoffe sind.

Tab. 2.1: Übersicht der verwendeten Farbstoffe

Farbstoff Stocklösung Lösungsmittel Hersteller

Membrane

Nach

Potential Kit Herstellerangaben

ES

MolecularDevices

DiSBAC 2 (3) 5 mM Ethanol Molecular Probes

DiBAC 4 (3) 4 mM DMSO Sigma

DiOC 2 (3) 2 mM DMSO Sigma

DisC 3 (3) 2 mM DMSO Sigma

DisC 3 (5) 2 mM DMSO Sigma

Merocyanin 540 2 mM DMSO Sigma

di-8-ANEPPS 2 mM DMSO + 5% Pluronic Molecular Probes

RH-421 2 mM DMSO Molecular Probes

RH-237 2 mM DMSO Molecular Probes

2.3 Heterologe Genexpression in HEK 293-FlpIn Zellen

In meiner Arbeit habe ich mit HEK (human embryonic kidney) 293-FlpIn Zellen (Invitrogen)

gearbeitet. Diese Zellen haben Erkennungssequenzen für die Flp-Rekombinase (Flp-Site) und

ein Zeocin-Resistenzgen stabil in ihr Genom integriert. Kotransfektion der Zellen mit einem

Plasmid, das für die Flp-Rekombinase kodiert und pcDNA5-FRT (Invitrogen) Vektoren, in

die das gewünschte Gen integriert ist, ermöglichen die stabile Insertion dieses Gens in die

Flp-Site der Wirtszelle. Bei dieser Vorgehensweise wird das Fremdgen an einer definierten

Stelle in das Genom der Wirtszelle integriert. Das Zeocin-Resistenzgen wird dabei inaktiviert

und durch ein Hygromycin-Resistenzgen, das sich auf dem Plasmidvektor befindet,

substituiert. Zellen, die das gewünschte Gen in die Flp-Site integriert haben, sind resistent

gegen Hygromycin, jedoch sensitiv für Zeocin. Die Zellen können durch Zugabe beider


Material und Methoden 19

Antibiotoka selektiert werden. Neben der Integration von Fremdgenen in die Flp-Site, können

ein oder mehrere Fremdgene auch auf „konventionelle“ Weise (siehe 2.3.2) stabil in das

Genom integriert werden.

In meiner Arbeit habe ich folgende einfach- und doppelstabile HEK 293-Flp-In Linien

verwendet:

- HCN1: in die Flp-Site wurde das Gen des humanen HCN1-Kanals integriert.

- HCN4: in die Flp-Site wurde das Gen des humanen HCN4-Kanals integriert.

- HCN1/EAG: in die Flp-Site wurde das Gen des humanen HCN1-Kanals integriert.

Zusätzlich wurden die Zellen konventionell mit dem Gen des EAG1 (ether-a-go-go)-

Kanals aus Rind (bovine) stabil transfiziert.

- HCN4/EAG: in die Flp-Site wurde das Gen des humanen HCN4-Kanals integriert.

Zusätzlich wurden die Zellen konventionell stabil mit dem Gen des bEAG1-Kanal

transfiziert.

- EAG: die Zellen wurden konventionell mit dem Gen des bEAG1-Kanal stabil transfiziert.

die Flp-Site ist noch intakt.

- IRK: die Zellen wurden konventionell mit dem Gen des humanen K ir 2.1 (inward rectifier)-

Kanals stabil transfiziert.

- Wildtyp: Wildtyp 293-Flp-In Zellen

Die HCN4-, HCN1-, HCN1/EAG- und HCN4/EAG-Linien wurden mir freundlicher Weise

von Dr. R. Seifert (IBI-1, Forschungszentrum Jülich) zur Verfügung gestellt. Die Linien EAG

und IRK habe ich hergestellt (2.3.2).

2.3.1 Kulturbedingungen der Zelllinien

Alle Zelllinien wurden in dem Nährmedium DH10 bei 37°C, 5 % CO 2 und ~ 95 %

Luftfeuchtigkeit in Petrischalen (∅ 9 cm) kultiviert. Das DH10-Medium wurde dreimal

wöchentlich gewechselt. Die Generationszeit der Zellen betrug etwa 20 Stunden. Bei einer

Dichte von ~1 x 10 7 Zellen/∅ 9 cm Schale (entpricht ~90 % Konfluenz) wurden die Zellen

abgelöst und auf neue Schalen verteilt. Dazu wurden die Zellen zunächst mit 5 ml PBS

gewaschen, mit 1 ml Trypsin/EDTA bei 37°C für einige Minuten inkubiert und in 9 ml DH10

resuspendiert. Für die Zellerhaltung wurden ca. 2,5 x 10 5 Zellen auf ∅ 9 cm Schalen mit

frischem DH10-Medium ausgesät.


Material und Methoden 20

Für eine Langzeitlagerung wurden Zellen geerntet, die sich in der logarithmischen

Wachstumsphase (60-70 % Konfluenz) befinden. Circa 2 x 10 6 Zellen in 900 µl DH10

Medium ohne Antibiotikum wurden mit 100 µl DMSO gemischt und über flüssigem

Stickstoff eingefroren. Die Langzeitlagerung erfolgte in flüssigem Stickstoff. Bei Bedarf

wurden Zellen aus diesem Vorrat neu aufgetaut. Dazu wurden sie bei 37°C im Wasserbad

schnell aufgetaut und vorsichtig zu 10 ml DH10-Medium (ohne Antibiotika) pipettiert. Nach

24 Stunden wurde das Medium gewechselt und die entsprechenden Antibiotika (s.u.)

zugegeben. Nach 3-4 Passagen wurden die Zellen für Messungen verwendet.

Bei einer stabilen Transfektion erwerben die Zellen neben dem gewünschten Gen meist

auch eine Antibiotikaresistenz zur Selektion (2.3.2). Diese wird ebenfalls von dem

verwendeten Vektor kodiert. Die stabilen Zelllinien, die verwendet wurden, besitzen

unterschiedliche Resistenzen. Um einen ständigen Selektionsdruck aufrecht zu erhalten,

wurde das DH10-Medium für die Zellerhaltung mit den entsprechenden Antibiotika versetzt:

- HCN4 und HCN1; DH10 + 100 µg/ml Hygromycin (Invitrogen)

- HCN1/EAG und HCN4/EAG; DH10 + 100 µg/ml Hygromycin + 800 µg/ml G418

(Invitrogen)

- EAG und IRK; DH10 + 800 µg/ml G418 (2.3.2)

- Wildtyp; DH10 + 100 µg/ml Zeocin (Invitriogen)

2.3.2 Stabile Transfektion von HEK 293-FlpIn Zellen

Die Zellen wurden nach der Kalziumphosphat-Methode (CHEN & OKAYAMA, 1987)

transfiziert. Ein Transfektionsansatz für eine ∅ 5 cm Schale ist in Tabelle 2.2 aufgeführt. Für

die Transfektion wurden jeweils ca. 4 x 10 5 Zellen auf einer ∅ 5 cm Schalen mit dem Vektor

pcDNA3.1-beag1 bzw. pcDNA3.1-hKir2.1 transfiziert. Der Vektor vermittelt – nach

Integration in das Wirtsgenom – eine Resistenz gegen G418.

Tab. 2.2: Zusammensetzung eines Transfektionsansatzes

∅∅ 5 cm Schale

pcDNA3.1-X

10 µg in 124 µl H2O

CaCl 2 (1M) 41 µl

2 x BBS (pH 6,95) (1) 165 µl


Material und Methoden 21

Die Transfektionsansätze wurden 20 min (bei Raumtemperatur) inkubiert und anschließend

zum Medium gegeben. Die DNA wurde durch eine 20-22 stündige Inkubation bei 37°C, 5 %

CO 2 und ~ 95 % Luftfeuchtigkeit präzipitiert. Danach wurden die Zellen mit PBS gewaschen

und mit Trypsin/EDTA abgelöst. Die Zellen wurden auf fünf ∅ 9 cm Schalen mit ca. 5 x 10 4

Zellen pro Schale verteilt und bei 37°C, 5 % CO 2 und ~ 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert.

Nach 24 h wurde das Medium gegen DH10-Medium mit G418 (1 mg/ml) ausgetauscht.

Nach weiteren 24 h wurde die G418-Konzentration für 24 h auf 1,2 mg/ml erhöht. Danach

wurde das Medium alle 2-3 Tage gegen frisches DH10-Medium mit Antibiotikum (1 mg/ml,

G418) ausgetauscht. Nach ca. 3 Wochen konnten resistente Klone mikroskopisch identifiziert

werden. Zur Isolierung der Klone wurden „Klonierungsringe“ verwendet. Hierzu wurde der

obere Teil von 10 µl Eppendorf-Spitzen abgeschnitten und in Ethanol desinfiziert. Die Ringe

wurden mit sterilem Schlifffett versehen und um die einzelnen Zellklone platziert. Die Zellen

wurden 5 min mit 40 µl Trypsin/EDTA inkubiert und anschließend in die Vertiefungen

(Wells) von 24er Multiwell-Schalen überführt In die Wells wurden zuvor 500 µl DH10

(1 mg/ml G418) vorgelegt. Nachdem die Zellklone in den Wells eine Konfluenz von ca. 80 %

erreicht hatten, wurden die Zellen abgelöst und auf neue Multiwellschalen verteilt. Die

einzelnen Zellklone wurden elektrophysiologisch untersucht. Jeweils drei positive Klone

wurden ausgewählt und zur Langzeitlagerung eingefroren.


Material und Methoden 22

2.4 Fluoreszenzoptische Messungen in Multiwellplatten

Fluoreszenzoptische Messungen in Multiwellplatten wurden mit der FlexStationII 384 der

Firma MolecularDevices durchgeführt. Dieses System ermöglicht die zeitaufgelöste Messung

der Fluoreszenzintensität in den Vertiefungen (Wells) von 96er bzw. 384er Multiwellplatten.

Die Messung kann dabei in einem einzelnen Well oder in bis zu 384 Wells gleichzeitig

erfolgen (KinetikMode). Die Platte wird dafür Well für Well an einem optischen Messkopf

vorbeigeführt. Die maximale Zeitauflösung für Messungen an einem einzelnen Well beträgt

50 ms. Werden 384 Wells simultan gemessen, so kann für jedes Well maximal alle 29

Sekunden ein Datenpunkt aufgenommen werden. Die Fluoreszenz kann entweder von oben,

für zellfreie Assays (top read), oder von unten, für Assays mit adherenten Zellen (bottom

read), angeregt und detektiert werden. Abbildung 2.3 verdeutlicht das Messprinzip für beide

Konfigurationen.

Abb 2.3: Prinzip der Anregung (grüne Linien) und Detektion (rote Linien) von Fluoreszenz in

Multiwellplatten mit der FlexStationII 384 . Die Fluoreszenz kann entweder von oben (top read) oder von unten

(bottom read) angeregt und detektiert werden. Das System verfügt über einen Anregungsmonochromator (A) und

einen Emissionsmonochromator (B). Als Lichtquelle dient eine Xenon Blitzlampe (C). Über das bewegliche

Ablenkgitter (D) kann Licht einer bestimmten Wellenlänge (grüne Linie) aus dem Spektrum der Xenonlampe

ausgewählt werden. Dieses Licht wird über Lichtleiter (E) und Spiegel (F) entweder von oben oder von unten in

das Well der Mikrowellplatte (G) fokussiert. Aus dem Well emittiertes Fluoreszenzlicht gelangt über

fokussierende Spiegel (H) und Lichtleiter (J) zum beweglichen Emissions-Ablenkgitter (K). Hiermit wird die

gewünschte Wellenlänge aus dem Spektrum des emittierten Lichtes ausgewählt. Ein Photomultiplier (L)

detektiert die Intensität des emittierten Lichtes. (Abbildung: www.moleculardevices.com)


Material und Methoden 23

Die FlexStationII 384 verfügt zudem über einen 16-Kanal-Pipettierkopf (für 384er

Multiwellplatten). Der Pipettierkopf ermöglicht einen sogenannten plate to plate Transfer

von Lösungen (FlexMode), während der zeitaufgelösten Messung der Fluoreszenzintensität

von Wells einer Spalte. Dabei können zwischen 1-30 µl Lösung aus einer compound plate in

die Wells der assay plate transferiert werden. Dafür werden Einwegspitzen

(MolecularBioproducts oder MolecularDevices) verwendet.

Da bei der FlexStationII 384 sowohl für die Fluoreszenzanregung als auch für die

Fluoreszenzdetektion Monochromatoren verwendet werden (Abb.2.2), eignet sich das System

auch zur Aufnahme von Fluoreszenzspektren (SpektrumMode). Bei fixierter Anregungs- bzw.

Emissionswellenlänge, kann in Schritten von 1 nm das Fluoreszenzspektrum eines Farbstoffes

aufgenommen werden. Auch hier kann die Messung in einem einzelnen bis hin zu 384 Wells

gleichzeitig erfolgen. Alle Messungen mit dem FlexStation 384 -System wurden bei 37°C

durchgeführt.

2.4.3 Ausplattieren von HEK 293-FlpIn Zellen auf Multiwellplatten

Ich habe ausschließlich 384er Multiwellplatten (Greiner; Microplatte, 384 Wells, PS, F-

Boden µClear, High Binding, Schwarz) verwendet. Die Zellen (auf ∅ 9 cm Schalen) wurden

bei ca. 90 %iger Konfluenz mit 5 ml PBS gewaschen, mit 1 ml Trypsin/EDTA bei 37°C für

einige Minuten inkubiert und in 9 ml DH10-Medium resuspendiert. Die Anzahl der Zellen pro

Milliliter wurde in einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Die Zellsuspension wurde

anschließend mit DH10 auf 4 x 10 5 Zellen/ml verdünnt. Von dieser Suspension wurden

entweder 50 µl (≈ 20000 Zellen/Well) oder 25 µl (≈ 10000 Zellen/Well) in die Wells der

384er Multiwellplatten gegeben. Die Mutiwellplatten wurden zuvor mit einer Poly-L-Lysin

Lösung für mindestens 1 Stunde inkubiert. Diese Lösung wurde vor dem Ausplattieren der

Zellen aus den Wells abgesaugt. Die Messungen erfolgten 24 Stunden bzw. 48 Stunden nach

dem Ausplattieren der Zellen.

Für die Experimente an der FlexStationII 384 wurde das DH10-Medium vorsichtig mit einer

kleinen Kanüle abgesaugt und durch die jeweilige Messlösung bzw. Farbstofflösung ersetzt.


Material und Methoden 24

2.5 Messung der Fluoreszenzlebensdauer

Fluoreszenzfarbstoffe emittieren Fluoreszenzlicht,

wenn sie mit Licht einer geeigneten Wellenlänge

bestrahlt werden (Anregungslicht). Die Prozesse,

die von der Absorption des Anregungslichts zur

Emission von Fluoreszenzlicht führen, werden oft

mit Hilfe von Energiediagrammen dargestellt.

Solche Diagramme zeigen die Energieniveaus der

Elektronenübergänge, die bei Absorption und

Emission von Photonen auftreten. Abbildung 2.4

zeigt ein stark vereinfachtes Energiediagramm.

Die Absorption eines Photons (hν A ) hebt ein

Anregung

Elektron von seinem Grundzustand (S0), in einen angeregten Zustand höher Energie (S1).

Dieser Vorgang ist extrem schnell; er vollzieht sich innerhalb etwa 10 -15 s. Das Elektron

verweilt für eine gewisse Zeit in dem angeregten S1-Zustand und kehrt dann zum

Grundzustand zurück. Das besondere an Fluoreszenzfarbstoffen ist, dass beim Übergang des

Elektrons von S1 in S0, die freiwerdende Energie als Fluoreszenzphoton (hν F ) emittiert

werden kann. Die Energie des emittierten Photons ist dabei immer geringer als die des

absorbierten Photons. Man spricht vom sog. Stokes´ shift. Allerdings kann das Elektron auch

durch strahlungslose Prozesse, wie z.B. die interne Konversion (IK), in den Grundzustand

(S0) zurückkehren. Hierbei wird die zuvor absorbierte Lichtenergie z.B. in Wärme

umgewandelt. Das Verhältnis von emittierten Fluoreszenzphotonen zur Anzahl der

absorbierten Photonen wird als die sogenannte Quantenausbeute (φ) eines Farbstoffes

bezeichnet, die je nach Farbstoff Werte zwischen 0 und 1 annehmen kann..

Die Eigenschaften vieler Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. φ) werden von ihrer Umgebung

beeinflusst. Neben den in Kapitel 2.1 beschriebenen spannungssensitiven Farbstoffen, gibt es

z.B. auch ionensensitive Farbstoffe. Diese Farbstoffe werden eingesetzt, um zeitliche

und/oder räumliche Konzentrationsänderungen von bestimmten Ionen in lebenden Zellen oder

Geweben zu verfolgen. Der Parameter, der bei Experimenten mit Zellen häufig gemessen

wird, ist die Fluoreszenzintensität. So ist z.B. die Fluoreszenzintensität einer mit

spannungsabhängigen Farbstoffen beladenen Zelle eine Funktion von V m . Zellen, die mit

einem ionensensitiven Farbstoff beladen sind, fluoreszieren, abhängig von der Konzentration

des jeweiligen Ions. Aber: Konzentration und Verteilung der Farbstoffmoleküle in der Zelle

S1

S0

Emission

hν A IK hν E

Abb. 2.4: Schematische Darstellung der

Elektronenübergänge die zur Fluoreszenz

von Molekülen führen. Die Absorption eines

Photons (hν A ) befördert Elektronen aus ihrem

Grundzustand (S0) in einen angeregten Zustand

(S1). Die Relaxation des Elektrons zu S0 erfolgt

entweder strahlungslos, durch interne

Konversion (IK), oder ist mit der Emission

eines Fluoreszenzphotons (hν E ) verbunden


Material und Methoden 25

bestimmen die Fluoreszenzintensität ebenfalls (siehe 2.1). Die Konzentration und Verteilung

des Farbstoffs kann von Zelle zu Zelle unterschiedlich sein. Das heißt, es ist in den meisten

Fällen (mit Ausnahme einiger ratiometrischer Verfahren) sehr schwer oder gar unmöglich,

über die Fluoreszenintensität absolute Ionenkonzentrationen bzw. Membranpotenziale zu

bestimmen. Der Parameter „Fluoreszenzintensität“ wird deshalb meist dazu verwendet,

zeitliche oder räumliche Änderungen von Ionenkonzentrationen oder V m zu verfolgen.

Ein anderes, experimentell aufwendigeres Verfahren, detektiert nicht die

Fluoreszenzintensität, sondern die sogenannte Fluoreszenzlebensdauer. Wird ein Elektron

durch Absorption eines Anregungsphotons aus dem S0 Zustand in den angeregten S1 Zustand

gehoben (Abb.2.4), verweilt das Elektron eine gewisse Zeit im S1-Zustand und kehrt dann in

den Grundzustand zurück. Die meisten Elektronen haben nur eine kurze Aufenthaltsdauer

(Fluoreszenzlebensdauer) im angeregten Zustand (wenige Nanosekunden). Die

Fluoreszenzlebensdauer kann bestimmt werden und ist für jeden Farbstoff ein

charakteristischer Parameter. Der Farbstoff wird dazu zunächst mit einem extrem kurzen (< 1

ns) Laserpuls angeregt. Es wird nun die Zeit gemessen, die vergeht, bis das erste

Fluoreszenzphoton auf den jeweiligen Detektor (meist ein Photonenzähler, siehe dazu auch

2.5.1) trifft. Dieses System ist mit einer

10000

1 mM Ca

außerordentlich genauen Stoppuhr zu

2+

1000

0 Ca 2+

vergleichen. Gestartet wird sie bei Anregung,

gestoppt bei der Emission. Abhängig von der 100

gewünschten Zeitauflösung und dem Signal- 10

Rausch-Verhältnis wird diese Messung

1

1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50

zehntausend- bis millionenfach wiederholt (dazu

Zeit nach Anregung (ns)

werden Laser benutzt, die ca. 1 000 000 Pulse Abb. 2.5: Histogramm der Fluoreszenzlebensdauer

von CalciumGreen in

pro Sekunde generieren). So lässt sich ein Abhängigkeit von der Ca 2+ -Konzentration.

Histogramm für die Fluoreszenzlebensdauer

erstellen (Abb 2.5). Anhand des Fluoreszenzlebensdauer-Histogramm kann man die

sogenannte Abklingzeit (Abb. 2.5) der Fluoreszenz bestimmen. Als Abklingzeit wird die

Steigung der abfallenden Flanke des Histogramms bezeichnet. Diese kann durch einen

exponentiellen Fit bestimmt werden. Die Abklingzeit gibt an, wie lange ein Elektron im

statistischen Mittel im angeregten Zustand verweilt. Die Abklingzeit wird deshalb als die

Fluoreszenzlebensdauer eines Farbstoffs bezeichnet.

Photonen


Material und Methoden 26

Viele Fluoreszenzfarbstoffe werden durch ihre Umgebung beeinflusst. So sind z.B. einige

Farbstoffe bekannt, bei denen die Fluoreszenzlebensdauer eine Funktion der Konzentration

bestimmter Ionen ist (Abb2.5; oder z.B. der Cl - Farbstoff MQAE).

Die Verwendung der Fluoreszenzlebensdauer als Messparameter kann von Vorteil sein, denn:

Die Fluoreszenzlebensdauer ist unabhängig von Konzentration und Verteilung des Farbstoffs.

Man kann sie sozusagen als „Materialkonstante“ des Farbstoffs bezeichnen. Die

Fluoreszenzlebensdauer kann, abhängig von der Konzentration eines bestimmten Ions,

kalibriert werden (beim Farbstoff MQAE z.B. die Cl-Konzentration). Das erlaubt in

Experimenten, die unter den gleichen Bedingungen wie die Kalibrierung durchgeführt

werden, die Bestimmungen absoluter Ionenkonzentrationen. KANEKO ET AL. (2005) konnten

anhand der Fluoreszenzlebensdauer von MQAE die Cl - -Konzentration in olfaktorischen

Neuronen bestimmen.

2.5.1 Messstand zur Detektion der Fluoreszenzlebenszeit

Für die Anregung der Fluoreszenz wird ein Dioden-Laser (PDL 470, PicoQuant) mit einer

Emissionswellenlänge von 470 nm verwendet. Der Laser emittiert Lichtpulse von 80 ps

Halbwertsbreite mit einer Frequenz von 40 MHz. Über einen Lichtleiter wird das

Anregungslicht in ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop eingekoppelt und dort, nachdem

es einen Anregungsfilter (470DF9, OmegaOptical) passiert hat, an einem dichroischen

Spiegel (650DRLP, OmegaOptical) reflektiert und mit einem Wasser-Immersionsobjektiv

(60x; NA1,2; auf Unendlich korrigiert, Olympus) auf die Probe fokussiert. Das von der Probe

in der Messkammer emittierte Fluoreszenzlicht wird mit dem Objektiv wiederum gesammelt,

passiert den dichroischen Spiegel und wird dann mit einem Tubus (180 mm Brennweite) auf

ein zirkuläres Pinhole (100µM Durchmesser) fokussiert. Dem dichroischen Spiegel ist zudem

noch ein Bandpassfilter (540DF40, OmegaOptical) nachgeschaltet. Das Licht, das durch das

Pinhole fällt, wird dann durch ein 10x Objektiv auf eine single-photon avalanche Photodiode

(AQR-14, Perkin Elmer) refokussiert. Der Abstand zwischen Objektiv und Probe wird

variiert, indem, mit einer Präzision im submikrometer Bereich, ein Piezo-Aktuator (PIFOC P-

721-20, Physik Instrumente) das Objektiv bewegt. Für laterales Scannen wird die Probe über

einen Piezo-Tisch (PI P-527, 2CL, Physik Instrumente) bewegt. Die TTL Pulse der

Photodiode werden mit einer TCSPC-Elektronik (time-correlated-single-photon counting) in

einem sogenannten TTTR-Modus (time-tagged-time-resolve) aufgenommen. Das Scannen der

Probe und die Datenaufnahme werden mit einer speziellen Elektronik (SCX 200, PicoQuant)


Material und Methoden 27

synchronisiert. Die Rekonstruktion des Bildes der Probe wurde anhand dieser Daten

vorgenommen.

2.5.2 Vorbereitung der Zellen

Die Zellen (auf ∅ 9 cm Schalen) wurden mit 5 ml PBS gewaschen, mit 1 ml Trypsin/EDTA

bei 37°C für einige Minuten inkubiert und in 9 ml DH10-Medium resuspendiert. Die Zellen

wurden auf Poly-L-Lysin beschichtete Glasplättchen in 24er Multiwellplatten ausgesät und

für mindestens 20-22 h bei 37°C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die

Glasplättchen wurden zuvor mit Poly-L-Lysin (0,1 mg/ ml, für mindestens 1h) inkubiert und

mit PBS gewaschen.

2.6 Elektrophysiologie und Fluorimetrie

2.6.1 Detektion von Fluoreszenz mit einem Photonenzähler

Abb. 2.6: Aufbau eines PMT „photomultiplier tube“

Photomultiplier wandeln schwache Lichtsignale in einen nachweisbaren elektrischen Puls um.

Ein Photomultiplier besteht aus mehreren Teilen (Abb 2.6). Auf ein schmales Eintrittsfenster

folgt eine Photokathode. Diese besteht aus einem Material, das nur schwach gebundene

Valenzelektronen (die Austrittsarbeit beträgt nur wenige eV) besitzt. Das Material der

Photokathode hat einen großen Wirkungsquerschnitt für die Umwandlung von Photonen in

Elektronen durch den Photoeffekt. Fast jedes einfallende Photon erzeugt ein Elektron. Hinter


Material und Methoden 28

der Photokathode sind eine Reihe Dynoden, ebenfalls aus einem Material mit kleiner

Austrittsarbeit, angebracht. Das Potenzial steigt von Dynode zu Dynode um ca. 100-200 V an.

Jede Dynode beschleunigt die erzeugten Elektronen bis zur nächsten Dynode und fügt durch

Sekundäremission ein Vielfaches an weiteren Elektronen hinzu. In einem Photomultiplier

befinden sich 6 bis 14 solcher Dynodenstufen, wodurch das Eingangssignal etwa 10 4 bis

10 7 -fach verstärkt wird. Das Endsignal ist somit gut messbar und, bis auf statistische

Schwankungen, proportional zum Eingangssignal. Der Photomultiplier kann in einen sog.

Photonenzähler integriert werden. In einem Photonenzähler werden die Spannungssignale des

Photomultipliers digital verarbeitet. Trifft ein Photon auf die Kathode des Phothomultipliers

auf, wird es als „Count“ registriert und dargestellt. Es ist möglich, Counts über einen

bestimmten Zeitraum zu integrieren (counts/x ms).

2.6.2 Kombinierte Patch-Clamp- und Fluorimetrieexperimente

Patch-Clamp-

Verstärker

Meß-

Kammer

Monitor

Objektiv

Dc-

Spiegel

Filter

Lichtleiter

Iris-

Blende

Anregungs-

Filter

Xe-

Lampe

Computer

F

I

Kamera

Photonenzähler

Kontrollsystem

Abb. 2.7: Schematische Darstellung des Messstandes für kombinierte Patch-Clamp und

Fluorimetrieexperimente

Abbidung 2.7 zeigt schematisch den Aufbau des Messstandes für kombinierte Patch-Clampund

Fluorimetrieexperimente. Das Licht einer Xenon-Lampe (100 W, Nikon) wird über einen

Lichtleiter (Amko) in das inverse Mikroskop (Diaphot 300, Nikon) eingekoppelt. Zwischen

Lampe und Lichtleiter kann ein Filter für die Fluoreszenzanregung in den Strahlengang


Material und Methoden 29

eingebracht werden. Die Belichtungsintensität wird mit einer Irisblende reguliert. Das

Anregungslicht (blaue Pfeile in Abb. 2.11) wird im Mikroskop an einem dichroischen Spiegel

(DC-Spiegel) reflektiert. Ein UV-durchgängiges Öl-Immersionsobjektiv (Nikon Fluor 40x,

NA = 1,3) fokussiert das Licht auf die Probe. Die von der Probe in der Messkammer

emittierte Fluoreszenz (grüne Pfeile in Abb 2.7) fällt durch einen Bandpaßfilter. Dem

Bandpaßfilter nachgeschaltet ist eine Lochmaske. Hinter der Lochmaske kann ein Spiegel in

den Strahlengang einschwenkt werden, der das Licht auf eine Video-Kamera leitet. Wird der

Spiegel aus dem Strahlengang entfernt, fällt das Licht auf einen Photonenzähler (Life Science

Resources). Mit der Lochmaske kann das Detektionsfeld des Photonenzählers auf eine

bestimmte Größe (z.B. eine Zelle) begrenzt werden. Über den Monitor der Kamera kann dies

kontrolliert werden. Ein elektrischer Mikromanipulatur (Luigs & Neumann, Darmstadt), mit

dem die Patch-Pipette im Mikrometerbereich bewegt werden kann, ist an dem Kreuztisch des

Mikroskopes befestigt. Ausgehend vom dem Hauptverstärker (EPC-7; List, Darmstadt)

gelangt das Signal der Meßelektrode über einen A/D-Wandler (DigiData 1200, Axon

Instruments) in einen Computer und auch zu einem Oszilloskop (Tektronix). Ein

Pulsgenerator (A310 Accupulser, World Precision Instruments) erzeugt den Testpuls. An

diesem Messstand können Patch-Clamp-Experimente mit fluoreszenzoptischen Aufnahmen

kombiniert werden. Aufgenommen wurden die Daten mit der Software PhoClamp (Life

Science Resources).

Für die Herstellung der Patch-Pipetten wurden filamentierte Borosilikatglaskapiullaren

(Außendurchmesser: 1,5 mm, Innendurchmesser: 0,87 mm, Hilgenberg, Malsfeld) mit einem

DMZ-Universal Puller (Zeitz, Augsburg) gezogen und anschließend feuerpoliert (Mikroforge

L/M-CPZ, List; Darmstadt). Der Widerstand der Pipetten betrug 5-10 MΏ

2.6.3 Vorbereitung der Zellen

Die Zellen (auf ∅ 9 cm Schalen) wurden mit 3-5 ml PBS gewaschen, mit 1 ml

Trypsin/EDTA bei 37°C für einige Minuten inkubiert und in 9 ml DH10-Medium

resuspendiert. Die Zellen wurden auf Poly-L-Lysin beschichtete Glasplättchen in 24er

Multiwellplatten ausgesät und für mindestens 20-22 h bei 37°C, 5% CO 2 und 95%

Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Glasplättchen wurden zuvor in den 24er Multiwellplatten mit

Poly-L-Lysin (0,1 mg/ ml, für mindestens 1h) inkubiert und mit PBS gewaschen.


Material und Methoden 30

2.7 High-Performance-Liquid-Chromatography (HPLC)

Chromatographische Methoden verfolgen alle ein Ziel: die Trennung einzelner Komponenten

aus einem Substanzgemisch. Die HPLC (high-performance-liquid-chromatography) ist eine

Säulen-Flüssigkeits Chromatographie. Sie stellt ein Trennverfahren dar, bei dem ein

Substanzgemisch (Analyt) mittels

einer flüssigen mobilen Phase und

unter hohem Druck über eine

stationäre Phase (Füllmaterial der

chromatographischen Säule)

transportiert wird (Abb 2.13). Die

mobile Phase vermittelt die

Wechselwirkung des Analyten mit Abb 2.8 Schematischer Aufbau einer HPLC-Anlage. Eine

HPLC-Anlage besteht aus 4 Hauptteilen: Pumpen; Injektor;

der spezifischen Oberfläche der Trennsäule, Detektor. Aus: Bioanalytik, F.Lottspeich, H.

stationären Phase. Diese Zorbas, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 1998

Wechselwirkung bewirkt einen verzögerten Transport der einzelnen Komponenten, wodurch

jede eine charakteristische Zeit (Retentionszeit) oder Volumen (Retentionsvolumen)

benötigen, um die Trennsäule zu verlassen. Wird im Verlauf der Elution die

Zusammensetzung der mobilen Phase verändert, handelt es sich um eine Gradiententrennung.

Man unterscheidet dabei sog. Stufengradienten und lineare Gradienten. Bei einer Trennung

mittels linearem Gradient wird die Zusammensetzung der mobilen Phase durch

kontinuierliches Mischen von z.B. zwei Lösungsmitteln (A und B, siehe Abb. 2.8) verändert.

Lösungsmittel A und B können sich im pH-Wert, im Salzgehalt oder im Anteil an

organischem Lösungsmittel unterscheiden. Die Probe wird auf die Säule aufgetragen, indem

sie zunächst drucklos in eine Probenschleife (Injektor Abb. 2.8) injiziert wird. Der

Elutionsstrom wird dann durch die Probenschleife geführt, wodurch die Probe auf die Säule

gelangt. Um Substanzen, die von der Säule eluierenden, qualitativ oder quantitativ

nachweisen zu können, wird bei Peptid- oder Proteingemischen oft die UV-Absorption des

Eluats verfolgt. Man detektiert entweder die UV-Absorption der Peptidbindung (bei 206-220

nm) oder der aromatischen Seitenketten (Trp absorbiert z.B. bei 280 nm). Das Ergebnis der

Substanztrennung wird in Form eines Chromatogramms dargestellt (Übersicht: Lottspeich &

Zorbas, Bioanalytik).


Material und Methoden 31

2.7.1 Umkehrphasen (reversed phase)- HPLC

Als stationäre Phase werden bei der RP-HPLC meist poröse Kieselgele eingesetzt, deren

polare OH-Gruppen auf der Oberfläche mit Kohlenwasserstoffketten (je nach Anwendung mit

einer Länge von C 2 bis C 18 ) verethert sind. So erhält man ein unpolares Trägermaterial. Bei

der RP-HPLC findet eine hydrophobe Wechselwirkung des Analyten mit der unpolaren

stationären Phase statt. Die Elution erfolgt über einen Gradienten von organischen

Lösungsmittel (Lösungsmittel B; oft Acetonitril). Im Verlauf der Chromatographie wird

durch Zumischen des organischen Lösungsmittels zur wässrigen Phase (Lösungsmittel A), die

Polarität der mobilen Phase verringert und so die Elutionskraft erhöht. Das organische

Lösungsmittel konkurriert mit den adsorbierten Molekülen des Analyten um die

Bindungsstellen an der stationären Phase. Die einzelnen Komponenten des Analyten werden

somit anhand ihrer Hydrophobizität aufgetrennt. Je größer die Hydrophobizität einer

Komponente im Analyten, desto länger ist deren Retentionszeit auf der Säule

Meist wird beiden Lösungsmitteln ein sogenanntes Ionenpaar-Reagenz (oft

Trifluoressigsäure, TFA 0,1%) zugesetzt. Das Ionenpaar-Reagenz interagiert mit den

geladenen Seitengruppen von Peptiden und Proteinen und verändert deren Hydrophobizität.

Das führt zu einer verbesserten Wechselwirkung des Analyten mit der stationären Phase und

folglich zu einer verbesserten Trennung (Übersicht: Lottspeich & Zorbas, Bioanalytik).

2.7.2 Aufbau der RP-HPLC-Anlage

Ich habe RP-HPLC Experimente an einer HPLC-Anlage der Firma Merck Hitachi

durchgeführt. Die über eine 100 µl Schleife injizierten Proben (Probenvolumen 50µl) wurden

über einen Lösungsmittelgradienten eluiert. Dazu wurde die Zusammensetzung der mobilen

Phase durch kontinuierliches Mischen von Lösungsmittel A [Wasser + 0,1% TFA (Sigma)]

und Lösungsmittel B [Acetonitril (Sigma) + 0,1% TFA] verändert. Die Anlage bestand aus

dem Pumpensystem L-6220 und einem Dioden Array, Type L-4500A. Die Systemsteuerung

und Datenaufnahme/Datenanalyse erfolgte, vermittelt über ein Interface (D-6000), mit der

Software HPLC-System LaCHrom D-7000. Die Trennung erfolgte auf einer Phenomenex

Jupiter C 4 Säule mit 5µm Partikelgröße und 300 Å Porenweite. Die Säule war 250 mm lang

und hatte einen Innendurchmesser von 4,6 mm. Zum Schutz vor Verunreinigungen war dieser

Säule eine guard (Schutz)-Säule (Vydac C 18 ) vorgeschaltet. Die Detektion erfolgte bei

214 nM.


Material und Methoden 32

2.8 SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

Die denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist ein Verfahren zur

Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht. Das anionische Detergenz

Natriumdodecylsulfat (SDS) bindet an Proteine und überdeckt deren Eigenladung. Die Zahl

der anlagerten SDS-Moleküle ist proportional zum Molekulargewicht der Polypeptide (ca.1,4

g SDS pro 1 g Protein), so dass im elektrischen Feld eine Auftrennung der Proteine nach

ihrem Molekulargewicht möglich ist. Die Molekulargewichtsbestimmung der Polypeptide

erfolgt durch Vergleich ihrer Laufstrecke mit der Laufstrecke bekannter Proteine (Marker).

Zur besseren Auftrennung von Proteinen/Peptiden unter 10 kDa wurde die

Gelelektrophoresen in Tricin-Puffer (SCHÄGGER & JAGOW 1987) durchgeführt. Als

Größenstandards habe ich Proteine des „Low Molecular Weight Calibration Kit“ (LMW-

Größenstandard) und des „High Molecular Weight Calibration Kit“ (HMW-Größenstandard)

von Amersham Pharmacia Biotech verwendet (Tab. 2.2).

Tab. 2.3 Größenstandards für die SDS-Gel-Elektrophorese

LMW-Größenstandard

HMW-Größenstandard

Molekulargewicht (kDa) Protein Molekulargewicht (kDa) Protein

97 Phosphorylase b 212 Myosin

64 Albumin 170 α 2 -Makroglobulin

45 Ovalbumin 116 β-Galaktosidase

30 Carboanhydrase 76 Transferrin

20,1 Trypsin-Inhibitor 53 Glutamat-Dehydrogenase

14,4 α-Lactalbumin

Die SDS-PAGE wurde in einer Hoefer-Gelkammer (Pharmacia) durchgeführt. Es wurden

12%ige Trenngele und 5%ige Sammelgele verwendet. Die Proben wurden mit 1 x SDS-

Probenpuffer (Stocklösung 4 x SDS Probenpuffer: 8% SDS; 200mM Tris/HCl pH 6,8; 50%

(v/v) Glycerin; 4% (w/v) β-Mercaptoethanol; 0,04% (w/v) Coomassie Brillantblue R250)

versetzt. Die elektrophoretische Trennung erfolgte über ca. 12 h bei 40 mA. Die Gelkammer

wurde mit gesonderten Puffern für Anode (200 mM Tris/HCl, pH8,9) und Kathode (100 mM

Tris, 100 mM Tricin, SDS 3,5 mM) befüllt. Die Gele wurden mit der Rapid-Coomassie

Methode angefärbt. Dazu wurden die Gele zunächst in Färbelösung A (0,05% Coomassie,

10% Essigsäure, 25% Isopropanol) in der Mikrowelle erhitzt (bis zum Sieden der Lösung).

Nach 5 minütigem Abkühlen bei Raumtemperatur wurde Färbelösung A verworfen und das

Gel mit Wasser gespült. Danach wurde das Gel in die Färbelösung B (0,005% Coomassie,


Material und Methoden 33

10% Essigsäure, 10% Isopropanol) gegeben und wiederum in der Mikrowelle erhitzt. Es

folgte erneut ein Waschschritt mit Wasser. Letztlich wurde das Gel in Färbelösung C (0,002%

Coomassie, 10% Essigsäure) erhitzt und wiederum mit Wasser abgespült.

Die Entfärbung erfolgte mittels 10%iger Essigsäure. Dazu wurde das Gel in der

Entfärbelösung mehrmals erhitzt. Austretender Farbstoff wurde dabei von einem in der Gel-

Schale befindlichen Kimwipe-Tuch aufgenommen.

2.9 Tiergifte

Im Rahmen der Zusammenarbeit mit mehreren - vor allem internationalen - Arbeitsgruppen,

wurden mir Tiergifte verschiedenster Spezies zur Verfügung gestellt. In den nachfolgenden

Kapiteln habe ich dokumentiert in welcher Form ich die Gifte erhalten und für die Tests

vorbereitet habe.

2.9.1 Kegelschneckengifte

Mir wurden freundlicherweise von Prof. Joe Lynch (University of Queensland, School of

Biomedical Science) bzw. Dr. Richard Lewis (University of Queensland, Institute for

Molecular Bioscience) Fraktionen von Kegelschnecken-Giften zur Verfügung gestellt

(Tab.2.4). Die Gifte waren durch Größenauschlusschromatograpie in jeweils 5 Fraktionen

aufgetrennt worden. Je nach Spezies enthielten die Fraktionen verschiedene Volumina (~ 50

µl – 200 µl). Die Peptidkonzentration der verschiedenen Fraktionen betrug jeweils ~ 4 mg/ml

Die Proben wurden in Absprache mit Prof. Lynch bei 4°C gelagert.

Tab. 2.4 Überblick über die fraktionierten Kegelschneckengifte

Conus-Spezies

A: C. miles

B: C. imperialus

C: C. capitanus

D: C. marmoreus

E: C. miliaris

F: C. flavidus

G: C. mustelinus

H: C. catus


Material und Methoden 34

2.9.2 Schlangengifte

Gifte verschiedener Schlangen (Naja haje, Naja siamensis, Ophiophagus hannah, Bitis

areitans, Vipera ursinii) habe ich von Prof. Yuri Utkin (Shemyakin-Ovchinnikov Institute of

Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences) erhalten. Die Gifte wurden mir in

Form lyophylisierter Trockensubstanz (zwischen ~ 20-60 mg pro Gift) übergeben. Die Gifte

wurden in extrazellulärer Lösung (ES in mM: 120 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl 2 ; 2 MgCl 2 ,

10 HEPES; 10 Glukose, pH 7,4) in einer Konzentration von 100 mg/ml – bezogen auf die

Trockensubstanz- gelöst.

2.9.3 Spinnen- und Skorpiongifte der Firma SpiderPharm

Die Firma SpiderPharmInc (Yarnell, AZ, USA) vertreibt Gifte von Spinnen, Skorpionen und

Tausendfüßlern. Ich habe je 5 µl lyophylisiertes Gift von 50 verschiedenen Spinnen- und

Skorpionspezies erhalten (Tab. 2.5). Im weiteren Verlauf der Arbeit werden die Gifte mit der

SpiderPharm-Katalognummer bezeichnet. Alle Gifte wurden in 250 µl ES aufgenommen.

Tab 2.5 Gifte der Firma SpiderPharm

SpiderPharm KatNr. Spezies Ordnung Familie

199 Peucetia viridans Araneae Oxyopidae

168 Loxosceles reclusa Araneae Sicariidae

160 Aphonopelma spp Araneae Theraphosidae

182 Loxosceles arizonica Araneae Sicariidae

125 Acanthoscurria muscalosa Araneae Theraphosidae

277 Opistophthalmus glabrifrons Scorpionida Scorpionidae

163 Latrodectus tredecimguttatus Araneae Theridiidae

180 Agelenopsis aperta Araneae Agelenidae

185 Latrodectus hesperus Araneae Theridiidae

249 Aphonopelma seemani Araneae Theraphosidae

313 Pholcid Araneae Pholcidae

269 Heterometrus spinifer Scorpionida Scorpionidae

264 Heteroscodra maculata Araneae Theraphosidae

369 Lactrodectus geometricus Aranea *

334 Lasiodorides polycuspulatus * *

197 Vaejovis spinigerus Scorpionida Vejovidae

116 Dolomedes tenebrosus Araneae Pisauridae

124 Citharischius crawshayi Araneae Theraphosidae

154 Haplopelma albostriatum Araneae Theraphosidae

343 Acanthoscurria jurenicola * *

119 Pterinochilus meridionalis Araneae Theraphosidae

203 Hadrurus arizoniensis Scorpionida Iuridae

127 Haplopelma minax Aranea Theraposidae

115 Haplopelma spp.Burmese Aranea Theraposidae


Material und Methoden 35

351 Cyclosternum pentalone * *

268 Pandinus imperator Scorpionida Scorpionidae

194 Psalmopoeus cambridgei Araneae Theraphosidae

247 Grammostola grossa Araneae Theraphosidae

269 Heterometrus spinifer Scorpionida Scorpionidae

301 Califena spp. * *

159 Parabuthus transvaalicus Scorpionida Buthidae

348 Vitalius roseus * *

330 Unidentified lycosid * *

245 Aphonopelma hentzi Araneae Theraphosidae

107 Grammostola rosea Araneae Theraphosidae

349 Acanthoscurria altmanni * *

258 Phidippus spp.Redback Araneae Salticidae

251 Ceratogyrus marshalli Araneae Theraphosidae

131 Cyriopagopus paganus Araneae Theraphosidae

176 Hogna carolinensis * *

129 Centruroides exilicauda Scorpionida Buthidae

190 Plectreurys spp. Araneae Plectreuridae

157 Chilobrachy spp.195 Araneae Theraphosidae

114 Haplopelma lividum Araneae Theraphosidae

200 Aphonopelma sp2 Araneae Theraphosidae

106 Grammostola Araneae Theraphosidae

259 Parabuthus transvaalicus Scorpionida Buthidae

253 Crassicrus lamanai Araneae Theraphosidae

201 Kukulcania sp2 Araneae Filistatidae

181 Hololena spp. Araneae Agelenidae

* keine Angaben im SpiderPharmInc-Katalog


Material und Methoden 36

2.10 Gleichungen

1. Spannungsgleichung von Goldman-Hodgkin-Katz

V m =

RT

F

+ P K [K+ ] a + P Na [Na + ] a + P Cl [Cl - ] i

* ln

P K [K + ] i + P Na [Na + ] i + P Cl [Cl - ] a

(R) allgemeine Gaskonstante, (T) Temperatur in Kelvin, (F) Faraday-Konstante

[Ion] = Konzentration (a) extrazellulär (i) intrazellulär

2. Nernst-Gleichung für Kalium

E K = 61,4 mV x log

[K + ] a

[K + ] i

[Ion] = Konzentration (a) extrazellulär (i) intrazellulär

3. modifizierte Hill-Gleichung

∆F/F% =

∆F/F% min - ∆F/F%

1 + ([Wirkstoff] / EC50) n

+ ∆F/F% max

EC50 = Wirkstoffkonzentation bei halbmaximalen Effekt; n= Hill-

Koeffizient


Ergebnisse 37

3. Ergebnisse

Das Ziel meiner Arbeit bestand darin, neue Substanzen zu finden, die auf HCN-Kanäle

wirken. Grundvoraussetzung dafür war die Entwicklung eines zellbasierten Hochdurchsatz-

Testverfahrens (HTS-Assay) im Mikrotiterplattenformat, das es ermöglicht, Tiergifte auf

HCN-spezifische Wirkstoffe zu untersuchen. Der Messparameter sollte dabei das

Membranpotenzial (V m ) von Zelllinien sein, die den entsprechenden HCN-Kanal heterolog

exprimieren. Änderungen von V m , durch Blockieren oder Aktivieren der HCN-Kanäle, sollten

mit spannungssensitiven Farbstoffen fluoreszenzoptisch nachgewiesen werden.

3.1 Entwicklung eines fluoreszenzbasierten HTS-Assays

Das Membranpotenzial einer Zelle wird durch die Permeabilität der Zellmembran für

bestimmte Ionen und deren transmembranalen Konzentrationsdifferenz bestimmt. Die

sogenannte Goldman-Hodgkin-Katz Spannungs-Gleichung (2.10, Gleichung 1; siehe dazu

auch HILLE 2001) beschreibt diese Abhängigkeiten für eine Zelle, die für Kalium (K + ),

Natrium (Na + ) und Chlorid (Cl - ) permeabel ist. Das Membranpotenzial stellt gewissermaßen

den gewichteten Mittelwert der Nernstpotenziale für die verschiedenen Ionen dar. Im

Ruhezustand wird das Membranpotenzial der meisten Zellen hauptsächlich durch eine

Kaliumleitfähigkeit bestimmt. Deshalb haben Zellen, wie z.B. Neurone und Muskelzellen, ein

Ruhemembranpotenzial von -70 bis -100 mV, nahe dem Nernst-Potenzial für Kalium (E K ).

Sind gleichzeitig Na + -Leitfähigkeiten aktiv, so ergibt sich ein etwas positiveres

Membranpotenzial. HCN-Kanäle werden durch Hyperpolarisation geöffnet und leiten einen

gemischten Na + /K + -Strom. Sie wirken also einer Hyperpolarisation entgegen. Da HCN-

Kanäle wiederum bei Depolarisation schließen, ist ihre depolarisierende Wirkung

selbstlimitierend. Blockiert man HCN-Kanäle, verringert das die Na + -Leitfähigkeit der

Membran und das Ruhemembranpotenzial verschiebt sich in Richtung von E K . Ein neuer

Gleichgewichtszustand stellt sich ein. In Neuronen und Muskelzellen führt das Blockieren

von HCN-Kanälen zu einer Hyperpolarisation von 2-15 mV (Z.B. ROBINSON & SIEGELBAUM,

2003)

In den folgenden Kapiteln habe ich zunächst versucht, einen spannungssensitiven

Fluoreszenzfarbstoff zu finden, der es erlaubt, Spannungsänderungen in der Größenordung

von 2-15 mV fluoreszenzoptisch zu messen. Im nächsten Schritt habe ich HCN-Kanäle (allein

und in Kombination mit Kalium-Kanälen) in Kulturzellen heterolog exprimiert und

untersucht, ob das Membranpotenzial der Zellen von den HCN-Kanälen mitbestimmt wird.


Ergebnisse 38

Dazu habe ich die Wirkung von bekannten HCN-Kanalblockern auf das Membranpotenzial

der Zellen analysiert. Ich habe ebenfalls untersucht, ob eine Erhöhung des intrazellulären

Botenstoffs cAMP das Membranpotenzial der Zellen beeinflusst.

3.1.1 Eigenschaften spannungsabhängiger Fluoreszenzfarbstoffe

1.0

Fluoreszenz Fluoreszenz

0.5

0.0

1.0

0.5

MembraneKit DiSBAC DiBAC(4)

2 (3) DiBAC 4 (3)

610 nm

470 nm

450 525 600 675 750

DisC 3 (2) 3 (3)

DisC 3 (5)

3 (5)

670 nm

500 nm

450 525 600 675 750 450 525 600 675 750

740 nm

580 nm

630 nm

420 nm

590 nm

440 nm

DiOC DiOC 2 (3)

2

560 nm

420 nm

0.0

1.0

450 525 600 675 750

450 525 600 675 750

Wellenlänge (nm)

450 525 600 675 750

Wellenlänge (nm)

Fluoreszenz

0.5

Merocyanin 540

540

650 nm

450 nm

Anregungsspektrum

Emissionsspektrum

0.0

450 525 600 675 750

Wellenlänge (nm)

Abb. 3.1: Fluoreszenzspektren spannungssensitiver Farbstoffe. Wildtypzellen auf 384er Multiwellplatten

wurden mit Farbstofflösungen (je 2µM Farbstoff in ES) inkubiert. Das MembraneKit wurde nach

Herstellerangaben in ES gelöst. Die Fluoreszenzspektren der einzelnen Farbstoffe wurden in 2 nm Schritten

im Spectrum Mode des FlexStationII 384 -Systems aufgenommen. Die Spektren wurden auf die maximale

Fluoreszenzintensität normiert. Die Fix-Wellenlängen, bei denen die Anregungsspektren bzw.

Emissionsspektren gemessen wurden, sind in der jeweiligen Teilabbildung rot bzw. schwarz dargestellt.

Spannungssensitive Fluoreszenzfarbstoffe werden seit mehr als 25 Jahren verwendet, um

Änderungen der Membranspannung von Zellen fluoreszenzoptisch zu verfolgen. Im Zuge

dessen wurden bis heute dutzende Farbstoffe mit den unterschiedlichsten Eigenschaften

entwickelt. Der erste Schritt in der Entwicklung des fluoreszenzbasierten Bioassays war

herauszufinden, welcher Farbstoff sich für Messungen in Multiwellplatten (MWP) eignet.

Vielversprechend waren dabei vor allem die so genannten „langsamen“ Farbstoffe. Diese

Farbstoffe werden immer dann verwendet, wenn das Hauptaugenmerk auf ein möglichst

großes Signal gerichtet ist. Nachteil dieser Farbstoffe ist ihre langsame Kinetik, die z.B.

Messungen von Aktionspotenzialen in Neuronen unmöglich macht. Ich habe aus der Gruppe


Ergebnisse 39

der „langsamen“ spannungssensitiven Farbstoffe zunächst diejenigen untersucht, die am

weitesten Anwendung gefunden haben. Die spektralen Eigenschaften der Farbstoffe können je

nach Zellsystem unterschiedlich sein. Deshalb habe ich zunächst Wildtypzellen mit den

verschiedenen Farbstoffen inkubiert und die Fluoreszenzspektren der Farbstoffe

aufgenommen (Abb. 3.1). Auf der Basis dieser Fluoreszenzspektren wurden jeweils die

optimalen Anregungs- und Emissionswellenlängen gewählt.

∆F/F ∆F (%)

∆F (%)

∆F (%) (%)

∆F/F (%) ∆F/F (%)

MembraneKit DiSBAC 2 (3) DiBAC(4)

4 (3)

250

e

5

0

e

200

d

d

0

-5

c

150

b

c

100

a

-5

-10

50

0

b

-10

-15

0 100 200 300

0 100 200 300

0 100 200 300

DisC 35

DisC 3 (3)

3

(2) DisC

30

DisC 3 (5)

3

(5) DiOC

300

2 (3)

2

30

e

25

e

25

20

20

200

e

15

15

d

10

10

100

5

d

5

0

c

0

c

-5

-5

0

0 100 200 300

0 100 200 300

0 100 200 300

Zeit (s)

Zeit (s)

Merocyanin 540

540

5

a

0

b

c

-5

d

-10

e

-15

0 100 200 300

Zeit (s)

Abb. 3.2: Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität nach Kalium-Injektion zum extrazellulären Medium.

Wildtypzellen auf 384er Multiwellplatten wurden in 54 µl Farbstofflösung (je 2µM Farbstoff in ES1K + )

inkubiert. Das MembraneKit wurde nach Herstellerangaben in ES1K + gelöst und in die Wells gegeben. Im

FlexMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität vor und nach der

Injektion (6 µl) von KCl (Pfeil) gemessen. Dargestellt ist die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität

(∆F/F), bezogen auf die gemittelte Fluoreszenzintensität vor der KCl-Injektion. Die Endkonzentration von [K] a

in den Wells betrug a: 1 mM (es wurde ES1K injiziert); b: 3 mM; c: 10 mM; d: 30 mM und e: 100 mM.

Mittelwerte von 4 (a, d) bzw. 8 (b, c, d) Wells. In den Teilabbildungen für die verschiedenen Farbstoffe sind

jeweils nur die Fluoreszenzverläufe gekennzeichnet (mit a, b etc.), die sich voneinander unterscheiden lassen.

Anschließend habe ich untersucht, wie die verschiedenen Farbstoffe auf

Membranpotenzialänderungen der Zellen reagieren. Dafür wurde die extrazelluläre K + -

Konzentration ([K + ] a ) durch gezielte Injektionen von KCl in die Wells der Multiwellplatten

von 1 mM auf 3, 10, 30 oder 100 mM erhöht.

Abbildung 3.2 zeigt die Fluoreszenzantworten der verschiedenen Farbstoffe. Die mit Abstand

größten Fluoreszenzsignale zeigte das MembraneKit sowie der Farbstoff DiOC 2 (3) (∆F/F max >

200 % bei Lösung (e)). Die Signale der anderen Farbstoffe waren um etwa eine

Größenordnung geringer (∆F/F max < 30%). In vielen Fällen konnte ich


Ergebnisse 40

Fluoreszenzänderungen beobachten, die durch die Injektion selbst und nicht durch die

Erhöhung der extrazellulären Kalium-Konzentration hervorgerufen wurden. Solche

Injektionsartefakte können Werte von ∆F/F ≈ 10-15% annehmen (siehe DiBAC 4 (3)). Daher

sind die Farbstoffe mit einem ∆F/F max < 30% für einen verlässlichen HTS-Assay nicht

geeignet. Die Wahl zwischen dem MembraneKit und DiOC 2 (3) fiel leicht: DiOC 2 (3) zeigte

nur bei Injektion von 100 mM KCl ein Signal. Da sich der Farbstoff nicht

konzentrationsabhängig verhält, ist es zweifelhaft, ob der Farbstoff unter den gewählten

Bedingungen tatsächlich Spannungsänderungen anzeigt. Das MembraneKit ist nach diesen

Ergebnissen am besten geeignet für Messungen in 384er Multiwellplatten. Die größten und

schnellsten spannungsabhängigen Signale wurden mit diesem Farbstoff gemessen. Kleine

Änderungen von [K + ] a führen zu großen Fluoreszenzänderungen. Mit zunehmender [K + ] a -

Konzentration werden die Signale schneller und größer.

3.1.2 Charakterisierung des MembraneKits

A B C

900

800

+30 mV

-70 mV

10 s

600

90

80

2,56 2,56 (±(+- 0.13) 0,13) %/mV % / mV

700

500

70

∆F/F (%)

600

500

400

400

300

60

50

40

300

200

100

200

100

30

20

10

0

0 10 20 30 40 50

Zeit (s)

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

∆ V M

(mV)

0

0 5 10 15 20 25 30

∆ V m

(mV)

Abb. 3.3: Charakterisierung des MembraneKits. Wildtypzellen wurden mit dem MembraneKit inkubiert.

Über eine Patch-Pipette wurde das Membranpotenzial einzelner Zellen kontrolliert. Im whole-cell-Modus

wurden Spannungspulse appliziert. Die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Zelle wurde dabei über einen

Photonenzähler verfolgt (n = 14). (A) Prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F) einer Zelle,

bezogen auf die Fluoreszenzintensität vor dem ersten Spannungssprung. Die kleine Abbildung in (A) zeigt das

applizierte Spannungsprotokoll. Der Verlauf der Fluoreszenzintensität wurde jeweils mit einer

Exponentialfunktion gefittet (rote Linien in A). Die Fluoreszenzänderung in Sättigung ((∆F/F) max ) konnte so aus

den experimentellen Daten extrapoliert werden. (B) (∆F/F) max (+/-SEM) wurde gegen die Amplituden der

Spannungspulse aufgetragen. (C) Vergrößerten Ausschnitt (roter Kasten) aus (B). Eine Gerade mit einer

Steigung von 2,56%/mV wurde an die Datenpunkte angepasst (lineare Regression).


Ergebnisse 41

Um das MembraneKit zu charakterisieren, habe ich Patch-Clamp-Experimente mit

Fluorimetrie kombiniert. Ich habe Zellen mit dem MembraneKit inkubiert und das

Membranpotenzial einzelner Zellen mit einer Patch-Pipette im whole-cell Modus kontrolliert.

Die Zellen wurden definierten Spannungssprüngen ausgesetzt. Die Fluoreszenzintensität der

jeweiligen Zelle wurde dabei verfolgt (Abb. 3.3). Abbildung 3.3A zeigt die

Fluoreszenzantworten einer Zelle auf die Spannungssprünge. Bei einer Spannungsänderung

von 100 mV ändert sich die Fluoreszenzintensität (∆F/F) der Zelle um mehr als 700%.

Abbildung 3.3B zeigt die Spannungsabhängigkeit von ∆F/F. Die Maximalamplituden

(∆F/F) max wurden mit einem einfachen Modell aus den experimentellen Daten extrapoliert

(rote Linie in Abbildung 3.3A). Abbildung 3.3 C schließlich zeigt die Spannungsabhängigkeit

von ∆F/F für den Bereich kleiner Spannungsänderungen (∆V m < 30 mV). Die Abhängigkeit

ist in diesem Spannungsbereich linear. Passt man an die Messpunkte in diesem Bereich eine

Gerade an, so hat diese eine Steigung von 2,56%/mV. Eine Spannungsänderung von 10 mV

erzeugt also eine ≈ 25%ige Änderung der Fluoreszenzintensität. Änderungen in dieser

Größenordnung sollten in 384er Multiwellplatten gut messbar sein. Das MembraneKit ist also

für zelluläre, fluoreszenzoptische Messungen in 384er Multiwellplatten gut geeignet.

3.1.3 Fluoreszenzlebensdauer spannungssensitiver Farbstoffe

2

1

A

B

Abb. 3.4: Fluoreszenzeigenschaften des MembraneKit-

Farbstoffs. Wildtypzellen wurden mit dem MembraneKit

(in ES1K + ) inkubiert. Die Fluoreszenz der Zellen wurde

an einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen

(λ ex = 470 nm; λ em = 540 nm). Die Fluoreszenzintensität

und die Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoffes wurde

bestimmt. Durch eine gezielte Injektion wurde die

extrazelluläre Kalium-Konzentration auf 100 mM erhöht.

Die Fluoreszenz wurde erneut aufgenommen und die

Fluoreszenzlebensdauer bestimmt. (A) Fluoreszenzintensitäten

einer Zelle bei 1 mM (A1) und 100 mM [K + ] a

(A2). (B) zeigt die Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoffs

bei 1 mM (B1) bzw. (B2) 100 mM [K + ] a . Die

Fluoreszenzlebensdauer ist in Falschfarben dargestellt.

1 2 3 4

(ns)


Ergebnisse 42

Neben der Fluoreszenzintensität könnte auch die Fluoreszenzlebensdauer von

spannungsabhängigen Farbstoffen zur Bestimmung von V m herangezogen werden. Ich habe

deshalb den Einfluss des Membranpotenzials auf die Fluoreszenzlebensdauer verschiedener

Farbstoffe untersucht. Zellen wurden mit dem jeweiligen Farbstoff inkubiert und anschließend

wurde die Fluoreszenzintensität und die Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoffs in den Zellen

bestimmt. Dann wurde die extrazelluläre K + -Konzentration durch eine K + -Injektion von 1mM

auf 100 mM erhöht. Anschließend wurde die Fluoreszenzintensität und

Fluoreszenzlebensdauer erneut bestimmt Abbildung 3.4 zeigt eine Zelle, die mit dem

MembraneKit inkubiert wurde. Die K + -Injektion führt zu einem Anstieg der

Fluoreszenzintensität der Zelle (siehe Abb.3.4 A1/A2; ∆F/F ≈ 270%). Die

Fluoreszenzlebensdauer des MembraneKit-Farbstoffs wird durch die K + -Injektion jedoch

nicht beeinflusst (siehe Abb. 3.4 B1/B2). Tabelle 3.1 fasst die Ergebnisse der Experimente

mit verschiedenen „langsamen“ spannungsabhängigen Farbstoffen zusammen. Keiner der

untersuchten „langsamen“ Farbstoffe zeigte unter den gewählten Bedingungen eine

signifikante spannungsabhängige Änderung der Fluoreszenzlebensdauer.

Tab. 3.1: Einfluss des Membranpotenzials auf die Fluoreszenzlebensdauer „langsamer“

Farbstoffe

spannungssensitiver

Fluoreszenzlebensdauer (ns)

Farbstoff * 1 mM [K + ] a 100 mM [K + ] a

MembraneKit 1,1 1,0

DiSBAC 2 (3) 2,1 2,0

DiBAC 4 (3) 1,9 1,8

DiOC 2 (3) 2,7 2,5

DisC 3 (3) 3,4 3,4

Merocyanin 540 3,0 3,0

*Die Farbstoffkonzentration betrug jeweils 2 µM. Das MembraneKit wurde nach Herstellerangaben verwendet.

Die Fluoreszenz wurde bei 470 nm angeregt und bei 540 nm detektiert.

.


Ergebnisse 43

1

2

A

B

Abb. 3.5: Fluoreszenz von di-8-Anepps in

Abhängigkeit der Membranspannung.

Wildtypzellen wurden mit 2 µM di-8-Anepps

inkubiert. Nach ca. 20 Minuten wurde die

Farbstofflösung abgenommen und durch ES1K +

ersetzt. An einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop

wurde die Fluoreszenz der Zellen aufgenommen (λ ex

= 470 nm; λ em = 540 nm). Die Fluoreszenzintensität

und die Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoffes

wurde bestimmt. Anschließend wurde [K] a auf 100

mM erhöht. Die Fluoreszenzintensität wurde erneut

aufgenommen und die Fluoreszenzlebensdauer

bestimmt. (A) Fluoreszenzintensität bei 1 mM (A1)

und 100 mM [K + ] a (A2). (B) Fluoreszenzlebensdauer

des Farbstoffs bei 1 mM (B1) bzw. (B2)

100 mM [K + ] a . Die Fluoreszenzlebenszeit ist in

Falschfarben dargestellt.

1 2 3 4

(ns)

Tab. 3.2 Einfluss des Membranpotenzials auf die Fluoreszenzlebensdauer „schneller“ spannungssensitiver

Farbstoffe

Fluoreszenzlebensdauer (ns)

Farbstoff* 1 mM [K + ] a 100 mM [K + ] a

di-8-Anepps 3,8 3,7

RH-237 1,5 1,5

RH-421 2,8 2,7

RH-795 2,6 2,6

*Die Farbstoffkonzentration betrug jeweils 2 µM. Die Fluoreszenz wurde bei 470 nm angeregt und bei 540 nm

detektiert.

Neben den „langsamen“ Farbstoffen habe ich zusätzlich einige „schnelle“ spannungssensitive

Farbstoffe getestet. Abbildung 3.5 zeigt Zellen, die mit dem „schnellen“ Farbstoff di-8-

Anepps inkubiert wurden. Die Intensität der Fluoreszenz (A1, A2) und die Lebensdauer (B1,

B2) wurden vor und nach der K + -Injektion bestimmt. Durch die K + -Injektion nimmt die

Fluoreszenzintensität der Zellen leicht zu. Die Fluoreszenzlebensdauer von di-8-Anepps

(siehe Abb. 3.5 B1, B2) zeigt unter den hier gewählten Bedingungen dagegen keine

Spannungsabhängigkeit. Tabelle 3.2 fasst die Ergebnisse für die untersuchten „schnellen“

Farbstoffe zusammen. Keiner der Farbstoffe zeigte eine Änderung der

Fluoreszenzlebensdauer. Unabhängig davon verdeutlichen die Abbildungen 3.4 und 3.5 die

unterschiedlichen Eigenschaften „langsamer“ und „schneller“ Farbstoffen. Die mit dem

MembraneKit inkubierte Zelle zeigt eine eher gleichmäßig über die gesamte Zelle verteilte


Ergebnisse 44

Fluoreszenz (Abb. 3.4 A1/2). Es werden auch einige Membranstrukturen im Zellinneren

gefärbt. Der „schnelle“ Farbstoff di-8-Anepps befindet sich dagegen fast ausschließlich in der

Plasmamembran. Diese Verteilungsmuster sind für die jeweilige Farbstoffklasse

charakteristisch.

Zusammenfassung:

Von allen getesteten Farbstoffen ist das MembraneKit am besten für einen zellbasierten,

fluoreszenzoptischen HTS-Assay geeignet. Ich habe deshalb im weiteren Verlauf meiner

Arbeit das MembraneKit verwendet, um Membranpotenzialänderungen fluoreszenzoptisch

nachzuweisen. Die Fluoreszenzlebensdauer des MembraneKits zeigt keine

Spannungsabhängigkeit. Ich habe deshalb spannungsabhängige Änderungen der

Fluoreszenzintensität als Messparameter verwenden.


Ergebnisse 45

3.1.4 Charakterisierung der Zelllinien

3.1.4.1 Untersuchungen zum Membranpotenzial der Zellen

Ich habe untersucht, inwieweit das Membranpotenzial der Wildtypzellen von endogenen

Kaliumleitfähigkeiten und somit von E k bestimmt wird. Zum Vergleich wurden Zellen stabil

mit verschiedenen Kalium-Kanälen (bEAG1 oder hK ir 2.1) transfiziert und ebenfalls

untersucht. bEAG1 ist ein spannungsabhängiger Kalium-Kanal, der durch Depolarisation

aktiviert wird. hK ir 2.1 ist ein klassischer, einwärtsrektifizierender Ionenkanal. Im weiteren

Verlauf dieser Arbeit werden bEAG1 bzw. hK ir 2.1-Kanäle vereinfacht als EAG bzw. IRK

bezeichnet. In Anlehnung daran werden Zellen, die EAG bzw. IRK exprimieren, als EAG-

bzw. IRK-Zellen bezeichnet.

A Wildtyp EAG

800

700

IRK

[K] a

100

600

[K] a

∆F/F (%)

500

400

[K] a

100

30

300

200

100

0

200 s

100

30

10

1/3

200 s

30

10

3

1

200 s

10

3

1

B

C

D

∆F/F (%)

700

600

500

400

300

200

100

Wildtyp

EAG

IRK

(∆F/F) / pK +

350

300

250

200

150

100

50

Wildtyp

EAG

IRK

∆F/F (%)

500

450

400

350

300

250

200

150

100

50

IRK

EAG

Wildtyp

0

1 10 100

[K+] a

0

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

∆V M (mV)

Abb. 3.6: Änderungen der Fluoreszenzintensität nach Kalium-Injektion. Wildtyp-, EAG- und IRK-Zellen

auf 384er Multiwellplatten wurden mit dem MembraneKit inkubiert. Das MembraneKit wurde nach

Herstellerangaben in ES1K gelöst und in die Wells gegeben (54 µl pro Well). Im FlexMode des FlexStationII 384 -

Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität vor und nach der Injektion (6 µl) von KCl (Pfeil)

gemessen. Dargestellt ist die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf die gemittelte

Fluoreszenzintensität vor der KCl-Injektion. ∆F/F für 300-550 s nach KCl-Injektion (grauer Kasten) wurde in

(B) gegen [K + ] a aufgetragen: Mittelwerte von jeweils 4 (1 mM und 100 mM K + ) bzw. 8 Wells. Mit einer linearen

Regression wurden an die Datenpunkte Geraden angepasst. Die Steigungen dieser Geraden sind in (C)

aufgetragen. (D) An der Eichkurve für das MembraneKit (aus Abb. 3.3) lässt sich mit der in (B) ermittelten

Geradensteigung die Spannungsänderung abschätzen.


Ergebnisse 46

Die verschiedenen Zellen wurden zunächst mit dem MembraneKit inkubiert und die

Basisfluoreszenz der Zellen wurde bestimmt (hier nicht gezeigt). Die IRK-Zellen zeigten die

geringste, die Wildtypzellen die größte Basisfluoreszenz. Das deutet darauf hin, dass die IRK-

Zelllinie das negativste Membranpotenzial aufweist, gefolgt von der EAG-Zelllinie und den

Wildtypzellen.

Abbildung 3.6A zeigt den Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität der verschiedenen Zelllinien

nach einer K + -Injektion in das extrazelluläre Medium. Die K + -Konzentration wurde von 1mM

auf 3, 10, 30 bzw. 100 mM erhöht. Die Änderung der Fluoreszenzintensität ist bei Zellen, die

IRK exprimieren, mit (∆F/F) max ≈ 750% größer als bei Zellen, die EAG exprimieren (∆F/F max

≈ 400 %). Noch kleinere Änderungen zeigen die Wildtypzellen mit maximal ≈ 300%. In

Abbildung 3.6B wurden die Amplituden der Fluoreszenzsignale gegen die extrazelluläre K + -

Konzentration aufgetragen. An die Datenpunkte wurden Geraden angepasst und deren

Steigungen ((∆F/F)/pK) bestimmt. In Abbildung 3.6C sind diese Steigungen für die

verschiedenen Zellen aufgetragen. (∆F/F)/pK ist am größten für die IRK-Zelllinie (≈ 350%),

gefolgt von der EAG-Zelllinie (≈ 250%). Am geringsten ist die Steigung für die

Wildtypzellen (≈ 175%).

Eine Zelle, deren Membranpotenzial ausschließlich dem Nernst-Potenzial für Kalium (E K )

folgt, sollte nach der Nernst-Gleichung (2.10; Gleichung 2) eine Spannungsänderung von ≈

62 mV zeigen, wenn die extrazelluläre K + -Konzentration um eine Größenordnung erhöht

wird. Vergleicht man (∆F/F)/pK aus Abbildung 3.6 C und B mit der Kalibrierungskurve für

das MembraneKit (Abb.3.6 D), kann man die tatsächlichen Spannungsänderungen (∆V m /pK)

abschätzen. Für Zellen, die IRK bzw. EAG exprimieren liegt ∆V m /pK mit 68-72 mV bzw. 54-

58 mV nah an 62 mV, während ∆V m /pK mit ≈ 44 mV für die Wildtypzellen kleiner ist. Das

Membranpotenzial der Wildtypzellen wird also weniger von E K bestimmt als das

Membranpotenzial von Zellen, die EAG oder IRK exprimieren.


Ergebnisse 47

Ich habe nun den Einfluss heterolog exprimierter hHCN1- und hHCN4-Kanäle auf das

Membranpotenzial von Wildtypzellen und Zellen, die EAG exprimieren, untersucht. Es

wurden Untersuchungen mit einfachstabilen HCN1- und HCN4-Zelllinien und mit

doppeltstabilen HCN1/EAG- und HCN4/EAG –Zelllinien durchgeführt. Doppeltstabile IRK-

HCN-Zelllinien konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht hergestellt werden.

∆F/F (%)

∆F/F (%)

400

300

200

100

400

300

200

100

HCN1/EAG

+ ZD7288

+ Cs

+ Colforsin

EAG

+ ZD7288

+ Cs

+ Colforsin

A

C

0

0

1 10 100

1 10 100

[K + ] [K + ] a

a

0

1 10 100

[K + ] a

∆F/F (%)

(∆F/F)/pK +

Abb. 3.7: K + -Abhängigkeit des Membranpotenzials von HCN1/EAG- (A); HCN4/EAG- (B) und EAG-

Zelllinien (C). Die Zellen wurden auf 384er Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung (in ES1K + ),

bzw. MembraneKit-Lösung inklusive 2,5 µM ZD7288, 5 mM CsCl oder 10 µM Colforsin inkubiert. Im

KinetikMode des FlexStationII 384 -Systems wurde die Fluoreszenzintensität vor und nach der Injektion (6 µl)

von KCl (Pfeil) gemessen. [K+] a wurde durch die Injektion von 1mM auf 3, 10, 30 oder 100 mM erhöht.

Die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf den Mittelwert der

Flureszenzintensität vor der Injektion, wurde gegen [K + ] a aufgetragen: Mittelwerte von 4 (1mM und 100mM

K + ) bzw. 8 Wells. An die Datenpunkte wurden mit einer linearen Regression Geraden angepasst. Die

Steigungen dieser Geraden ((∆F/F)/pK) für die verschiedenen Zelllinien und unter den verschiedenen

Bedingungen sind in (D) aufgetragen.

400

300

200

100

275

250

225

200

175

150

125

100

75

50

25

Die Abbildungen 3.7 und 3.8 zeigen die Fluoreszenzänderungen (∆F/F) von HCN1/EAG-,

HCN4/EAG- (Abb. 3.7 A und B) sowie HCN1- und HCN4-Zellen (Abb. 3.8 A und B) nach

K + -Injektion ins extrazelluläre Medium. Es wurden Geraden an die Datensätze angepasst. Die

Steigungen dieser Geraden ((∆F/F)/pK) sind deutlich flacher bei Zellen, die HCN-Kanäle

exprimieren, als bei Zellen, die den EAG-Kanal alleine exprimieren. Die Steigung beträgt

175% und 185% für die HCN1/EAG- bzw. HCN4/EAG-Zelllinie im vergleich zu 240% bei

0

HCN4/EAG

+ ZD7288

+ Cs

+ Colforsin

HCN1/EAG

HCN4/EAG

EAG

+ ZD7288

+Cs +

B

D

+Colforsin


Ergebnisse 48

der EAG-Zelllinie. Ähnliche Ergebnisse ergeben sich für die einfachstabilen HCN-Zelllinien:

Dort betragen die Steigungen für die HCN1- und HCN4-Zelllinien 100% und 130%

gegenüber 175% für die Wildtypzellen. In Anwesenheit einer sättigenden Konzentration der

HCN-Kanal-Blocker ZD7288 bzw. Cs + war der Unterschied zwischen den HCN-Zelllinien

und den EAG- bzw. Wildtypzelllinien praktisch verschwunden (siehe Abbildungen 3.7D und

3.8D). Das zeigt, dass der Unterschied in ((∆F/F)/pK) auf die Aktivität der HCN-Kanäle

zurückzuführen ist

A

B

300

HCN1

+ ZD7288

+ Cs

+ Colforsin

300

HCN4

+ ZD7288

+ Cs

+ Colforsin

∆F/F (%)

200

∆F/F (%)

200

100

100

∆F/F (%)

0

0

1 10 100

1 10 100

[K + ] a

[K + ] a

300

200

100

C

(∆F/F)/pK +

D

Wildtyp

225

+ ZD7288

200

+ Cs

+ Colforsin

175

150

125

100

75

HCN1

HCN4

Wildtyp

50

25

0

1 10 100

0

+ ZD7288

+Cs +

+Colforsin

[K + ] a

Abb.3.8: K + -Abhängigkeit des Membranpotenzials der HCN1- (A); HCN4- (B) und Wildtypzelllinien

(C). Die Zellen wurden auf 384er Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung (in ES1K + ), bzw.

MembraneKit-Lösung inklusive 2,5 µM ZD7288, 5 mM CsCl oder 10 µM Colforsin inkubiert. Im

KinetikMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität vor und nach der

Injektion (6 µl) von KCl (Pfeil) gemessen. [K + ] a wurde durch die Injektion von 1mM auf 3, 10, 30 oder 100

mM erhöht. Die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf den Mittelwert der

Flureszenzintensität vor der Injektion, wurde gegen [K + ] a aufgetragen: Mittelwerte von 4 (1mM und 100 mM

K + ) bzw. 8 Wells. An die Datenpunkte wurden mit einer linearen Regression Geraden angepasst. Die

Steigungen dieser Geraden ((∆F/F)/pK) für die verschiedenen Zelllinien und unter den verschiedenen

Bedingungen sind in (D) aufgetragen.

Die Aktivität von HCN-Kanälen wird durch Bindung von cAMP erhöht. Colforsin, ein dem

Forskolin verwandter Wirkstoff, stimuliert Adenylatzyklasen und erhöht dadurch die

intrazelluläre cAMP-Konzentration. Die Zugabe einer sättigenden Konzentration von


Ergebnisse 49

Colforsin führt bei HCN4-Zelllinien zu einer noch geringeren K + -Abhängigkeit des

Membranpotentials (siehe Abb. 3.7D und Abb. 3.8D). Bei Zellen mit HCN1-Kanälen ist

dagegen kaum ein Effekt von Colforsin zu erkennen (siehe Abb. 3.7D und Abb. 3.8D). Dieses

Ergebnis stimmt damit überein, dass HCN4-Kanäle stärker durch cAMP aktiviert werden als

HCN1-Kanäle. Die Experimente zeigen, dass die HCN-Kanäle in den Zellsystemen aktiv sind

und zum Membranpotenzial beitragen. Im nächsten Schritt habe ich untersucht, ob die

Zellsysteme auch quantitative Messungen erlauben.

3.1.4.2 Untersuchungen mit bekannten HCN-Kanalblockern

Die vorangegangenen Kapitel haben gezeigt, dass es möglich ist, Änderungen der Aktivität

von HCN-Kanälen mit optischen Methoden nachzuweisen. Ich habe nun versucht diesen

Assay weiterzuentwickeln. Die Frage war, ob man auf die recht unphysiologische Injektion

von extrazellulärem Kalium verzichten kann. Um diese Frage zu beantworten, habe ich die

Wirkung von vier relativ spezifischen HCN-Kanalblockern (ZD7288, Ivabradine, ORGX und

Cs + ) auf die verschiedenen Zellsysteme quantitativ untersucht. Ich habe überprüft, ob der

Aktivierungszustand der HCN-Kanäle einen Einfluss auf die Wirksamkeit eines Blockers hat.

Dafür habe ich die HCN-Kanäle sowohl im „Wildtyphintergrund“ als auch in der

Kombination mit dem EAG-Kaliumkanal untersucht. Zudem habe ich, um den cAMP-freien

und den cAMP-gebundenen Zustand zu unterscheiden, alle Messungen sowohl in Ab- als

auch in Anwesenheit einer sättigenden Konzentration von Colforsin durchgeführt. Die

Wirkung der HCN-Kanal-Blocker wurde immer in zwei unterschiedlichen

Messkonfigurationen untersucht: Zunächst wurden die Wirkstoffe in verschiedenen

Konzentrationen zu den Zellen gegeben und es wurde gemessen, wie sich, je nach Potenz und

Konzentration des Wirkstoffs, das Membranpotenzial der Zellen ändert (Messkonfiguration

(1)). Anschließend wurde in einer zweiten Messung eine sättigende Konzentration eines

bekannten Blockers zu den Zellen gegeben und die Änderung des Membranpotenzials,

abhängig von der in (1) „vorgelegten“ Wirkstoffkonzentration, erneut verfolgt

(Messkonfiguration (2)). Ich habe durchweg beide Messkonfigurationen betrachtet, um die

Wirkstoffe möglichst genau zu charakterisieren.


600 s

Ergebnisse 50

ZENECA ZD7288

1 2 DW

Wildtyp

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

600 s

ZD7288 (µM)

1 / 2

3

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

0.01 0.1 1

[ZD7288] µM

5

ZD7288 (µM)

5

5

EAG

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

600 s

2 1

3

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

0.01 0.1 1

[ZD7288] µM

5

ZD7288 (µM)

5

5

IRK

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

600 s

1

2

3

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

0.01 0.1 1

[ZD7288] µM

Abb. 3.9: Wirkung von ZD7288 auf Kontrollzellen. (1) Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität der Wildtyp-, EAG

und IRK-Zelllinien vor und nach der Injektion von 6 µl ZD7288 (Endkonzentration 0,01 – 3 µM) zum

extrazellulären Medium. Die Zellen wurden auf 384er Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung (in ES)

pro Well inkubiert. Im KinetikMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität

in den Wells gemessen. Dargestellt ist die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf die

gemittelte Fluoreszenzintensität vor der ZD7288-Injektion ( Injektion von ES). Mittelwerte von jeweils 4

Wells. (2) In die Wells aus (1) wurde erneut ZD7288 injiziert. Diesmal in alle Wells eine Konzentration von 2 µM.

Der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität wurde vor und nach der 2. Injektion verfolgt ( in (1) wurde ES

vorgelegt). (DW) ∆F/F am Ende von (1) () bzw. (2) () wurde gegen die ZD7288-Konzentration ([ZD7288]) in

den Wells aufgetragen. ( = in (1) vorgelegte [ZD7288]).

Der Wirkstoff ZD7288 ist ein spezifischer HCN-Kanalblocker. Die Wirksamkeit von ZD7288

konnte in zahlreichen herzphysiologischen Studien nachgewiesen werden. Durch ZD7288

wird die I h -getragene, spontane diastolische Depolarisation verlangsamt. Daraus resultiert eine

Verlängerung des diastolischen Intervalls. ZD7288 führt so zu einer Abnahme der

Herzfrequenz, ohne dabei die Kontraktionskraft des Herzens zu vermindern (Überblick:

YUSUF & CAMM 2003). Submikromolare Konzentrationen von ZD7288 blockieren die I h -

Ströme in Sinusknotenmyozyten (BOSMITH ET AL., 1993; STURGESS ET.AL. ZENECA,

Cardiovascular Research Department, Poster). Bereits ≈ 400 nM ZD7288 führen zu einer

Reduktion des I h -Stroms um 50%. Zusätzlich wurde die Wirkung von ZD7288 auch auf


Ergebnisse 51

heterolog exprimierte HCN-Kanäle untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass ZD7288

von der intrazellulären Seite auf die Kanäle wirkt (ROTHENBERG ET AL., 2002). Die Bindung

und der daraus resultierende Block erfolgt nur bei Kanälen, die sich im offenen Zustand

befinden („open channel block“). Dabei ist der Block spannungsabhängig. Depolarisation

begünstigt die Wechselwirkung von ZD7288 mit den Kanälen, während bei lang anhaltender

Hyperpolarisation ZD7288 wieder vom Kanal abdissoziiert. Obwohl ZD7288 bereits seit

1992 verwendet wird, um selektiv I h -Ströme zu blockieren, ist der Blocker erstaunlich wenig

charakterisiert. Vor allem die Wirkung auf die verschiedenen HCN-Isoformen ist, bis auf

wenige Ausnahmen, nur wenig untersucht worden.

Ich habe zunächst untersucht, ob das Membranpotenzial meiner Kontrollzellen durch die

Zugabe des ZD7288-Wirkstoffs beeinflusst wird. Diese Information ist eine

Grundvoraussetzung, um HCN-spezifische Wirkungen von anderen Effekten unterscheiden zu

können. Beispielsweise könnte der Wirkstoffe mit dem Fluoreszenzfarbstoff wechselwirken

und so eine Änderung des Membranpotenzials vortäuschen. Andererseits könnte ZD7288

auch andere Proteine oder Zellfunktionen beeinflussen und so zu einer Änderung des

Membranpotenzials führen.

Abbildung 3.9 zeigt die Wirkung von ZD7288 auf Wildtyp-, EAG- und die IRK-Zelllinie.

Der jeweilige linke Teil zeigt die Messkonfiguration (1), also die Zugabe verschiedener

Konzentrationen des Wirkstoffs zu den Zelllinien. Der mittlere Teil der Abbildung zeigt

Messkonfiguration (2). Hier wurde, nachdem in (1) verschiedene ZD7288-Konzentrationen

vorgelegt wurden, eine sättigende ZD7288-Konzentration (2 µM) in alle Wells injiziert. Im

rechten Teil der Abbildung ist schließlich die Dosis-Wirkungs-Beziehung der beiden

Messungen gezeigt (DW).

In Abbildung 3.9 (1) ist der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität nach Injektion von

Pufferlösung (ES) in rot dargestellt. Man kann hier erkennen, dass die Fluoreszenzintensität

bei allen Zelllinien über die Messdauer von 90 min abnimmt. Man beobachtet bei den Zellen

diese Abnahme der Fluoreszenzintensität sogar ohne Injektion (hier nicht gezeigt). Das

Ausmaß und die Kinetik dieser unspezifischen Fluoreszenzabnahme ist bei den Zelllinien

unterschiedlich. Ob es sich hierbei um Membranpotenzialänderungen oder lediglich um

Alterungsprozesse der Zellen oder des Farbstoffs handelt ist unklar.

Bei ZD7288-Konzentrationen < 1 µM zeigt sich in (1) ein Fluoreszenzverlauf, der nicht von

einer ES-Injektion zu unterscheiden ist. Konzentrationen von ≥ 1 µM führen dagegen zu einer

zusätzlichen Abnahme der Fluoreszenzintensität. Die Ursache für diesen Effekt von hohen

ZD7288-Konzentrationen ist unklar. Ob sich hier tatsächlich das Membranpotenzial ändert,


Ergebnisse 52

ist nicht bekannt. Der Wirkstoff könnte bei diesen Konzentrationen auch mit dem

Fluoreszenzfarbstoff wechselwirken. Wichtig ist dieser Effekt für die Untersuchung der

Wirkung von ZD7288 auf die HCN-Kanalzelllinien: Diese HCN-unabhängige Wirkung von

ZD7288 könnte die Dosis-Wirkungs-Kurven verfälschen.

Betrachtet man nun den mittleren Teil von Abbildung 3.9, die sogenannte „Messkonfiguration

(2)“, so fällt auf, dass die langsame Fluoreszenzabnahme aus (1) hier nicht mehr beobachtet

wird. Unabhängig von der in (1) vorgelegten ZD7288-Konzentration ergibt sich, nach

Injektion von 2 µM ZD7288, für alle Zelllinien eine Fluoreszenzabnahme von etwa 5%. Da in

alle Wells die gleiche Wirkstoffkonzentration zugegeben wurde, sieht man hier keinen

konzentrationsabhängigen Effekt.

Diese Kontrollmessungen bilden eine ausgezeichnete Basis für die quantitative Bestimmung

der Wirkung von ZD7288 auf die verschiedenen HCN-Zelllinien. Obwohl Messkonfiguration

(2), also das Vorlegen verschiedener Wirkstoffkonzentrationen, weniger anfällig für HCN-

Kanal unabhängige Wirkungen ist, hat Messkonfiguration (1) auch ihre Vorteile.

Messkonfiguration (1) liefert wichtige Informationen über den Wirkungsmechanismus eines

Blockers. Hier lässt sich anhand der Kinetik untersuchen, ob die Wirkung einer Substanz vom

Aktivierungszustand des Kanals abhängt und von welcher Seite der Membran eine Substanz

wirkt.

Abbildung 3.10 zeigt den Einfluss von ZD7288 auf die verschiedenen HCN-Kanallinien und

für die beiden HCN4-Zelllinien auch in Gegenwart von Colforsin (5 µM). In allen Fällen

beobachtet man eine deutliche, dosisabhängige Abnahme der Fluoreszenzintensität. Das

Ausmaß und die Kinetik der Fluoresznezänderung unterscheidet sich zwischen den einzelnen

Zelllinien (siehe Abb. 3.10 links): Die schnellsten und größten Signale (∆F/F ≈ -30%)

beobachtet man bei Zelllinien mit HCN1. Deutlich langsamer und mit kleineren Signalen

reagieren Zellen, die HCN4 exprimieren.


Ergebnisse 53

(A)

HCN1

Flp-hHCN1

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

DW1 (1) DW2 (2) Hill-Fit

DW1

ZD7288 (µM)

0.01

0.03

0.1

0.3

1

2

3

600 s

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600

ZD7288 (µM)

3

2

1

0.3

0.1

0.03

0.01

∆F/F (%)

DW1

0

DW2

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

0.01 0.1 1 10

[ZD7288] µM

(B)

HCN1/EAG

Flp-hHCN1/bEAG1

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

ZD7288 (µM)

0.01

0.03

0.1

0.3

1

2

3

600 s

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

ZD7288 (µM)

3

2

1

0.3

0.1

0.03

0.01

-5

-10

-15

-20

-25

-30

0.01 0.1 1 10

DW1 DW2 ZD7288 Hill-Fit

(µM)

∆F/F (%)

0

DW1

DW2

0

ZD7288 (µM)

0

ZD7288 (µM)

-5

DW1

DW2

(A)

HCN4

Flp-hHCN4

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

-25

0

600 s

0.01

0.03

0.1

0.3

1

2/3

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

ZD7288 (µM)

0

600 s

3

2

1

0.3

0.1

0.03

0.01

ZD7288 (µM)

∆F/F (%)

-10

-15

-20

-25

-30

0.01 0.1 1 10

[ZD7288] µM

-5

DW1

DW2

(B)

HCN4/EAG

Flp-hHCN4/bEAG1

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

0.01

0.03

0.1

0.3

1

2

3

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

600 s

3

2

1

0.3

0.1

0.03

0.01

-10

-15

-20

-25

-30

0.01 0.1 1 10

[ZD7288] µM

DW1 DW2 Hill-Fit

∆F/F (%)

HCN4

(A)

+ Flp-hHCN4

Colforsin

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

0

600 s

ZD7288 (µM)

0.01

0.03

0.1

0.3

1

2

3

ZD7288 (µM)

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

0

600 s

ZD7288 (µM)

3

2

1

0.3

0.1

0.03

0.01

ZD7288 (µM)

DW1

0

DW2

-5

-10

∆F/F (%)

-15

-20

-25

-30

-35

0.01 0.1 1 10

[ZD7288] µM

DW1

-5

DW2

HCN4/EAG

(B)

Flp-hHCN4/bEAG1

+Colforsin

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

0.1

0.3

1

2

3

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

0.01

0.03

0.1

0.3

2

1

3

∆F/F (%)

-10

-15

-20

-25

0.01 0.1 1 10

[ZD7288] µM


Ergebnisse 54

Abb. 3.10: Wirkung von ZD7288 auf Zellen, die HCN-Kanäle exprimieren. (1) Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität der HCN1-, HCN1/EAG- bzw. HCN4- und HCN4/EAG-Zelllinien vor und nach der

Injektion von 6 µl ZD7288 zum extrazellulären Medium. Die Zellen wurden auf 384er Multiwellplatten mit 54

µl MembraneKit-Lösung (in ES, bei HCN4-Zelllinien auch in Anwesenheit von 5 µM Colforsin) pro Well

inkubiert. Im KinetikMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität in

den Wells gemessen. Dargestellt ist die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf

die gemittelte Fluoreszenzintensität vor der ZD7288-Injektion ( Injektion von ES): Mittelwerte von jeweils

4 Wells. (2) In die Wells aus (1) wurde erneut ZD7288 injiziert (2 µM). Der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität wurde vor und nach dieser 2. Injektion verfolgt. ( in (1) wurde ES vorgelegt). (DW)

∆F/F am Ende von (1) () bzw. (2) () wurde gegen die ZD7288-Konzentration ([ZD7288]) in den Wells

aufgetragen ( = in (1) vorgelegte [ZD7288]). An die Werte für ∆F/F aus (1) und (2) wurden mit der Hill-

Gleichung Dosis-Wirkungs-Kurven angepasst (DW1 und DW2).

Die Anwesenheit von Colforsin hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse für HCN1 (hier nicht

gezeigt). Bei den HCN4-Zelllinien ist jedoch in Anwesenheit von Colforsin die Kinetik der

Fluoreszenzabnahme schneller und die Amplituden sind größer. Man kann bei praktisch

keiner der Messungen in Messkonfiguration (1) eine dosisabhängige Sättigung der

Fluoreszenzantworten beobachten. Die Ursache hierfür ist der HCN-unabhängige Effekt bei

hohen ZD7288-Konzentrationen. Dieser Effekt macht sich auch in der Dosis-Wirkungs-Kurve

bemerkbar (DW1 in Teilabbildung DW). Die Dosis-Wirkungs-Kurven wurden mit der Hill-

Gleichung mit vier freien Parametern angepasst (2.10, Gleichung 3).

Im mittleren Abbildungsteil (2) sind die Messungen bei vorgelegter Wirkstoffkonzentration

(Messkonfiguration (2)) dargestellt. Die Amplituden am Ende der Messung wurden ermittelt

und als DW2 (siehe Abb. 3.10 DW) gegen die vorgelegte Wirkstoffkonzentration

aufgetragen. Wie kommt es, dass die Dosis-Wirkungs-Kurven der beiden

Messkonfigurationen (DW1 und DW2) entgegengesetzt verlaufen? Im ersten Fall (DW1)

wird der Effekt verschiedener Wirkstoffkonzentrationen direkt gemessen. Hier führt die

größte Wirkstoffkonzentration auch zu der größten Fluoreszenzantwort. Im zweiten Fall

(DW2) wird die Wirkung der Substanz „indirekt“ bestimmt. Wenn durch das „Vorlegen“

einer bestimmten Wirkstoffkonzentration bereits die maximale Wirkung auf die HCN-Kanäle

erzielt wurde, so hat die erneute Injektion einer sättigenden Wirkstoffkonzentration keinen

weiteren Effekt. Werden jedoch Wirkstoffkonzentrationen vorgelegt, die nur eine sehr

geringen oder keine Wirkung auf die HCN-Kanäle haben, beobachtet man bei Injektion von

sättigenden Wirkstoffkonzentrationen eine dementsprechend große Fluoreszenzantwort. In

Tabelle 3.3 sind die Parameter der Dosis-Wirkungs-Kurven für die Wirkung von ZD7288 für

die verschiedenen Zelllinien und Bedingungen dargestellt.


Ergebnisse 55

Tab.: 3.3 Parameter der Dosis-Wirkungs-Kurven für ZD7288 aus Abbildung 3.10

Amplitude (%) EC50 [ZD7288] µM Hill-Koeffizient

DW1 DW2 DW1 DW2 DW1 DW2

HCN1 -36 -28 0,28 ± 0,02 0,28 ± 0,01 1,1 ± 0,1 1,4± 0,1

HCN1/EAG -29 -19 0,52 ± 0,05 0,4 ± 0,01 0,9 ± 0,05 1,3 ± 0,1

HCN4 -21 -13 0,69 ± 0,14 0,39 ± 0,04 1,1 ± 0,1 1,8± 0,1

HCN4/EAG -24 -15 0,94 ± 0,13 0,42 ± 0,09 0,9 ± 0,05 1,4 ± 0,4

In Anwesenheit von Colforsin

HCN4 -26 -20 0,62 ± 0,13 0,45 ± 0,04 2,0± 0,1 1,8± 0,2

HCN4/EAG -16 -16 0,57 ± 0,06 0,49 ± 0,03 0,9 ± 0,05 1,6 ± 0,1

Die wichtigsten Werte sind die Amplituden und die EC50-Werte. Man muss bedenken, dass

in die Dosis-Wirkungs-Kurven DW1 in Messkonfiguration (1) die HCN-unabhängigen

Effekte von ZD7288 eingehen. Deshalb ist hier die Amplitude leicht überschätzt. Die

zuverlässigere Aussage über die HCN-spezifische Abnahme der Fluoreszenzintensität liefert

in diesem Fall DW2. Durch den Vergleich der Amplituden von DW2 mit der

Kalibrierungsgerade für das MembraneKit, lassen sich die Membranpotenzialänderungen

abschätzen. ZD7288 führt bei HCN4- und HCN1-Zellen zu einer Hyperpolarisation von 5-8

bzw. 8-11 mV. Dabei zeigen die HCN4-Zelllinien eine größere Hyperpolarisation in

Anwesenheit von Colforsin.

Die EC50-Werte liegen im submikromolaren Bereich (≈ 400 nM) und sind nur wenig

verschieden für die beiden HCN-Kanalisoformen. Bei diesen Konzentrationen wird, wie

eingangs erwähnt, auch die Wirkung von ZD7288 auf den I h -Strom im Herzen beschrieben.

Da für alle getesteten Blocker bekannt war, dass jeweils ein Molekül pro Kanal bindet, wurde

dem Hill-Koeffizient bei der Interpretation der Ergebnisse keine entscheidende Bedeutung

zugemessen. Der Hill-Koeffizient liegt bei den Dosis-Wirkungs-Kurven zwischen 1,6 - 1,3

und somit ebenfalls in einem realistischen Bereich. Der Assay ermöglicht in dieser Form also

quantitative Aussagen über die Wirkung von Substanzen auf HCN-Kanäle.


60 0 s

Ergebnisse 56

Ivabradine

1 2 DW

∆F/F (%)

(%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

600 s

Ivabradine (µM)

3

30

60

100

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

0.1 1 10 100

[Ivabradine] µM

∆F/F (%) ∆F/F (%)

∆F (%)

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

600 s

600 s

Ivabradine (µM)

30

60

100

Ivabradin (µM)

60

30

100

∆F/F (%)

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

600 s

∆F/F (%)

(%)

∆F ∆F/F (%)

(%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

0.1 1 10 100

[Ivabradine] µM

0

-5

-10

-15

-20

-25

0.1 1 10 100

[Ivabradine] µM

Abb. 3.11: Wirkung von Ivabradine auf die Kontrollzellen. (1) Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität der

Wildtyp-, EAG und IRK-Zelllinien vor und nach der Injektion von 6 µl Ivabradine zum extrazellulären

Medium. Die Zellen wurden dazu auf 384er Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung (in ES) pro

Well inkubiert. Im KinetikMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität

in den Wells gemessen. Dargestellt ist die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf

die gemittelte Fluoreszenzintensität vor der Ivabradine-Injektion ( Injektion von ES): Mittelwerte von

jeweils 4 Wells. (2) In die Wells aus (1) wurde anschließend ZD7288 injiziert (2 µM). Der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität wurde vor und nach dieser 2. Injektion verfolgt. ( in (1) wurde ES vorgelegt). (DW)

∆F/F am Ende von (1) () bzw. (2) () wurde gegen die Ivabradine-Konzentration ([Ivabradine]) in den

Wells aufgetragen.

Freundlicherweise wurde mir von der Firma Servier der HCN-spezifische Wirkstoff

Ivabradine zu Verfügung gestellt. ZD7288 und Ivabradine zeigen viele Gemeinsamkeiten.

Ivabradine führt ebenfalls zu einer Abnahme der Herzfrequenz. Die Wirkung von Ivabradine

auf I h -Ströme in Sinusknotenmyozyten ist detailliert untersucht worden (BUCCHI ET AL. 2002).

Ivabradine wirkt von der intrazellulären Seite auf die HCN-Kanäle und blockiert nur den

offenen Kanal. Die Spannungsabhängigkeit des Blocks durch Ivabradine ist ähnlich wie bei

ZD7288. Je positiver das Membranpotenzial, desto effektiver wird I h blockiert. Was

Ivabradine von ZD7288 unterscheidet ist, dass Ivabradine bis heute der einzige HCNspezifische

Wirkstoff ist, der in weiterführenden klinischen Studien für die Therapie von

Herzerkrankungen, wie z.B. Sinustachykardien, getestet wird (BORER ET AL., 2003).


Ergebnisse 57

Ivabradine zeigt im Gegensatz zu ZD7288 erstaunlich geringe zentralnervöse

Nebenwirkungen. Die Substanz scheint überaus selektiv I h -Ströme im Herzen zu blockieren.

Die Ursache für die vornehmlich herzspezifische Wirkung ist bisher nicht bekannt. Der

Einfluss von Ivabradine auf die verschiedenen HCN-Kanalisoformen ist nicht dokumentiert.

Die Wirkung wurde bisher ausschließlich an nativen Kanälen untersucht. Erst kürzlich wurde

zum ersten Mal die Wirkung von Ivabradine auf einen heterolog exprimierten HCN-Kanal

(HCN3) beschrieben (MISTRIK, 2005). Eine detaillierte Analyse der Ivabradine-Wirkung

wurde jedoch auch hier nicht vorgenommen.

Ich habe zunächst die Wirkung von Ivabradine auf die verschiedenen Kontrollzellen

untersucht (Abb. 3.11). Die Ergebnisse sind ähnlich wie die bei ZD7288: In

Messkonfiguration (1) (Abb. 3.11 links) beobachtet man eine Abnahme der Fluoreszenz mit

der Zeit. Zusätzlich bewirken sehr hohe Dosen von Ivabradine (≥ 30 µM) eine weitere

Abnahme der Fluoreszenzintensität. Messkonfiguration (2) (mittlere Teilabbildungen) zeigt

den Fluoreszenzverlauf nach Injektion von 2 µM ZD7288 nachdem in (1) verschiedene

Ivabradine Konzentrationen vorgelegt wurden. Rechts sind wiederum die Dosis-Wirkungs-

Beziehungen dargestellt.


Ergebnisse 58

1 2 DW

HCN1

∆F/F ∆F (%)

(%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

600 s

Ivabradine (µM)

0.1

0.3

1

3

10

30

60

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

600 s

Ivabradin (µM)

60

30

10

3

1

0.3

0.1

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

0.1 1 10 100

[Ivabradine] µM

DW1

DW2

HCN1/EAG

∆F/F ∆F (%)

(%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

Ivabradine (µM)

0.1

0.3

1

3

10

30

60

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

Ivabradin (µM)

60

30

10

3

1

0.3

0.1

∆F/F ∆F/F (%)

(%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

0.1 1 10 100

[Ivabradine] µM

DW1

DW2

5

Ivabradine (µM)

5

Ivabradine (µM)

-5

0

0

-10

HCN4

HCN4/EAG

∆F/F (%) ∆F/F (%)

∆F (%)

∆F (%)

-5

-10

-15

-20

-25

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

600 s

10

30

100

Ivabradine (µM)

30

100

∆F/F (%)

(%)

∆F/F (%)

∆F (%)

-5

-10

-15

-20

5

0

-5

-10

-15

-20

600

600 s

100

30

Ivabradine (µM)

100

∆F/F ∆F (%)

(%)

∆F/F (%)

-15

-20

-25

-30

0.1 1 10 100

[Ivabradine] µM

0

-5

-10

-15

-20

-25

0.1 1 10 100

[Ivabradine] µM

Abb. 3.12: Wirkung von Ivabradine auf Zellen, die HCN-Kanäle exprimieren. (1) Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität der HCN1-, HCN1/EAG- bzw. HCN4- und HCN4/EAG-Zelllinien vor und nach der

Injektion von 6 µl Ivabradine zum extrazellulären Medium. Die Zellen wurden dazu auf 384er

Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung (in ES) pro Well inkubiert. Im KinetikMode des

FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität in den Wells gemessen. Dargestellt

ist die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf die gemittelte

Fluoreszenzintensität vor der Ivabradine-Injektion ( Injektion von ES): Mittelwerte von jeweils 4 Wells.

(2) In die Wells aus (1) wurde anschließend ZD7288 injiziert (2 µM). Der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität wurde vor und nach dieser 2. Injektion verfolgt. ( in (1) wurde ES vorgelegt). (DW)

∆F/F am Ende von (1) () bzw. (2) () wurde gegen die Ivabradine-Konzentration ([Ivabradine]) in den

Wells aufgetragen. An die Werte für ∆F/F aus (1) und (2) wurden für die HCN1-Zelllinien mit der Hill-

Gleichung Dosis-Wirkungs-Kurven angepasst (DW1 und DW2).


Ergebnisse 59

Abbildung 3.12 zeigt die Wirkung von Ivabradine auf Zellen, die HCN1 bzw. HCN4

exprimieren. Bei den Zelllinien mit HCN1-Kanälen beobachtet man eine robuste,

dosisabhängige Fluoreszenzantwort in beiden Messkonfigurationen. Die Dosis-Wirkungs-

Kurven sind im rechten Teil der Abbildung gezeigt. Tabelle 3.4 zeigt die Parameter für die

Dosis-Wirkungskurven im Überblick.

Tab. 3.4: Parameter der Dosis-Wirkungs-Kurven für Ivabradine aus Abbildung 3.12.

Amplitude (%) EC50 [Ivabradine] µM Hill-Koeffizient

DW1 DW2 DW1 DW2 DW1 DW2

HCN1 -38 -29 2,5 ± 0,2 3,1 ± 0,2 1,3 ± 0,1 1,4± 0,1

HCN1/EAG -25 -22 1,4 ± 0,1 1,76 ± 0,1 1,1 ± 0,1 1,2 ± 0,1

Für HCN1 liegt der EC50-Wert für Ivabradine bei ≈ 2 µM. BUCCHI ET AL. (2002) bestimmten

für die Wirkung von Ivabradine auf I h -Ströme in Sinusknotenmyozyten einen EC50-Wert von

1,5 µM. Betrachtet man die Amplituden der Dosis-Wirkungs-Kurven kann man auch hier eine

Hyperpolarisation der Zellen von 10-12 mV abschätzen.

Überraschend war das Ergebnis für die Zelllinien mit HCN4 Kanälen: eine signifikante

Wirkung von Ivabradine beobachtet man erst bei Konzentrationen oberhalb von 30 µM. Das

ist mehr als eine Größenordnung über Konzentrationen, die bei HCN1 schon halbmaximale

Effekte hervorrufen. Wegen des HCN-unabhängigen Effektes bei hohen Ivabradine-

Konzentrationen erschien es nicht sinnvoll Ivabradine-Konzentrationen > 100 µM

einzusetzen. Mit der Hill-Gleichung konnte an die Datenpunkte für HCN4 keine Dosis-

Wirkungs-Kurve angepasst werden.

Sowohl bei den HCN1-Zelllinien als auch bei den HCN4-Zelllinien hatte die Anwesenheit

von Colforsin keinen wesentlichen Einfluss auf die Fluoreszenzantworten (hier nicht

gezeigt). Ich werde die unterschiedliche Wirkung von Ivabradine auf die verschiedenen HCN-

Kanalisoformen in der Diskussion erörtern.


Ergebnisse 60

ORGX

1 2 DW

Wildtyp

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

600 s

ORGX (µM)

3

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

0.01 0.1 1

[ORGX] µM

5

ORGX (µM)

5

0

0

0

-5

EAG

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

3

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

∆F/F (%)

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

-25

-30

600 s

-25

-30

0.01 0.1 1

[ORGX] µM

IRK

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

ORGX (µM)

3

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

0.01 0.1 1

ORGX (µM)

Abb. 3.13: Wirkung von ORGX auf die Kontrollzellen. (1) Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität der

Wildtyp-, EAG und IRK-Zelllinien vor und nach der Injektion von 6 µl ORGX zum extrazellulären Medium.

Die Zellen wurden dazu auf 384er Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung (in ES) pro Well

inkubiert. Im KinetikMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität in

den Wells gemessen. Dargestellt ist die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf

die gemittelte Fluoreszenzintensität vor der ORGX-Injektion ( Injektion von ES): Mittelwerte von jeweils 4

Wells. (2) In die Wells aus (1) wurde anschließend ZD7288 injiziert (2 µM). Der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität wurde vor und nach dieser 2. Injektion verfolgt. ( in (1) wurde ES vorgelegt). (DW)

∆F/F am Ende von (1) () bzw. (2) () wurde gegen die ORGX-Konzentration ([ORGX]) in den Wells

aufgetragen.

Von der Firma Organon habe ich den HCN-Kanalblocker ORGX zur Verfügung gestellt

bekommen. Über Spezifizität, EC50-Werte und Wirkungsmechanismus dieser Substanz war

nichts bekannt. Abbildung 3.13 zeigt die Wirkung von ORGX auf die Kontrollzellen. Der

Verlauf der Fluoreszenzintensität ist wieder vergleichbar mit dem der anderen getesteten

Blocker. Bei hohen Konzentrationen von ORGX (≥ 3 µM) beobachtet man, dass die

Fluoreszenzabnahme über die Messdauer geringer ist als nach der Injektion von Pufferlösung

(ES).


Ergebnisse 61

1 2 DW

0

ORGX (µM)

0

ORG (µM)

ORGX (µM)

-5

DW1

DW2

HCN1

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

0.01

0.03

0.1

0.3

1/2/3

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

1/2/3

0.3

0.1

0.03

0.01

∆F/F (%)

-10

-15

-20

-25

-30

0.001 0.01 0.1 1 10

ORGX (µM)

HCN1/EAG

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

600 s

ORGX ORGX (µM)

(µM)

0.01

0.03

0.1

0.3

1/2/3

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

ORGX (µM)

1/2/3

0.3

0.1

0.03

0.01

∆F/F (%)

DW1

DW2

-5

-10

-15

-20

0.001 0.01 0.1 1 10

ORGX (µM)

HCN4

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

ORGX (µM)

0.01

0.03

0.1

0.3

3

1/2

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

ORGX (µM)

-5

ORGX (µM)

3

2 -10

1

0.3

0.1

-15

0.03

0.01

-20

∆F/F (%)

HCN4/EAG

∆F/F (%)

-25

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

600 s

ORG ORGX (µM)

(µM)

0.01

0.03

0.1

0.3

1/2/3

∆F/F (%)

-25

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

600 s

ORGX (µM)

1/2/3

0.3

0.1

0.03

0.01

∆F/F (%)

-25

0.01 0.1 1 10

[ORGX] µM

-5

-10

-15

-20

-25

0.01 0.1 1 10

[ORGX] µM

HCN4

+Colforsin

HCN4/EAG

+Colforsin

∆F/F (%)

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

0

-5

-10

-15

-20

600 s

600 s

ORGX (µM)

0.01

0.03

0.1

0.3

1/2

3

ORGX ORGX (µM)

(µM)

0.01

0.03

0.1

0.3

1/2/3

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

600 s

ORGX (µM)

1/2/3

0.3

0.1

0.03

0.01

ORG (µM)

ORGX (µM)

2/3

1

0.3

0.1

0.03

0.01

DW1

DW2

-5

-10

∆F/F (%)

-15

-20

-25

0.01 0.1 1 10

[ORGX] µM

DW1

-5

DW1

∆F/F (%)

-10

-15

-20

-25

0.01 0.1 1 10

[ORGX] µM


Ergebnisse 62

Abb. 3.14: Wirkung von ORGX auf Zellen, die HCN-Kanäle exprimieren. (1) Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität der HCN1-, HCN1/EAG- bzw. HCN4- und HCN4/EAG-Zelllinien vor und nach der

Injektion von 6 µl ORGX zum extrazellulären Medium. Die Zellen wurden auf 384er Multiwellplatten mit

54 µl MembraneKit-Lösung (in ES, bei HCN4-Zelllinien auch in Anwesenheit von 5 µM Colforsin) pro

Well inkubiert. Im KinetikMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität in den Wells gemessen. Dargestellt ist die prozentuale Änderung der

Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf die gemittelte Fluoreszenzintensität vor der ORGX-Injektion (

Injektion von ES): Mittelwerte von jeweils 4 Wells. (2) In die Wells aus (1) wurde anschließend ZD7288

injiziert (2 µM). Der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität wurde vor und nach dieser 2. Injektion verfolgt.

( in (1) wurde nur ES vorgelegt). (DW) ∆F/F am Ende von (1) () bzw. (2) () wurde gegen die ORGX-

Konzentration ([ORGX]) in den Wells aufgetragen. An die Werte für ∆F/F aus (1) und (2) wurden mit der

Hill-Gleichung Dosis-Wirkungs-Kurven angepasst (DW1 und DW2).

Abbildung 3.14 zeigt die Wirkung von ORGX auf die HCN-Kanalzelllinien. Man beobachtet

eine robuste, dosisabhängige Fluoreszenzabnahme. Die Amplituden sind bei den HCN1-

Zelllinien mit 20-30% deutlich größer als bei den HCN4-Zelllinien, die 6-10% (ohne

Colforsin) und 10-15% (mit 5 µM Colforsin) betragen. Auch die Kinetik der ORGX-Wirkung

ist bei den Zelllinien unterschiedlich: Bei Zellen mit HCN1 erreicht die Fluoreszenzintensität

innerhalb der 90 minütigen Messdauer einen neuen Gleichgewichtszustand. Anders bei Zellen

mit HCN4: Ohne Colforsin erreicht die Fluoreszenzintensität bei keiner

Wirkstoffkonzentration einen neuen Gleichgewichtszustand. Auch die Gesamtamplituden von

6% und 9% erscheinen sehr gering. In diesem Fall wird der wahre Wert für die Amplituden

unterschätzt, da das System noch nicht im Gleichgewicht ist. Die entsprechende Dosis-

Wirkungs-Kurve (DW1 in Abb. 3.14 DW) ist daher kritisch zu betrachten. Colforsin

beeinflusst hier die Situation deutlich. In Gegenwart von Colforsin erreicht die

Fluoreszenzintensität bei ORGX-Konzentrationen ≥0,3 µM innerhalb der Messdauer einen

stabilen Gleichgewichtszustand. Die Gesamtamplituden sind unter diesen Umständen größer

(11-16%). Tabelle 3.5 fasst die Ergebnisse der Experimente mit ORGX zusammen. Man kann

erkennen, dass die Zelllinien mit HCN1-Kanälen eindeutig niedrigere EC50-Wert aufweisen

(≈50 nM), als die Zellen mit HCN4 (≈ 250 nM).

Ich konnte zeigen, dass der Wirkstoff ORGX sowohl HCN1 als auch HCN4-Kanäle blockiert.

Vergleicht man die Kinetik der Fluoreszenzantworten auf ORGX mit denen auf Ivabradine

oder ZD7288 kommt man zu dem Schluss, dass ORGX wahrscheinlich auch von der

intrazellulären Seite auf die Kanäle wirkt. Die Werte für die Hyperpolarisation der

verschiedenen Zelllinien liegen bei ORGX im Bereich von ≈5-10 mV. Die HCN4-Zelllinien

zeigen dabei in Anwesenheit von Colforsin eine größere Hyperpolarisation als in

Abwesenheit von Colforsin.


Ergebnisse 63

Tab. 3.5: Parameter der Dosis-Wirkungs-Kurven für ORGX aus Abbildung 3.14

Amplitude (%) EC50 [ORGX] nM Hill-Koeffizient

DW1 DW2 DW1 DW2 DW1 DW2

HCN1 -29 -23 27 ± 2 50 ± 0,7 0,9 ± 0,0 1,2± 0,1

HCN1/EAG -19 -21 85 ± 8 45 ± 0,4 0,8 ± 0,09 0,7 ± 0,2

HCN4 -6 11 115 ± 30 219 ± 134 1,9 ± 1,2 1± 0,6

HCN4/EAG -9 -14 328 ± 63 500 ± 133 1,6 ± 0,5 1,0 ± 0,1

In Anwesenheit von Colforsin

HCN4 -16 -20 300± 70 192 ± 14 1,3± 0,4 1,1± 0,1

HCN4/EAG -11 -16 240 ± 27 247 ± 28 1,2 ± 0,1 0,6 ± 0,1


Ergebnisse 64

Cs +

1 2 DW

10

Cs CsCl + (mM)

(mM)

10

5

Wildtyp

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

10 s

1

5

10

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

10 s

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

0.1 1 10

[CsCl] mM

EAG

∆F/F (%)

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

10 s

CsCl + (mM)

(mM)

1

5

10

∆F/F (%)

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

10 s

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

0.1 1 10

[CsCl] mM

5

Cs+ (mM)

CsCl (mM)

5

5

IRK

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

0,5

1

5

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

10 s

10

-25

-30

10 s

-25

-30

0.1 1 10

[CsCl] mM

Abb. 3.15: Wirkung von Cs + auf die Kontrollzellen. (1) Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität der

Wildtyp-, EAG- und IRK-Zelllinien vor und nach der Injektion von 6 µl CsCl zum extrazellulären Medium

Die Zellen wurden dazu auf 384er Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung (in ES) pro Well

inkubiert. Im FlexMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität in den

Wells gemessen. Dargestellt ist die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf die

gemittelte Fluoreszenzintensität vor der CsCl-Injektion ( Injektion von ES): Mittelwerte von jeweils 4

Wells. (2) In die Wells aus (1) wurde anschließend erneut CsCl injiziert (5 mM). Der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität wurde vor und nach dieser 2. Injektion verfolgt. ( in (1) wurde nur ES vorgelegt).

(DW) ∆F/F am Ende von (1) () bzw. (2) () wurde gegen die CsCl-Konzentration ([CsCl]) in den Wells

aufgetragen. ( = in (1) vorgelegte CsCl-Konzentration

Cs + als anorganisches Kation fällt bei der Untersuchung der „spezifischen“ HCN-

Kanalblocker sicherlich aus dem Rahmen. Schließlich ist bekannt, dass auch viele K + -Kanäle

durch Cs + blockiert werden (z.B. Hille 2001). Zu der Zeit, als die nativen HCN-Kanäle

charakterisiert wurden, waren jedoch einige Eigenschaften dieses Cs + -Blocks tatsächlich

einzigartig und zuvor noch nicht beobachtet worden. Cs + blockiert HCN-Kanäle von der

extrazellulären Seite der Membran und wirkt bei recht niedrigen Konzentrationen: Die

Konzentration für den halbmaximalen Block der Kanäle ist spannungsabhängig und liegt

zwischen ≈ 0,1 mM und 3 mM. Abbildung 3.15 zeigt die Wirkung von Cs + auf die

Kontrollzelllinien. Da die Wirkung von Cs + von der extrazellulären Seite erfolgt, muss die


Ergebnisse 65

Kinetik der Wirkung schneller sein als bei den bisher untersuchten Blockern. Deshalb wurde

die Fluoreszenzintensität in Messkonfiguration (1) und (2) lediglich für 80 s verfolgt.

Unter diesen Bedingungen bleibt in Messkonfiguration (1) die Fluoreszenzintensität nach

Injektion von Pufferlösung und bei Cs + -Konzentrationen von < 0,5 mM stabil.

Bei Cs + -Konzentrationen von ≥ 1mM beobachtet man bei den Kontrollzelllinien deutliche,

konzentrationsabhängige Fluoreszenzänderungen mit z.T. biphasischem Verlauf. Bei

Wildtyp- und EAG-Zellen führen diese Cs + -Konzentrationen zunächst zu einer Zunahme der

Fluoreszenzintensität, gefolgt von einer Fluoreszenzabnahme. Bei der IRK-Zelllinie zeigt sich

nur eine Fluoreszenzabnahme, die hier allerdings besonders ausgeprägt ist. Dieses Ergebnis

ist überraschend, da bekannt ist, dass IRK1-Kanäle durch Cs + blockiert werden. Man hätte

deshalb eher eine Depolarisation der Zellen erwartet. Es ist jedoch für den verwandten

ROMK-Kanal (K ir 1.1) gezeigt worden, dass extrazelluläre Cs + -Ionen unter bestimmten

Bedingungen die Leitfähigkeit der Kanäle stimulieren können (SACKIN ET AL., 2003; SACKIN

ET AL., 2001). Es ist allerdings unklar, ob der hier beobachtete Effekt auf die IRK-Zellen auf

einem ähnlichen Mechanismus beruht. Im Übrigen erfolgte die Untersuchung der HCN-

Kanäle nur auf dem Wildtyp und EAG-Hintergrund. Hier sind die Cs + -Effekte klein.

Abbildung 3.16 zeigt die Fluoreszenzantworten der HCN-Kanalzelllinien auf eine Injektion

von Cs + . In Messkonfiguration (2) wurde hier nicht wie bisher ZD7288, sondern, aufgrund

der kürzeren Messzeit, sättigende Cs + -Konzentrationen (5 mM) injiziert. Die verschiedenen

HCN-Zelllinien zeigen alle eine robuste, dosisabhängige Fluoreszenzabnahme. Die

Fluoreszenzantworten der HCN1-Zelllinien sind in Abwesenheit von Colforsin mit ≈ 30 %

zunächst größer als die der HCN4-Zellen (≈ 20%). Ein Unterschied in der Kinetik zwischen

den verschiedenen Zelllinien lässt sich nicht eindeutig ausmachen. Bei Cs + -Konzentrationen

von ≥ 5 mM sind die Signale bereits 10 Sekunden nach Injektion in Sättigung.


Ergebnisse 66

1 2 DW

HCN1

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

10 s

CsCl + (mM)

0.5

1

∆F (%)

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

5

-25

10

-30

10 s

CsCl + (mM)

10

5

1

0.5

0.05

0.1

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

0.1 1 10

[CsCl] mM

DW1

DW1

HCN1/EAG

∆F ∆F/F (%)

(%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

10 s

CsCl + (mM)

0.5

1

5

10

∆F/F (%)

(%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

10 s

CsCl Cs + (mM)

(mM)

10

5

1

0,5

0,05

0,1

∆F/F ∆F/F (%)

(%)

DW1

DW2

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

0.01 0.1 1 10 100

X Axis Title

Cs CsCl + (mM)

(mM)

CsCl + (mM)

DW1

DW2

0

5

0

HCN4

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

10 s

0.5

1

5 / 10

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

10 s

10

5

1

0,5

0,05

0,1

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

0.1 1 10

[CsCl] mM

0

CsCl + (mM)

5

CsCl + (mM)

0

DW1

DW2

HCN4/EAG

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

-25

-30

10 s

0.5

1

5

10

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

10 s

10

5 1

0,5

0,05

0,1

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

-25

0.1 1 10

[CsCl] mM

HCN4

+Colforsin

HCN4/EAG

+Colforsin

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

0

-5

-10

∆F/F (%)

-15

-20

-25

-30

-35

-40

10 s

10 s

Cs + (mM)

CsCl (mM)

0.5

1

5 / 10

CsCl + (mM)

0.5

1

5

10

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

5

0

∆F/F (%)

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

10 s

10 s

CsCl + (mM)

10

5

1

0,5

0,05

0,1

CsCl + (mM)

10

5

1

0,5

0,05

0,1

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

0

-5

-10

∆F/F (%)

-15

-20

-25

-30

-35

-40

0.1 1 10

[CsCl] mM

0.1 1 10

[CsCl] mM

DW1

DW1

DW1

DW1


Ergebnisse 67

Abb. 3.16: Wirkung von CsCl auf Zellen, die HCN-Kanäle exprimieren. (1) Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität der HCN1-, HCN1/EAG- bzw. HCN4- und HCN4/EAG-Zelllinien vor und nach der

Injektion von CsCl (5 mM) zum extrazellulären Medium. Die Zellen wurden dazu auf 384er

Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung (in ES, bei HCN4-Zelllinien auch in Anwesenheit von

5 µM Colforsin) pro Well inkubiert. Im FlexMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität in den Wells gemessen. Dargestellt ist die prozentuale Änderung der

Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf die gemittelte Fluoreszenzintensität vor der CsCl Injektion (

Injektion von ES): Mittelwerte von jeweils 4 Wells. (2) In die Wells aus (1) wurde anschließend erneut CsCl

injiziert (5mM). Der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität wurde vor und nach dieser 2. Injektion verfolgt.

( in (1) wurde nur ES vorgelegt). (DW) ∆F/F am Ende von (1) () bzw. (2) () wurde gegen die CsCl-

Konzentration ([CsCl]) in den Wells aufgetragen ( = in (1) vorgelegte CsCl-Konzentration) . An die Werte

für ∆F/F aus (1) und (2) wurden mit der Hill-Gleichung Dosis-Wirkungs-Kurven angepasst (DW1 und

DW2).

In Messkonfiguration (1) nimmt nach der Injektion von hohen Cs + -Konzentrationen in einigen

Fällen das Fluoreszenzsignal nach Erreichen eines minimalen Wertes wieder zu (z.B HCN4

bzw. HCN4/EAG + Colforsin). Die Zellen scheinen also nach der Cs + -induzierten

Hyperpolarisation wieder leicht zu depolarisieren. Diese Tendenz ist auch in

Messkonfiguration (2) zu beobachten. Der Grund dafür ist unklar.

Colforsin beeinflusst bei HCN1 die Fluoreszenzantworten auf eine Cs + -Injektion kaum. Bei

unveränderter Kinetik und EC50-Werten ist die Amplitude der Fluoreszenzantworten in

Anwesenheit von Colforsin um ≈ 5% größer. Diese Daten sind hier nicht dargestellt. Sehr

auffällig ist dagegen der Effekt von Colforsin bei den HCN4-Zelllinien. In Anwesenheit von

Colforsin beobachtet man eine deutlich schnellere Kinetik der Fluoreszenzverläufe und eine

Zunahme der Amplitude um mehr als 10%. Dieser Effekt ist sowohl in Konfiguration (1) als

auch in (2) zu beobachten. An die Datensets für die beiden Messungen wurden wiederum

Dosis-Wirkungs-Kurven angepasst und in den rechten Teilabbildungen (DW) dargestellt.

Tabelle 3.6 fasst die Parameter der Dosis-Wirkungs-Kurven zusammen.

Tab. 3.6: Parameter der Dosis-Wirkungs-Kurven für Cs + in Abbildung 3.16

Amplitude (%) EC50 [Cs + ] mM Hill-Koeffizient

DW1 DW2 DW1 DW2 DW1 DW2

HCN1 -30 -21 0,7±0,2 2,5 ± 1,1 2 ± 0,4 1,2± 0,3

HCN1/EAG -31 -26 1,2 ± 0,2 1,2 ± 0,4 1,1 ± 0,1 1,8 ± 1,1

HCN4 -18 -15 0,47 ± 0,04 0,75 ± 0,12 1,7 ± 0,3 1,2± 0,3

HCN4/EAG -24 -18 0,58 ± 0,05 0,98 ± 0,08 1,6 ± 0,2 1,6 ± 0,2

In Anwesenheit von Colforsin

HCN4 -32 -24 0,68± 0,02 1,95 ± 0,26 2,5± 0,2 1,6± 0,2

HCN4/EAG -37 -26 0,85 ± 0,06 1,46 ± 0,07 1,8 ± 0,3 1,6 ± 0,1


Ergebnisse 68

Bei der Interpretation der Amplituden für die Cs + -Wirkung muss man die Werte für

Messkonfiguration (1) kritisch betrachten. Aufgrund des unspezifischen Effektes von Cs +

wird hier die Amplitude überschätzt. In Messkonfiguration (2) zeigt sich, dass, wie schon bei

den organischen Blockern, die Zellen um ≈ 6-12 mV hyperpolarisieren. Die EC50-Werte

liegen mit durchschnittlich etwa 1 mM in einem Bereich, wie er für die Wirkung von Cs + auf

HCN-Kanäle bekannt ist.

3.1.4.3 Untersuchungen der Wirkung von Colforsin

Wildtyp EAG IRK

15

15

15

10

10

10

∆F/F (%)

5

0

-5

∆F/F (%)

5

0

-5

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

300 s

-10

-15

300 s

-10

-15

300 s

15

15

15

10

10

10

∆F/F (%)

5

0

-5

∆F/F (%)

5

0

-5

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-10

-10

-15

0.01 0.1 1 10

[Colforsin] µM

-15

0.01 0.1 1 10

[Colforsin] µM

-15

0.01 0.1 1 10

[Colforsin] µM

Abb. 3.17: Wirkung von Colforsin auf die Kontrollzellen. Die Abbildung zeigt den Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität der Wildtyp-, EAG- und IRK-Zelllinien vor und nach der Injektion von 6 µl Colforsin

zum extrazellulären Medium. Die Zellen wurden dazu auf 384er Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-

Lösung (in ES) pro Well inkubiert. Im KinetikMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität in den Wells gemessen. Dargestellt ist die prozentuale Änderung der

Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf die gemittelte Fluoreszenzintensität vor der Colforsin-Injektion

( Injektion von ES): Mittelwerte von jeweils 4 Wells. ∆F/F am Ende der Messung wurde gegen die

Colforsin-Konzentration ([Colforsin]) in den Wells aufgetragen

Ich habe auch die Wirkung von Colforsin auf die HCN-Zelllinien untersucht. In den bisher

beschriebenen Experimenten konnte ein Effekt von Colforsin auf die Zellen zwar schon oft

beobachtet werden, doch wurde Colforsin dabei immer in sättigenden Konzentrationen

eingesetzt. Ich habe zunächst die Wirkung von Colforsin auf die Kontrollzellen untersucht.

Dabei soll nicht unerwähnt bleiben, dass EAG-Kanäle, genau wie HCN- oder CNG-Kanäle,

eine Bindestelle für cAMP besitzen. Abbildung 3.17 zeigt die Wirkung von Colforsin auf die

Kontrollzellen. Es wurde hier lediglich in Messkonfiguration (1) gemessen. Man kann selbst

bei hohen Colforsin-Konzentrationen (10 µM) keine signifikante Fluoreszenzänderung bei

den Kontrollzellen erkennen. Bei der IRK-Zelllinie scheinen jedoch Konzentrationen von

> 10 µM zu einem Fluoreszenzanstieg von einigen Prozent zu führen. Die Signale der EAG-


Ergebnisse 69

Zelllinie unterscheiden sich nicht von den Signalen der anderen Zelllinien. Eine Erhöhung der

intrazellulären cAMP-Konzentration hat offensichtlich keinen Einfluss auf die Aktivität der

EAG-Kanäle. Bis heute ist nicht geklärt welche Funktion die cAMP-Bindestelle bei den

EAG-Kanälen erfüllt.

Abbildung 3.18 zeigt die Fluoreszenzantworten der HCN-Kanallinien auf eine Colforsin-

Injektion. Colforsin führt bei Zellen, die HCN1 oder HCN4 exprimieren, zu einem

dosisabhängigen Fluoreszenzanstieg. Auch die Wirkung von Colforsin kann in den zwei

unterschiedlichen Messkonfigurationen bestimmt werden. Auffällig ist, dass die Signale bei

HCN1 mit ≈10% viel kleiner und weniger robust sind als die bei HCN4 (≈ 30%). Das war

nicht unerwartet, denn wie bereits mehrmals erwähnt, werden HCN4-Kanäle stärker durch

cAMP aktiviert als HCN1-Kanäle. Die Kinetik der Signale ist relativ schnell. In weniger als

150 Sekunden nach der Injektion wird ein neuer stabiler Gleichgewichtszustand erreicht.

Allerdings sind die Fluoreszenzsignale bei der einfachstabilen HCN1-Zelllinie z.T.

mehrphasig und verhindern so eine verlässliche Auswertung.


Ergebnisse 70

1 2 DW

12.5

Colforsin (µM)

12.5

Colforsin (µM)

12.5

DW1

DW2

HCN1

∆F/F (%)

10.0

7.5

5.0

2.5

0.0

-2.5

-5.0

300 s

10

3

1

0.3

0.1

0.03

0.01

∆F/F (%)

10.0

7.5

5.0

2.5

0.0

-2.5

300 s

0.1

0.03

0.01

0.3

1

3

10

∆F/F (%)

10.0

7.5

5.0

2.5

0.0

-2.5

-5.0

0.01 0.1 1 10

[Colforsin] µM

HCN1/EAG

∆F/F (%)

10.0

7.5

5.0

2.5

0.0

-2.5

300 s

Colforsin (µM)

10

3

1

0.3

0.1

0.03

0.01

∆F/F (%)

10.0

7.5

5.0

2.5

0.0

-2.5

300 s

Colforsin

0.1

0.03

0.01

0.3

1

3

10

DW1

10.0

DW2

7.5

∆F/F (%)

5.0

2.5

0.0

-2.5

0.01 0.1 1 10 100

[Colforsin] µM

HCN4

∆F/F (%)

30

25

20

15

10

5

0

-5

300 s

Colforsin (µM)

10

3

1

0.3

0.1

0.03

0.01

∆F/F (%)

30

25

20

15

10

5

0

300 s

Colforsin (µM)

0.01

0.03

0.3

0.1

1 3 10

∆F/F (%)

35

30

25

20

15

10

5

0

-5

0.01 0.1 1 10

[Colforsin]

DW1

DW2

Colforsin (µM)

Colforsin (µM)

20

DW1

DW2

HCN4/EAG

∆F/F (%)

20

15

10

5

0

-5

300 s

10

3

1

0.3

0.1

0.03

0.01

∆F/F (%)

20

15

10

5

0

300 s

0.01

0.03

0.3

0.1

∆F/F (%)

15

10

5

0

1

3

-5

10 0.01 0.1 1 10

[Colforsin] µM

Abb. 3.18: Wirkung von Colforsin auf Zellen, die HCN-Kanäle exprimieren. (1) Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität der HCN1-, HCN1/EAG- bzw. HCN4- und HCN4/EAG-Zelllinien vor und nach der

Injektion von 6 µl Colforsin zum extrazellulären Medium. Die Zellen wurden dazu auf 384er

Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung (in ES) pro Well inkubiert. Im KinetikMode des

FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität in den Wells gemessen.

Dargestellt ist die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf die gemittelte

Fluoreszenzintensität vor der Colforsin-Injektion ( Injektion von ES): Mittelwerte von jeweils 4 Wells.

(2) In die Wells aus (1) wurde erneut Colforsin injiziert (10 µM). Der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität wurde vor und nach dieser 2. Injektion verfolgt ( in (1) wurde nur ES vorgelegt).

(DW) ∆F/F am Ende von (1) () bzw. (2) (), wurde gegen die Colforsin-Konzentration ([Colforsin]) in

den Wells aufgetragen ( in (1) vorgelegte Colforsin-Konzentration). An die Werte für ∆F/F aus (1) und

(2) wurden mit der Hill-Gleichung Dosis-Wirkungs-Kurven angepasst (DW1 und DW2).


Ergebnisse 71

An die Datensätze für die Messkonfigurationen (1) und (2) wurden jeweils Dosis-Wirkungs-

Kurven angepasst (Abb. 3.18 DW). Tabelle 3.7 fasst die Parameter der Dosis-Wirkungs-

Kurven für die verschiedenen Zelllinien zusammen.

Tab. 3.7: Parameter der Dosis-Wirkungs-Kurven für Colforsin aus Abbildung 3.18.

Amplitude (%) EC50 [Colforsin] µM Hill-Koeffizient

DW1 DW2 DW1 DW2 DW1 DW2

HCN1 10 7 1 ± 1 0,06 ± 0,03 0,8 ± 0,4 0,8± 0,3

HCN1/EAG 10 8 0,73 ± 0,3 0,24 ± 0,09 0,6 ± 0,1 0,7 ± 0,2

HCN4 33 30 0,17 ± 0,01 0,14 ± 0,1 0,9 ± 0,08 1,2 ± 0,1

HCN4/EAG 21 20 0,18 ± 0,03 0,15 ± 0,02 1,4 ± 0,2 1,2 ± 0,3

Bei HCN4-Zellen beträgt der Wert für die Colforsin-induzierte Depolarisation etwa 9-13

mV. Eine Aktivierung der HCN4-Kanäle durch cAMP führt also zu größeren

Spannungsänderungen als sie bei einem Blockieren der Kanäle zu beobachten sind. Man kann

daraus schließen, dass in der Abwesenheit von intrazellulärem cAMP die HCN4-Kanäle in

den Zelllinien wenig aktiviert vorliegen.

Für HCN1 ist der Wert für die Depolarisationen mit ≈ 4 mV erwartungsgemäß geringer. Die

EC50-Werte für Colforsin (≈ 150 nM) sind schwer zu interpretieren: Sie hängen nicht nur von

den Aktivierungseigenschaften der Adenylatzyklasen durch Colforsin sondern auch von der

Affinität der HCN-Kanäle für cAMP ab. Ich werde in der Diskussion auf diesen Punkt noch

näher eingehen.

Die Experimente mit Colforsin zeigen, dass mit meinem Testverfahren nicht nur Blocker für

HCN-Kanäle untersucht werden können, sondern auch Substanzen, die zu einer Aktivierung

der Kanäle führen.


Ergebnisse 72

3.1.4.4 Zusammenfassung

(1) (2)

1.0

ZD7288 Ivabradine

ORGX

Cs

1.0

Colforsin

0.8

0.8

(A) Flp-hHCN1/bEAG1

HCN1/EAG

∆F/F

0.6

0.4

0.2

∆F/F

0.6

0.4

0.2

0.0

0.0

10 -3 10 -1 10 1 10 3

[Wirkstoff] µM

10 -3 10 -1 10 1 10 3

[Colforsin]

1.0

ZD7288 Cs +

ORGX

1.0

Colforsin

0.8

0.8

(B) Flp-hHCN4/bEAG1

HCN4/EAG

∆F/F

0.6

0.4

∆F/F

0.6

0.4

0.2

0.2

0.0

0.0

10 -3 10 -1 10 1 10 3

[Wirkstoff] µM

10 -3 10 -1 10 1 10 3

[Colforsin] µM

Abb. 3.19: Dosis-Wirkungs-Kurven für HCN-Kanal-Blocker (1), bzw. Colforsin (2), erstellt auf der

HCN1/EAG- bzw. HCN4/EAG-Zelllinie. Normiert auf (∆F/F) max = 1 und (∆F/F) min = 0.

Ich habe für HCN1- und HCN4-Kanäle ein Testverfahren (Assay) in 384er Multiwellplatten

entwickelt, mit dem die Wirkung von Substanzen auf die Kanäle fluoreszenzoptisch verfolgt

werden kann. Neben der Wirkung von Colforsin konnte ich mit diesem Assay die Wirkung

bekannter HCN-Kanalblocker quantitativ bestimmen. In Abbildung 3.19 sind die Dosis-

Wirkungs-Kurven für die verschiedenen Wirkstoffe nochmals zusammengefasst. Im nächsten

Schritt habe ich untersucht, ob sich dieser HCN1- bzw. HCN4-Assay für ein

Hochdurchsatzscreening von Wirkstoffen eignet.


Ergebnisse 73

3.1.5 Bestimmung des Z-Faktors

Der Erfolg eines Wirkstoffscreenings hängt in hohem Maße von der Qualität und

Zuverlässigkeit des verwendeten Assays ab.

ZHANG ET AL. haben 1999 den sogenannten „Z´-Faktor“ eingeführt. Der Z´-Faktor ist ein

dimensionsloser, statistischer Parameter, der standardmäßig eingesetzt wird, um die Qualität

eines Assays abzuschätzen. Der Z´-Faktor wird ermittelt, indem man mit dem Assay eine

große Anzahl von Negativkontrollen (NK) und Positivkontrollen (PK) vermisst und deren

Signale statistisch auswertet. Der Z´-Faktor wird durch den dynamischen Bereich des Assays

und die Streuung der Messwerte (die Reproduzierbarkeit des Assays) bestimmt. Der Z´-

Faktor ist definiert durch:

Z = 1 -

3*(σ NK + σ PK )

| PK-NK |

Gleichung 3.1: Bestimmung des Z´-Faktors (Z). NK =

Mittelwert des Signals der Negativ-Kontrolle; PK =

Mittelwert des Signals der Positiv-Kontrolle; σ NK =

Standardabweichung NK; σ PK = Standardabweichung

PK

Die Werte für Z werden wie folgt kategorisiert:

• Z = 1: Ein perfekter Assay (nur möglich wenn σ = 0 oder |PK-NK| = ∞).

• 1 > Z ≥ 0,5 : Ein exzellenter Assay.

• 0,5 >Z > 0: Ein grenzwertiger Assay (es müssen Doppelbestimmungen und zusätzliche

Kontrollen durchgeführt werden).

• Z ≤ 0: Der Assay ist für ein Screening ungeeignet (Signale von NK und PK

überlappen).

In der Regel sind nur Assays mit Z-Faktoren ≥ 0,5 für Hochdurchsatzscreenings (HTS) im

industriellen Maßstab geeignet.


Ergebnisse 74

Die vorangegangenen Experimente haben gezeigt, dass prinzipiell für HCN1 und HCN4

jeweils zwei Zellsysteme, mit unterschiedlichem Hintergrund (Wildtyp bzw. EAG), für ein

Wirkstoffscreening zur Verfügung stehen. Ich habe den Z´-Faktor des Assays für HCN1 bzw.

HCN4-Kanäle abhängig von dem verwendeten Zellsystem bestimmt.

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

HCN1 HCN1/EAG Z-Faktor

ES

∆F/F (%)

5

0

ES

-5

-10

-15

-20

1.0

0.8

0.6

0.4

-25

-30

ZD7288 0.2

HCN1

ZD7288

HCN1/EAG

-35

0.0

600 s

600 s

0 1000 2000 3000

Zeit nach Injektion (s)

Z-Faktor

Abb. 3.20: Z´-Faktor des Assays für HCN1, abhängig von der verwendeten Zelllinie. Die Zellen wurden auf

384er Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung (in ES) pro Well inkubiert. Im KinetikMode des

FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität in jeweils 96 Wells vor und nach

Injektion (6 µl) von ES (48 Wells) bzw. 2 µM ZD7288 (48 Wells) gemessen. Dargestellt ist die prozentuale

Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf die gemittelte Fluoreszenzintensität vor der Injektion.

Der Z´-Faktor wurde nach Gleichung 3.1 für jeden Messpunkt nach der Injektion bestimmt mit: NK = ∆F/F

nach ES-Injektion, PK = ∆F/F nach ZD7288-Injektion. Als gestrichelte Linie ist rechts der „Schwellenwert“ von

0,5 für den Z´Faktor angedeutet.

Abbildung 3.20 zeigt den Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität von jeweils 96 Wells mit der

HCN1-, bzw. HCN1/EAG-Zelllinie. In jeweils 48 Wells wurde als Negativkontrolle ES

injiziert. In die anderen 48 Wells wurde als Positivkontrolle je 2 µM ZD7288 injiziert.

Da zeitaufgelöste Messungen durchgeführt wurden, konnte der Z´-Faktor für jeden Zeitpunkt

nach der Injektion bestimmt werden (Abb. 3.20, rechte Teilabbildung). Mit beiden HCN1-

Zelllinien wird etwa 1000 s nach der Injektion ein stabiler Wert von > 0,5 für Z´ erreicht. Der

Z´-Faktor für einen Assay mit den einfachstabilen HCN1-Zellen ist mit maximal 0,75 etwas

größer, als für einen Assay, bei dem HCN1/EAG-Zellen verwendet werden. Hier beträgt Z´

maximal 0,65.

Abbildung 3.21 zeigt die Ergebnisse für HCN4. Bei den Zellsystemen für HCN4 habe ich

jeweils auch den Einfluß von Colforsin auf Z´ untersucht. Mit HCN4/EAG-Zellen wird unter

beiden Bedingungen ein Z´-Faktor von ≥ 0,5 erreicht. Z´max beträgt in beiden Fällen 0,55. In

Anwesenheit von Colforsin erreicht Z´ sein Maximum früher (~ 2500 s gegenüber ~ 4000 s).

Bei einem Assay mit den einfachstabilen HCN4-Zellen wird der Z´-Faktor stärker von

Colforsin beeinflusst. In Abwesenheit von Colforsin beträgt der maximale Z-Faktor 0,45,

während er in Anwesenheit von Colforsin 0,78 erreicht.


Ergebnisse 75

5

1 2

5

HCN4

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

600 s

ES

ZD7288

∆F/F (%)

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

600 s

ES

ZD7288

5

5

0

0

HCN4/EAG

∆F/F (%)

-5

-10

-15

ES

∆F/F (%)

-5

-10

-15

ES

-20

-20

-25

-25

-30

600 s

ZD7288

-30

600 s ZD7288

Z-Faktor

Z-Faktor

1.0 HCN4

HCN4/EAG

0.8

2

0.6

0.4

1 / 2

1

0.2

0.0

0 1250 2500 3750 5000

Zeit nach Injektion (s)

Abb. 3.21: Z´-Faktor des Assays für HCN4, abhängig von der verwendeten Zelllinie. Z´ wurde sowohl in

Ab- als auch in Anwesenheit von Colforsin bestimmt. Die Zellen wurden auf 384er Multiwellplatten mit 54 µl

MembraneKit-Lösung (1), bzw. mit 54 µl MembraneKit-Lösung inklusive 5 µM Colforsin (2) inkubiert. Im

KinetikMode des FlexStationII 384 -Systems wurde der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität in jeweils 96

Wells, vor und nach Injektion (6 µl) von ES (48 Wells) bzw. 2 µM ZD7288 (48 Wells) gemessen. Dargestellt

ist die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität (∆F/F), bezogen auf die gemittelte

Fluoreszenzintensität vor der Injektion. In (1) und (2) wurde für jeden Messpunkt nach der Injektion der Z-

Faktor bestimmt.

Die hier durchgeführten Experimente zeigen, dass sich beide HCN1-Zelllinien sehr gut für

einen HTS-Assay eignen. Es werden jeweils Z´-Faktoren von deutlich über 0,5 erreicht. Mit

der HCN4/EAG-Zelllinie steht ebenfalls ein exzellenter Assay zur Verfügung. Wenn man

diese Zelllinie verwendet, ist eine zusätzliche Aktivierung von HCN4-Kanälen über Colforsin

(bzw. cAMP) nicht notwendig. Um eine vergleichbare Zuverlässigkeit mit der

einfachstabilen HCN4-Zelllinie zu erhalten, müsste hier das Wirkstoffscreening in

Anwesenheit von Colforsin durchgeführt werden. Die Experimente zeigen, dass ein

fluoreszenzoptischer Assay für HCN1- und HCN4-Kanäle entwickelt werden konnte, der sich

für ein industrielles Hochdurchsatzscreening und für das Wirkstoffscreeening mit den

Tiergiften eignet. Ich habe im weiteren Verlauf der Arbeit die doppeltstabilen HCN/EAG-

Zelllinien verwendet.


Ergebnisse 76

3.2 Wirkstoffscreening mit Tiergiften

Bei „konventionellen“ Wirkstoffscreenings wird in Bibliotheken von bis zu 1.000.000

organischen Wirkstoffen nach Substanzen gesucht, die spezifisch auf das jeweilige

Zielprotein wirken. Jede Substanz wird dabei einzeln und in definierter Konzentration (meist

1-10 µM) auf ihre Wirksamkeit getestet. Durch unabhängige Tests wird sichergestellt, dass

nur Substanzen, die keine zytotoxische Wirkung zeigen, in solch einer Wirkstoffbibliothek

enthalten sind. Ich habe Gifte von Kegelschnecken, Spinnen, Skorpionen und Schlangen auf

HCN-spezifische Wirkstoffe untersucht. Tiergifte bestehen aus einem „Cocktail“

verschiedener Substanzen in unterschiedlichsten Konzentrationen. Während die Peptid-

Toxine eines Giftes meist hochpezifisch für bestimmte Zielproteine sind, können andere

Inhaltsstoffe eine völlig unspezifische Wirkung zeigen. Viele Tiergifte enthalten z.B. Enzyme

und andere Proteine mit oft stark zytotoxischer Wirkung. Phospholipasen, die man in nahezu

jedem Schlangengift findet, sind ein Beispiel dafür. Tiergifte können darüber hinaus auch

Neurotransmitter enthalten. Einige Skorpion- und Spinnengifte enthalten z. B. hohe

Konzentrationen an biogenen Aminen.

Von den Schlangengiften ist bekannt, dass die Injektion von „Rohgift“ zum extrazellulären

Medium zur Lyse der Kulturzellen führen kann. Aufgrund dieser stark zytotoxischen Wirkung

wurden die Schlangengifte für das Wirkstoffscreening zunächst chromatographisch

aufgetrennt und fraktioniert. So sollten die unspezifisch und zytotoxisch wirkenden

Komponenten des Giftes von möglicherweise spezifischen Wirkstoffen getrennt werden. Die

Kegelschneckengifte wurden mir bereits vorfraktioniert zur Verfügung gestellt. Wie bei den

Schlangengiften wurden hier einzelne Gift-Fraktionen getestet. Bei Skorpion- und

Spinnengiften habe ich ausschließlich die „Rohgifte“ verwendet.

In den nachfolgenden Kapiteln wird die praktische Durchführung des Wirkstoffscreenings

und die entsprechende Datenanalyse vorgestellt.


Ergebnisse 77

3.2.1 Praktische Durchführung und Analyse der Daten

In den vorangegangenen Kapiteln habe ich die Wirkung bekannter HCN-Kanalblocker auf die

HCN1/EAG- und HCN4/EAG-Zelllinien untersucht. Dabei wurden die Substanzen stets in

zwei unterschiedlichen Messkonfigurationen (Messkonfiguration (1) und (2)) getestet. Die

Kombination der Ergebnisse für beide Messkonfigurationen ermöglichte eine quantitative

Charakterisierung der einzelnen Wirkstoffe. Auch die Aktivierung der HCN-Kanäle über

Colforsin konnte so analysiert werden.

Bei der Durchführung des Wirkstoffscreenings und bei der Analyse der Daten musste ich

berücksichtigen, dass bei den Tiergiften möglicherweise ein komplexes Muster aus

spezifischer und unspezifischer Wirkung auftreten kann. Deshalb habe ich mich dafür

entschieden, auch die Tiergifte und Giftfraktionen immer in beiden Messkonfigurationen zu

testen. Außerdem habe ich die Gifte nicht nur mit den HCN/EAG-Zelllinien, sondern immer

auch auf Kontrollzellen getestet. Als Kontrollzellen wurde die EAG-Zelllinie und die IRK-

Zelllinie verwendet.

In Messkonfiguration (1) wurde die Wirkung der Gifte auf die Zellen nach der Injektion

„direkt“ verfolgt. Jedes Gift wurde in einer Doppelbestimmung (2 Wells pro Zelllinie)

untersucht. Gleichzeitig wurden immer auch Kontrollinjektionen durchgeführt. Als

Negativkontrolle wurde auf jeder Multiwellplatte in je 8 Wells pro Zelllinie Pufferlösung (ES)

injiziert. In weitere 8 Wells wurde als Positivkontrolle 2 µM ZD7288 injiziert. Anhand dieser

Kontrollen konnte die Zuverlässigkeit des Testsystems überprüft werden. Der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität wurde nach der Injektion der Gifte und „Kontroll-Lösungen“ für 4200

Sekunden verfolgt. Anschließend wurde in Messkonfiguration (2) eine sättigende

Konzentration von CsCl (5 mM) in die Wells injiziert. Dabei wurde der Fluoreszenzverlauf

für 60 s aufgenommen.

Man erhält so für jedes Well einer Multiwellplatte zwei Messpunkte, die über Wirksamkeit

und Spezifizität des injizierten Giftes Auskunft geben. Im Folgenden werde ich erläutern, wie

die Auswertung dieser Daten erfolgte. Ich habe mich dabei an den Kriterien orientiert, die

ZHANG ET AL. (1999) zur Analyse der Daten von Wirkstoffscreenings vorschlagen.

Für jedes Well einer Multiwellplatte wurde 4200 Sekunden nach der Gift-Injektion in

Messkonfiguration (1), und 60 Sekunden nach der anschließenden CsCl-Injektion in

Messkonfiguration (2), die Fluoreszenzänderung (∆F/F) bestimmt. Für die Negativkontrolle

wurde jeweils das 3σ-Intervall ermittelt ((Mittelwert ∆F/F) ± 3*σ). Gifte, bei denen sich die

Fluoreszenzantworten der HCN/EAG-Zelllinien innerhalb des 3σ-Intervalls für die


Ergebnisse 78

Negativkontrolle bewegen, gelten als negativ. Liegen bei einem Gift die

Fluoreszenzantworten jedoch außerhalb dieses Bereiches, so könnte das auf eine Wirkung auf

den jeweiligen HCN-Kanal hindeuten. Ob die Wirkung spezifisch ist, kann über den

Vergleich mit den Kontrollzellen ermittelt werden. Zeigt das Gift auf den Kontrollzellen den

gleichen Effekt, muss man von einer unspezifischen Wirkung ausgehen. Beobachtet man

dagegen keinen Effekt, gilt das Gift als potentieller „Hit“.

HCN1/EAG

HCN4/EAG

EAG

IRK

1

∆F/F (%)

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

600 s

Colforsin

ES

ZD7288

ES +- (3*SD)

∆F/F (%)

20

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

Colforsin

ES

600 s ZD7288

ES +- (3*SD)

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

Colforsin

ZD7288

600 s

ES +- (3*SD)

∆F/F (%)

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

Colforsin

ZD7288

600 s

ES +- (3*SD)

2

∆F/F (%)

10

0

-10

-20

-30

-40

7 s

ZD7288

Colforsin

ES +- (3*SD)

∆F/F (%)

0

-10

-20

-30

-40

7 s

ZD7288

Colforsin

ES +- (3*SD)

∆F/F (%)

10

0

-10

-20

-30

-40

7 s

ZD7288

Colforsin

ES +- (3*SD)

∆F/F (%)

10

0

-10

-20

-30

-40

ZD7288

Colforsin

7 s

ES +- (3*SD)

Score Abb.

HCN1 HCN4 EAG IRK1

hHCN1 hHCN4

3.23 1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

Colforsin

Abb. 3. 22: Analyse und farbliche Kodierung der Wirkung von Tiergiften auf die Fluoreszenzintensität am

Beispiel von ZD7288 und Colforsin. Die Zellen wurden auf 384 Multiwellplatten mit 54 µl MembraneKit-Lösung

inkubiert. Messkonfiguration (1): Die Fluoreszenzintensität der Zellen wurde vor und nach Injektion von ES

(Negativkontrolle; , Mittelwert aus 8 Wells), ZD7288 (2 µM) bzw. Colforsin (10 µM) verfolgt. Am Ende der

Messung ist für die Negativkontrolle das 3σ-Intervall dargestellt (grüne Fehlerbalken). Messkonfiguration (2): In die

Wells aus (1) wurde in einer zweiten Messung 5 mM CsCl injiziert. Der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität wurde

vor und nach der Injektion verfolgt. Am Ende der Messung ist für die Wells, in die in (1) als Negativkontrolle ES

injiziert wurde wiederum das 3σ-Intervall dargestellt (grüne Fehlerbalken). Die farbliche Kodierung der Wirkung von

ZD7288 und Colforsin wurde anhand der dargestellten Balken vorgenommen und in Tabellenform dargestellt. Die

linke Seite der Tabelle zeigt den „Score“ für ZD7288 und Colforsin (Die Ermittlung des „Scores“ wird im Text

erläutert)

Das Testsystem erlaubt darüber hinaus, zwischen Wirkstoffen zu unterscheiden, die HCN-

Kanäle blockieren, und solchen, die zur Aktivierung der Kanäle führen. In Abbildung 3.22 ist

die Methode zur Analyse der Daten anhand von Messungen mit ZD7288 und Colforsin

exemplarisch dargestellt.

In den oberen (1) und unteren Teilabbildungen (2) ist der Zeitverlauf der Fluoreszenz in

Messkonfiguration (1) bzw. Messkonfiguration (2) gezeigt. In grün ist das 3σ-Intervall für die

Negativkontrolle dargestellt. Außerhalb des 3σ-Intervalls markiere ich potentiell HCNblockierende

Wirkung durch rote Balken und potentiell HCN-aktivierende Wirkung durch


Ergebnisse 79

blaue Balken. Erwartungsgemäß fallen bei den HCN/EAG-Zelllinien die Werte für ZD7288

in beiden Messkonfigurationen in den roten Bereich, die Werte für Colforsin in den blauen

Bereich. Die Kontrolle mit den EAG und IRK-Zelllinien belegt, dass die Wirkungen HCNspezifisch

sind. Dort liegen die Fluoreszenzwerte für ZD7288 und Colforsin im „grünen

Bereich“. Ich habe einen „Score“ definiert, mit dem potentielle Hits erkannt werden können.

Es wurde für jedes einzelne Well in beiden Messkonfiguration ein Punkt vergeben, der das

jeweilige Messergebnis widerspiegelt: grün für keine Wirkung, rot für potentiell HCNblockierende

Wirkung und blau für potentiell HCN-aktivierende Wirkung. Da ich für die

Gifte jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt habe, werden für jedes Gift 4 Farbpunkte

vergeben. Den „Score“ erhält man, indem man die Wirkung eines Giftes auf die

Fluoreszenzintensität der jeweiligen HCN-Zelllinie, mit der Wirkung des Giftes auf die

Kontrollzelllinien verrechnet: Eine Fluoreszenzänderung, die eine potentiell blockierende

oder aktivierende Wirkung auf HCN-Kanäle darstellt, trägt nur dann zum „Score“ bei, wenn

man bei den Kontrollzellen in derselben Messkonfiguration keine Fluoreszenzänderung

beobachtet. Der untere Teil in Abbildung 3.22 zeigt diese Form der Analyse für ZD7288 und

Colforsin. Wie erwartet, erhält ZD7288 einen „Score“ von () und Colforsin von

().

Gifte, die in dem Wirkstoffscreening einen Score von ≥ () bzw. () erzielten, wurden

als potentielle „Hits“ eingestuft und in den Tabellen grau unterlegt. Bei diesen Giften lässt

sich in beiden Messkonfigurationen eine spezifische blockierende bzw. aktivierende Wirkung

auf die jeweilige HCN-Zelllinie beobachten. Potentielle „Hits“ werden unter gleichen

Bedingungen in einem zweiten Experiment erneut getestet. Nur wenn sich hier das Ergebnis

bestätigen lässt, kann man von einem echten, sogenannten „confirmed Hit“ sprechen. Bei

„confirmed Hits“ erscheint eine weiterführende Analyse der Wirkung sehr vielversprechend.

Gifte, die einen Score von () bzw. () erzielen, wurden prinzipiell als negativ eingestuft,

doch kann nicht mit allerletzter Sicherheit eine Wirkung auf HCN-Kanäle ausgeschlossen

werden. Diese Ergebnisse sind nur sehr schwer zu interpretieren, denn es ist möglich, dass

hier eine Kombination aus unspezifischer und spezifischer Wirkung vorliegt. Auch diese

Gifte wurden deshalb in den Tabellen grau unterlegt.

Da eine überschaubare Anzahl von Giften bzw. Gift-Fraktionen getestet wurden, konnten,

zusätzlich zu dieser statistischen Datenauswertung, die Giftwirkungen zusätzlich auch anhand

der zeitaufgelösten Darstellung der Fluoreszenzantworten qualitativ analysiert werden.

Falsch-positive „Hits“ konnten dadurch schnell identifiziert werden. Es wurde so ebenfalls


Ergebnisse 80

überprüft, ob sich bei den Giften mit einem Score von () bzw. () Hinweise darauf finden

lassen, dass hier möglicherweise ein falsch-negatives Ergebnis vorliegt.

Anhand der Werte, die für die Fluoreszenzänderungen ermittelt wurden und ebenso durch die

Analyse der zeitaufgelösten Fluoreszenzverläufe, konnte man bestimmen, wie weit die

Fluoreszenzantworten potentiell wirksamer Gifte außerhalb des 3σ-Intervalls für die

Negativkontrolle liegen. Daraus lassen sich Rückschlüsse auf die pharmakologische Potenz

bzw. auf die Konzentration des Wirkstoffes in dem Gift ziehen.

In den nachfolgenden Kapiteln werden die Ergebnisse des Wirkstoffscreenings für die

verschiedenen Tiergifte vorgestellt. Dabei sind stets die Gifte in einer Tabelle

zusammengefasst, die gemeinsam auf einer Multiwellplatte getestet wurden. Zusätzlich zu

den jeweiligen Tabellen ist in den Fällen, in denen potentielle „Hits“ identifiziert wurden,

auch der Zeitverlauf der Fluoreszenzintensitäten dargestellt. Die potentiellen „Hits“ sind in

diesen Abbildung in der entsprechenden Farbe markiert. Auf die Darstellung der

Fluoreszenzverläufe wurde allerdings verzichtet, wenn eindeutig falsch-positive „Hits“

identifiziert wurden..


Ergebnisse 81

3.2.2 Kegelschneckengifte

Es wurden Gifte von insgesamt 8 verschiedenen Spezies (A-H, siehe Tab. 2.3) getestet. Die

Gifte waren in jeweils 5 Fraktionen aufgetrennt. Es wurden jeweils 6 µl in die Wells injiziert.

In Tabelle 3.7 sind die Ergebnisse für das Wirkstoffscreening mit diesen Giften dargestellt.

Tab. 3.7 Test von fraktionierten Kegelschneckengiften auf HCN-spezifische Wirkungen. Der experimentelle

Ablauf und die entsprechende Datenanlyse sind unter 3.2.1 erläutert und in Abb. 3.22 exemplarisch dargestellt

SCORE HCN1 HCN4 EAG IRK

Gift

HCN1 HCN4

1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

A1

A2

A3

A4

A5

B1

B2

B3

B4

B5

C1

C2

C3

C4

C5

D1

D2

D3

D4

D5

E1

E2

E3

E4

E5

F1

F2

F3

F4

F5

G1

G2

G3

G4

G5

H1

H2

H3

H4

H5


Ergebnisse 82

Tabelle 3.7 zeigt, dass keine der 40 Gift-Fraktionen, weder für HCN1 noch für HCN4, als

potentieller „Hit“ identifiziert wurde. Für die Wirkung von Fraktion H5 auf die HCN4-Zellen

wird ein Score von () ermittelt. Es deutete nichts daraufhin, dass es sich bei H5 um ein

falsch-negatives Ergebnis handelt könnte. Die Fluoreszenzänderungen lagen hier nur minimal

(≈ 3%) außerhalb des grünen Bereichs.

Unabhängig von dem negativen Ergebnis für die HCN-Kanäle lässt sich in Tabelle 3.7 ein

anderer Effekt erkennen: Nahezu jede Gift-Fraktion löst bei den EAG-Kontrollzellen in

Messkonfiguration (1) eine Zunahme der Fluoreszenzintensität aus (durchschnittlich 20%.).

Möglicherweise zeigt eine Komponente des Puffers, der für die Fraktionierung der Gifte

verwendet wurde, eine spezifische Wirkung auf die EAG-Zellen. Dagegen spricht, dass ein

ähnlicher Effekt auf den HCN/EAG-Zelllinien ausbleibt. Dieses Phänomen wurde im Rahmen

dieser Arbeit nicht weiter untersucht. Dieses Ergebnis zeigt aber, dass bei dem

Wirkstoffscreening prinzipiell auch Gifte identifiziert werden können, die spezifisch auf

EAG- oder IRK-Kanäle wirken. Gifte, bei denen solch eine Wirkung vermutet werden kann,

wurden im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht weiter verfolgt.


Ergebnisse 83

3.2.3 Gifte von Spinnen und Skorpionen

Verteilt auf drei Multiwellplatten (MWP1-3) wurden 50 Gifte von Spinnen und Skorpionen

auf eine HCN-spezifische Wirkung untersucht. Von den Giftlösungen (siehe 2.9.3) wurden

jeweils 6 µl injiziert. Auf der ersten Multiwellplatte wurden insgesamt 16 der 50 Gifte

getestet. In Tabelle 3.8 sind die Ergebnisse dieses Experimentes dargestellt. Für die Gifte

wurde die Identifizierungs-Nummer der Firma SpiderPharm verwendet (siehe Tab. 2.5). Nach

Tabelle 3.8 ergibt sich kein potentieller „Hit“ für HCN4 bzw. HCN1.

Gift #107 erzielt auf HCN1/EAG-Zellen einen Score von (). Dass das Gift in den beiden

Messkonfiguration eine gegensätzliche Wirkung zeigt, deutet auf eine unspezifische Wirkung

hin. Zumal in allen Fällen nur minimale Abweichungen (1-3 %) von der Negativkontrolle zu

beobachten waren. Ein falsch-negatives Ergebnis liegt hier höchstwahrscheinlich nicht vor.

Tabelle 3.8 Test von 16 verschiedenen Spinnen- und Skorpiongiften auf HCN-spezifische Wirkung (MWP1).

Der experimentelle Ablauf und die entsprechende Datenanlyse sind unter 3.2.1 erläutert und in Abb. 3.22

exemplarisch dargestellt

HCN1

Score HCN1 HCN4 EAG IRK

Gift

HCN4

1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

107

349

258

251

131

176

129

190

157

114

200

106

259

253

201

181

Weitere 18 Gifte wurden auf einer zweiten Multiwellplatte untersucht. Abbildung 3.23 zeigt

die Tabelle mit den Ergebnissen der Datenanalyse und zusätzlich auch die zeitaufgelösten

Fluoreszenzverläufe. Aus der Tabelle im unteren Teil der Abbildung ergeben sich für HCN4

zwei potentielle „Hits“. Die Gifte #268 und #269 erreichen einen Score von (), der eine

spezifische aktivierende Wirkung dieser Gifte anzeigt.

Der obere Abbildungsteil mit den Fluoreszenzverläufen zeigt in (1) den Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität nach Injektion der Gifte (Messkonfiguration (1)). In (2) sind die

Fluoreszenzantworten nach der anschließenden CsCl-Injektion dargestellt (Messkonfiguration

(2)). In grün ist jeweils der Fluoreszenzverlauf nach ES-Injektion (Negativkontrolle,


Ergebnisse 84

Mittelwert aus 8 Wells) und das entsprechende 3σ-Intervall (Balken) dargestellt. Bei den

HCN-Zelllinien ist der Fluoreszenzverlauf der Positivkontrollen (2µM ZD7288) rot markiert.

In den Teilabbildungen für die HCN4/EAG-Zelllinie sind die Fluoreszenzverläufe für die

potentiellen „Hits“ in blau dargestellt. In Messkonfiguration (1) und (2) lässt sich die

aktivierende Wirkung der Gifte #268 und #269 erkennen. Das bestätigt das Ergebnis der

Datenanalyse. Der Effekt dieser Gifte erscheint dabei relativ robust. Die Werte liegen jeweils

etwa 7.5% außerhalb des grünen Bereiches.

HCN1/EAG

HCN4/EAG

EAG

IRK

1

∆F/F (%)

10

0

-10

-20

-30

-40

600 s

159

348

343

301

∆F/F (%)

20

10

0

-10

-20

-30

-40

-65

600 s

268

269

115

348

343

301

∆F/F (%)

10

0

-10

-20

-30

-40

-60

600 s

348

343

301

∆F/F (%)

10

0

-10

-20

-30

-60

348

343

301

2

∆F/F (%)

0

-10

-20

-30

-40

7 s

269

268

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

-45

7 s

269

268

∆F/F (%)

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

7 s

∆F/F (%)

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

7 s

HCN1

Score HCN1 HCN4 EAG IRK

Gift

HCN4

1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

116

124

154

343

119

203

127

115

351

268

194

247

269

301

159

348

330

245

Abb. 3.23: Test von 16 verschiedenen Spinnen- und Skorpiongiften auf HCN-spezifische Wirkung

(MWP2). Der experimentelle Ablauf und die entsprechende Datenanlyse sind unter 3.2.1 beschrieben und in

Abb. 3.22 exemplarisch dargestellt. Weitere Erläuterungen finden sich im Text.

In Messkonfiguration (2) ist bei der HCN1/EAG-Zelllinie zu erkennen, dass die Gifte, die als

potentielle „Hits“ für HCN4 identifiziert wurden, in dieser Messkonfiguration auch einen

aktivierenden Effekt auf HCN1 zu haben scheinen. Da jedoch in Messkonfiguration (1) kein


Ergebnisse 85

Effekt dieser Gifte auf die HCN1-Zellen zu beobachten ist, wurden sie als negativ bewertet.

Darüber hinaus führen in Messkonfiguration (1) einige Gifte zu großen Fluoreszenzabnahmen

(bis zu 50%) bei allen Zelllinien.

Die spezifische Wirkung der potentiellen „Hits“ (#268 und #269) auf HCN4 musste in einem

weiteren Experiment überprüft werden. Ich habe jedoch zunächst die restlichen 16 Gifte

getestet.

HCN1/EAG

HCN4/EAG

EAG

IRK

1

∆F/F (%)

20

10

0

-10

-20

-30

600 s

269

197

369

160

168

182

185

∆F/F (%)

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

269

264

197

369

185

182

168

∆F/F (%)

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

168

182

160

∆F/F (%)

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

600 s

182

160

2

∆F/F (%)

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

-45

7 s

269

∆F/F (%)

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

-45

7 s

264

269

∆F/F (%)

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

7 s

∆F/F (%)

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

7 s

HCN1

Score HCN1 HCN4 EAG IRK

Gift

HCN4

1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

199

168

160

182

125

277

163

180

185

249

313

269

264

369

334

197

Abb. 3.24: Test von 16 verschiedenen Spinnen- und Skorpiongiften auf HCN-spezifische Wirkung

(MWP3). Der experimentelle Ablauf und die entsprechende Datenanlyse sind unter 3.2.1 beschrieben und in

Abb. 3.22 exemplarisch dargestellt. Weitere Erläuterungen finden sich im Text.

In Abbildung 3.24 sind die Ergebnisse für diese Gifte zusammengefasst. Es ist wiederum das

Ergebnis der statistischen Datenanalyse zusammen mit den Fluoreszenzverläufen dargestellt.

In der von mir untersuchten „Gift-Bibliothek“ der Firma SpiderPharm, war das Gift #269

irrtümlich doppelt enthalten und wurde so in diesem Experiment ein zweites Mal getestet.

Wie die Tabelle im unteren Teil der Abbildung zeigt, wird auch diese Probe von Gift #269 als

potentieller „Hit“ für HCN4 erkannt. Hier sogar mit dem maximalen Score von (). In


Ergebnisse 86

diesem Fall lässt sich für #269 auch eine spezifische aktivierende Wirkung auf HCN1

erkennen. Es wird ebefalls ein Score von () ermittelt. Es wurde ein weiterer potentieller

„Hit“ für HCN4 identifiziert: Gift #264 erzielt einen Score von ().

Die Fluoreszenzverläufe für die „Hits“ sind in Messkonfiguration (1) und (2) jeweils in blau

dargestellt. Die aktivierende Wirkung von #269 lässt sich in beiden Messkonfigurationen,

sowohl für HCN1 als auch für HCN4, gut erkennen. Bei den HCN4-Zellen liegen die

Fluoreszenzantworten dabei jeweils um etwa 12,5% außerhalb des grünen Bereichs. Bei

HCN1-Zellen ist der Effekt mit je ≈ 10% etwas geringer. Im Vergleich zu dem

vorangegangenen Experiment in Abbildung 3.23 sind die Effekte von #269 hier fast doppelt

so groß. Möglicherweise liegt der aktivierende Wirkstoff in der zweiten Probe des Gifts in

einer höheren Konzentration vor. Das könnte erklären, warum hier, im Gegensatz zu Abb.

3.23, eine spezifische Wirkung auf die HCN1-Zellen deutlich erkennbar ist. Der zweite „Hit“

für HCN4 (Gift #264) zeigt in (1) und (2) ebenfalls eine deutliche Wirkung. Auch hier lässt

sich das Ergebnis der Datenanalyse bestätigen.

Darüber hinaus erzielen die Gifte #313, #369 und #197 einen Score von (). Eine Wirkung

dieser Gifte lässt sich nur in Messkonfiguration (1) ausmachen. Da in Messkonfiguration (2)

kein Effekt zu beobachten ist gelten diese Gifte als negativ.

In Messkonfiguration (1) führen einige Gifte zudem zu Fluoreszenzabnahmen bei den HCN-

Zelllinien. Der Vergleich mit den Kontrollen zeigt, dass die Wirkungen unspezifisch sind.

Die 3 potentiellen „Hits“ (#269, #268, #264) wurden anschließend daraufhin untersucht, ob

sich ihre spezifische, aktivierende Wirkung in einem erneuten Experiment reproduzieren lässt.

Dabei wurden dieselben Bedingungen gewählt, wie schon in den vorangegangenen

Experimenten (Für #269 wurde die Giftprobe aus Abb. 3.24 verwendet). Tabelle 3.9 zeigt das

Ergebnis der Datenanalyse für diesen Test. Die Ergebnisse der vorherigen Experimente

werden durch diesen Test bestätigt.

Tab. 3.9 Erneuter Test der Gifte #269, #268, #264 auf ihre HCN-spezifische Wirkung. Es wurden die gleichen

Bedingungen gewählt, wie für Abb. 3.23 und 3.24 beschrieben

Score HCN1 HCN4 EAG IRK

Gift

HCN1 HCN4

1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

269

268

264


Ergebnisse 87

Zusammenfassung

Aus dem Screening der insgesamt 49 verschiedenen Spinnen- und Skorpiongifte gehen 3

„confirmed Hits“ hervor. Die Gifte #268, #269 und #264 zeigen eine spezifische Wirkung auf

Zellen, die HCN-Kanäle exprimieren. Alle drei Gifte führen zur Aktivierung von HCN4-

Kanälen, während #269 auch HCN1-Kanäle aktiviert. Es konnte kein Gift identifiziert

werden, das möglicherweise einen Blocker für HCN-Kanäle enthält.

Leider fehlte im Rahmen dieser Arbeit die Zeit, um diese interessanten Effekte der drei Gifte

auf die HCN-Kanäle detailliert zu analysieren. Ich werde in der Diskussion darauf eingehen,

wie eine weiterführende Analyse in dieser Richtung aussehen könnte.

3.2.4 Schlangengifte

Es wurden insgesamt 5 verschiedene Schlangengifte auf HCN-spezifische Wirkstoffe

untersucht. Die lyophilisierten Gifte wurden in einer Konzentration von ≈100 mg/ml –

bezogen auf die Trockensubstanz - in ES gelöst. Für das Wirkstoffscreening wurden jeweils

10 µl dieser Lösung (≈ 1 mg Gift) mit RP-HPLC fraktioniert. Die einzelnen Komponenten

des Giftes wurden so anhand ihrer Hydrophobizität aufgetrennt. Je größer die Hydrophobizität

einer Komponente im Gift, desto länger ist deren Retentionszeit auf der Säule. Die

verschiedenen Schlangengifte wurden so in 13 – 24 Fraktionen aufgetrennt Es wurde versucht

möglichst einzelne Peaks zu fraktionieren. Jede der Fraktionen wurde anschließend bis zur

Trocknung eingeengt und in je 75 µl ES aufgenommen. Davon wurden dann 6 µl in die Wells

der Multiwellplatten injiziert. Es wurde zusätzlich immer auch unfraktioniertes Rohgift

injiziert (1:20 verdünnt, je 6 µl pro Well). Da die Trennung auf einer analytischen Säule

durchgeführt wurde, konnte mit jedem Fraktionierungslauf lediglich Material für ein

Experiment aufgetrennt werden.

In den nachfolgenden Kapiteln werden die Ergebnisse für die verschiedenen Schlangengifte

vorgestellt. In den dargestellten Chromatogrammen sind lediglich ausgewählte Fraktionen

gekennzeichnet. Im Anhang der Arbeit ist die detaillierte Dokumentation der Fraktionierung

für das jeweilige Gift aufgeführt.


Ergebnisse 88

3.2.4.1 Gift der Puffotter Bitis arietans

Relative Absorption

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

% Puffer B

Retentionszeit (min)

Abb. 3.25: Fraktionierung des Giftes einer Puffotter Bitis arietans mit RP-HPLC. Die Trennung

erfolgte auf einer C 4 -Säule mit 5 µm Partikelgröße und 300 Ångström Porenweite, bei einer Flussrate von 1

ml/min. Eluiert wurde über einen Lösungsmittelgradienten (Acetonitril) Es wurde insgesamt ≈ 1mg Gift

aufgetragen. Die Abbildung zeigt das Chromatogramm des „Fraktionierungs-Laufes“. Das Gift wurde dabei

in 19 Fraktionen aufgetrennt. Die Absorption wurde bei 214 nm detektiert. () Elutions-Gradient (% Puffer

B, Acetonitril).

Abbildung 3.25 zeigt das Chromatogramm des Giftes der Puffotter. Man kann erkennen, dass

das Gift aus vielen verschiedenen Komponenten besteht. In dem Chromatogramm lassen sich

neben etwa 5 Hauptpeaks eine Vielzahl kleinerer Peaks ausmachen Das Gift konnte in

insgesamt 19 Fraktionen aufgetrennt werden, die dann auf den Zelllinien getestet wurden.

Tabelle 3.10 zeigt die Ergebnisse dieser Experimente.


Ergebnisse 89

Tabelle 3.10: Test von 19 Fraktionen (F1-19) des Giftes einer Puffotter (Bitis arietans) auf HCN-spezifische

Wirkung. Das Rohgift wurde ebenfalls getestet. Der experimentelle Ablauf und die entsprechende

Datenanalyse sind unter 3.2.1 beschrieben und in Abb. 3.22 exemplarisch dargestellt.

HCN1

Score HCN1 HCN4 EAG IRK

Bitis arietans

HCN4

1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

Gift

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

F10

F11

F12

F13

F14

F15

F16

F17

F18

F19

Tabelle 3.10 zeigt, dass weder für HCN1 noch für HCN4 ein potentieller „Hit“ identifiziert

werden konnte. Einige Giftfraktionen erzielen einen Score von (). Hier liegen die

Fluoreszenzantworten jedoch nur minimal (0,5-1.5%) außerhalb des grünen Bereichs. Auf ein

falsch-negatives Ergebnis deutete bei diesen Fraktionen nichts hin. Das Rohgift zeigte

lediglich eine unspezifische Wirkung auf alle Zellen.


Ergebnisse 90

3.2.4.2 Gift der Wiesenotter Vipera ursinii

F1

100

2,5

90

Relative Absorption

2,0

1,5

1,0

F21

80

70

60

50

40

30

% Puffer B

0,5

F23

20

10

0

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Retentionszeit (min)

Abb.3.26 Fraktionierung des Gifts einer Wiesenotter (Vipera ursinii) mit RP-HPLC. Das Gift wurde

in 24 Fraktionen aufgetrennt. Die Trennung erfolge unter den gleichen Bedingungen wie in Abb. 3.25

Das Chromatogramm des Giftes dieser Schlange zeigt 6 prominente Hauptpeaks und

zusätzlich viele kleinere Peaks (Abb. 3.26). Das Gift wurde in 24 Fraktionen aufgetrennt. Die

Fraktionen wurden auf HCN-spezifische Wirkstoffe untersucht. In Abbildung 3.27 sind die

Ergebnisse des Wirkstoffscreenings für diese Fraktionen dargestellt. Es sind sowohl die

Ergebnisse der statistischen Datenanalyse (Tabelle) als auch die Fluoreszenzverläufe

dargestellt.


1

Ergebnisse 91

(A) Flp-hHCN1/bEAG1

HCN1/EAG (B) HCN4/EAG Flp-hHCN4/bEAG1

(C) FlpIn-bEAG1 (D) FlpIn-hK IRK

ir 2.1

1

∆F/F (%)

80

60

20

10

0

-10

-20

-30

-40

R

1

600 s

∆F/F (%)

80

20

10

0

-10

-20

-30

-40

R

1

600 s

∆F/F (%)

100

80

20

10

0

-10

-20

-30

-40

R

1

600 s

∆F/F (%)

30

20

10

0

-10

-20

-30

-40

1

R

600 s

10

10

10

10

2

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

7 s

1

21

23

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

7 s

1

21

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

7 s

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

7 s

HCN1

Score HCN1 HCN4 EAG1 IRK

V.u.

HCN4

1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

Gift

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

F10

F11

F12

F13

F14

F15

F16

F17

F18

F19

F20

F21

F22

F23

F24

Abb. 3.27: Untersuchung von 24 Fraktionen des Giftes einer Wiesenotter (Vipera ursinii) auf HCNspezifische

Wirkungen. Es wurde ebenfalls das Rohgift getestet. Der experimentelle Ablauf und die

entsprechende Datenanlyse sind unter 3.2.1 beschrieben und in Abb. 3.22 exemplarisch dargestellt. Weitere

Erläuterungen finden sich im Text.

Wie die Tabelle im unteren Teil der Abbildung zeigt, wird das Rohgift als potentieller „Hit“

für HCN4 erkannt (). Daneben erzielen einige Fraktionen einen Score von (). Die

Fluoreszenzverläufe in der oberen Teilabbildung zeigen, dass die Ergebnisse dieses

Experimentes nicht leicht zu interpretieren sind. Man kann erkennen, dass in

Messkonfiguration (1) die Injektion von Rohgift (R) und Fraktion 1 zu großen

Fluoreszenzantworten führt. Fraktion 1 führt allerdings nur bei den Zellen, die EAG-Kanäle

exprimieren, zu einer z.T. transienten Fluoreszenzzunahme. Bei der IRK-Zelllinie kann man


Ergebnisse 92

dagegen bei Fraktion 1 eine transiente Abnahme der Fluoreszenz erkennen. Das könnte auf

einen EAG-spezifischen Effekt hindeuten. Das Rohgift führt in (1) dagegen bei allen Zellen

gleichermaßen zu einer transienten Fluoreszenzabnahme. In diesem Fall resultiert der hohe

Score wohl eher aus einer unspezifischen Wirkung auf die Zelllinien.

Bei Fraktion 1 ist dagegen möglicherweise eine Mischung aus unspezifischer und spezifischer

Wirkung zu beobachten. Die Fluoreszenzantwort bei Fraktion 1 ist in Messkonfiguration (2)

rot dargestellt. Bei beiden HCN-Zelllinien zeigt sich eine blockierende Wirkung, die nahezu

identisch zur Positivkontrolle (ZD7288) ist. Auch die Fraktionen 21 und 23 zeigen in dieser

Messkonfiguration einen deutlichen blockierenden Effekt auf die HCN-Zelllinien. Allerdings

nicht in Messkonfiguration (1). Für alle drei Fraktionen lässt sich ein falsch-negatives

Ergebnis nicht völlig ausschließen. Eine erneute Isolierung und Untersuchung dieser

Fraktionen könnte vielversprechend sein. Zumal das Chromatogramm in Abbildung 3.27

zeigt, dass man diesen Fraktionen einzelne Peaks zuordnen kann.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden weitergehende Experimente mit diesem Gift jedoch nicht

durchgeführt.

3.2.4.3 Gift der Königskobra (Ophiophagus hannah)

Relative Absorption

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Retentionszeit (min)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

% Puffer B

Abb.3.28 Fraktionierung des Gifts einer Königskobra (Ophiophagus hannah) mit RP-HPLC. Das Gift

wurde in 17 Fraktionen aufgetrennt Die Trennung erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie in Abb. 3.25

Abbildung 3.28 zeigt das Chromatogramm des Giftes einer Königskobra. In dem

Chromatogramm lassen sich neben etwa 5 Hauptpeaks ebenfalls viele kleinere Peaks

ausmachen. Vergleicht man dieses Chromatogramm mit den Chromatogrammen in Abb. 3.25

bzw. 3.26, so fällt auf, dass die Retentionszeiten der Komponenten im Königskobra-Gift


Ergebnisse 93

durchschnittlich eher kürzer sind, als bei den bisher untersuchten Giften. Daran lässt sich

erkennen, dass das Kobragift aus hydrophileren Komponenten zusammengesetzt ist.

Das Gift konnte in insgesamt 17 Fraktionen aufgetrennt werden, die anschließend untersucht

wurden. Tabelle 3.11 zeigt die Ergebnisse dieses Experimentes. Es wurde kein potentieller

„Hit“ identifiziert. Fraktion 7 erzielte einen Score von (). Auf ein falsch-negatives

Ergebnis deutete nichts hin. In Messkonfiguration 2 lagen hier die Fluoreszenzantworten nur

ganz knapp (1-2%) außerhalb des grünen Bereiches. Prinzipiell zeigte diese Fraktion das

gleiche unspezifische Wirkungsmuster wie das Rohgift.

Tabelle 3.11: Test von 17 Fraktionen (F1-17) des Giftes einer Königskobra (Ophiophagus hannah) auf eine

HCN-spezifische Wirkung. Das Rohgift wurde ebenfalls getestet. Der experimentelle Ablauf und die

entsprechende Datenanalyse sind unter 3.2.1 beschrieben und in Abb. 3.22 exemplarisch dargestellt.

HCN1

Score HCN1 HCN4 EAG IRK

O.h.

HCN4

1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

Roh-Gift

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17


Ergebnisse 94

3.2.4.4 Gift der „Ägyptischen Kobra“ (Naja haje)

2,5

F4

100

90

Relative Absorption

2,0

1,5

1,0

0,5

80

70

60

50

40

30

20

% Puffer B

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Retentionszeit (min)

10

0

Abb. 3.29 Fraktionierung des Gifts einer „Ägyptischen Kobra“ Kobra (Naja Haje) mit RP-HPLC.

Das Gift wurde in 13 Fraktionen aufgetrennt. Die Trennung erfolge unter den gleichen Bedingungen wie

in Abb. 3.25

In dem Chromatogramm in Abb 3.29 lassen sich 3 sehr prominente Hauptpeaks neben einigen

kleineren Peaks erkennen Das Chromatogramm ähnelt dem des Giftes der Königskobra. Das

Gift wurde in 13 Fraktionen aufgetrennt und anschließend auf den Zelllinien getestet. Tabelle

3.12 zeigt die Ergebnisse für dieses Experiment.

Tabelle 3.12: Test von 13 Fraktionen (F1-13) des Giftes einer „Ägyptischen Kobra“ (Naja Haje) auf HCNspezifische

Wirkung. Das Rohgift wurde ebenfalls getestet. Der experimentelle Ablauf und die entsprechende

Datenanalyse sind unter 3.2.1 beschrieben und in Abb. 3.22 exemplarisch dargestellt.

HCN1

Score HCN1 HCN4 EAG IRK

Naja haje

HCN4

1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

Gift

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

F10

F11

F12

F13


Ergebnisse 95

Fraktion 4 wird als potentieller „Hit“ für HCN1 identifiziert. Allerdings konnte einfach

erkannt werden, dass es sich um ein falsch-positives Ergebnis handelt. Fraktion 4 führte in

Messkonfiguration (1) bei den HCN1/EAG-Zellen zu einer Fluoreszenzänderung von 100%.

Der Score von () ist damit bedeutungslos, denn die Zellen wurden schlichtweg lysiert.

Ähnliche Effekte konnte man beim Rohgift beobachten, hier aber auch bei den anderen

Zelllinien. Warum Fraktion 4 nur bei den HCN1/EAG Zellen einen so dramatischen Effekt

hatte ist unklar. Fraktion 4 beinhaltet den ersten der 3 Hauptpeaks des Chromatogramms.

Insgesamt kann für keine der Gift-Fraktionen eine HCN-spezifische Wirkung beobachtet

werden.

3.2.4.5 Gift der Kobra Naja siamensis

2,5

F8/ 9 / 10

100

90

Relative Absorption

2,0

1,5

1,0

0,5

80

70

60

50

40

30

20

% Puffer B

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Retentionszeit (min)

10

0

Abb.3.30 Fraktionierung des Gifts der Kobra Naja siamensis mit RP-HPLC. Das Gift wurde in 15

Fraktionen aufgetrennt. Die Trennung erfolge unter den gleichen Bedingungen wie in Abb. 3.25

Ein weiteres Schlangengift stammte von der Kobra Naja siamensis. Auch in dem

Chromatogramm diese Giftes lassen sich 3 sehr prominente Hauptpeaks, neben einer

Viehlzahl kleinerer Peaks ausmachen. Das Gift wurde in 15 Fraktionen aufgetrennt, die

anschließend auf HCN-spezifische Wirkstoffe untersucht wurden


9

Ergebnisse 96

(A) Flp-hHCN1/bEAG1

HCN1/EAG (B) Flp-hHCN4/bEAG1

HCN4/EAG (C) FlpIn-bEAG1 (D) FlpIn-hK IRK

ir 2.1

1

∆F/F (%)

30

20

10

0

-10

-20

-30

-40

-50

-60

-90

9

R

600 s

10

8

∆F/F (%)

50 600 s

40

30

20

10

0

-10

-20

9

-30

-40

8

10

-50

R

-90

∆F/F (%)

60

50

40

30

20

10

0

-10

-20

-30

-40

-50

-90

600 s

10

8

R

∆F/F (%)

80

60

40

20

0

-20

-40

-60

-100

600 s

10

R

8

2

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

7 s

10

9

8

∆F/F (%)

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

7 s

8

9

10

∆F/F (%)

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

7 s

∆F/F (%)

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

7 s

HCN1

Score Naja

HCN1 HCN4 EAG IRK

HCN4 .siamensis. 1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

Gift

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

F10

F11

F12

F13

F14

F15

Abb. 3.31: Test von 15 Fraktionen des Giftes der Kobra (Naja siamensis) auf HCN-spezifische Wirkungen.

Es wurde ebenfalls das Rohgift getestet. Der experimentelle Ablauf und die entsprechende Datenanlyse sind

unter 3.2.1 beschrieben und in Abb. 3.22 exemplarisch dargestellt. Weitere Erläuterungen finden sich im Text.

Abbildung 3.31 zeigt die Ergebnisse für den Test dieses Giftes. Neben der Tabelle mit den

Ergebnissen der statistischen Datenanalyse sind auch die Fluoreszenzverläufe dargestellt.

Fraktion 9 wird als potentieller „Hit“ mit blockierender Wirkung auf HCN1 und auch HCN4

erkannt. Jeweils mit dem maximalen Score von (). Daneben gibt es noch einige

Fraktionen mit einem Score von ().

Die Fluoreszenzverläufe in Messkonfiguration (1) zeigen, dass die Fraktionen 8 und 10, und

auch das Rohgift, zu großen unspezifischen Fluoreszenzänderungen bei allen Zellen führen.

Dagegen sind die Fluoreszenzänderungen nach Injektion von Fraktion 9 (rot dargestellt) nur

bei Zellen, die HCN-Kanäle exprimieren, zu beobachten. Die Fluoreszenzantworten bei

Fraktion 9 sind transient und liegen gegen Ende der Mesung um wenige Prozent ausserhalb

des grünen Bereiches für die Negativkontrolle. In Messkonfiguration (2) kann man erkennen,

dass die Fluoreszenzantworten auf die Cs + -Injektion bei Fraktion 9 deutlich außerhalb des 3σ-


Ergebnisse 97

Intervalls liegen. Es scheint tatsächlich eine spezifische blockierende Wirkung auf HCN1

bzw. HCN4 vorzuliegen. Vor allem bei Zellen, die HCN4 exprimieren, sind die

Fluoreszenzantworten in (2) nahezu identisch zur Positivkontrolle (ZD7288). Das Ergebnis

der Datenanalyse für Fraktion 9 lässt sich anhand der Fluoreszenzverläufe bestätigen.

Bei Fraktion 8 und 10 deuten die Fluoreszenzantworten in Messkonfiguration (2) daraufhin,

dass möglicherweise eine Mischung aus spezifischer Wirkung in Messkonfiguration (2) und

unspezifischer Wirkung in Messkonfiguration (1) zu beobachten ist. In (2) zeigen diese

Fraktionen einen ähnlichen Effekt wie Fraktion 9. Hier könnte also ein falsch-negatives

Ergebnis vorliegen.

In dem Chromatogramm in Abbildung 3.30 sind die Fraktionen 8, 9 und 10 gekennzeichnet.

Die Fraktionen entsprechen den drei Hauptpeaks des Chromatogramms. Die drei Peaks sind

nicht vollständig getrennt, sie gehen vielmehr ineinander über. Man kann nicht davon

ausgehen, dass jeder Peak einer einzelnen Substanz entspricht. Sehr wahrscheinlich verbergen

sich unter jedem dieser Peaks mehrere unterschiedliche Substanzen, mit ähnlicher

Hydrophobizität. Das könnte bedeuten, dass in diesem Fall unspezifisch wirkende

Komponenten zusammen mit spezifischen Wirkstoffen für HCN-Kanäle eluieren. Eine

weiterführende Analyse dieser drei Peaks schien erfolgsversprechend zu sein. Vor allem, da

sie anscheinend die Hauptkomponenten des Giftes enthalten. Ich habe untersucht, ob sich eine

HCN-spezifische Wirkung dieser Fraktionen, insbesondere bei dem potentiellen „Hit“

Fraktion 9, in einem erneuten Test bestätigen lässt.

Da nach dem ersten Test nicht mehr genügend Material für ein zweites Experiment zur

Verfügung stand, mussten die Fraktionen zunächst neu isoliert werden. Um ausreichend

Material für eine weiterführende Untersuchungen zu erhalten, habe ich drei

aufeinanderfolgende Fraktionierungs-Läufe durchgeführt. Ich habe jeweils 1 mg des Giftes

aufgetragen, die drei Hauptpeaks des Chromatogramms aufgefangen und diese dann gepoolt.

Anschließend wurde die Wirkung der drei Fraktionen unter identischen Bedingungen erneut

getestet. Dabei wurde die gleiche Menge von jeder Fraktion eingesetzt, wie im ersten

Experiment. Tabelle 3.13 zeigt das Ergebnis dieser Untersuchung.

Tab. 3.13 Erneuter Test der Fraktionen 8, 9 und 10 des Giftes der Kobra (Naja siamensis) auf ihre HCNspezifische

Wirkung. Es wurden die gleichen Bedingungen gewählt, wie in den vorangegangenen

Experimenten

HCN1

Score HCN1 HCN4 EAG IRK

Fraktion 8/9/10

HCN4

1 2 1 2 1 2 1 2

ZD7288

F8

F9

F10


Ergebnisse 98

Man kann Tabelle 3.13 entnehmen, dass alle drei Fraktionen in Messkonfiguration (1) eine

unspezifische Wirkung zeigen. Fraktion 9 wird nicht als potentieller „Hit“ erkannt und zeigt

keine HCN-spezifische Wirkung. Lediglich Fraktion 8 erhält einen Score von (). Dabei

liegen hier die Fluoreszenzantworten in Messkonfiguration (2) nur 2-3% ausserhalb des

grünen Bereichs. Auch hier kann man von einem negativen Ergebnis ausgehen. Die

Ergebnisse für die drei Fraktionen konnten nicht reproduziert werden. Es konnte in dem

neuen Test keine spezifische Wirkung der Fraktionen auf die HCN-Kanallinien in dem

beobachtet werden. Es ist unklar, weshalb die vielversprechenden Ergebnisse des ersten Tests

nicht bestätigt werden konnten.

Anhand des verbleibenden Materials habe ich versucht herauszufinden, welche Substanzen

sich unter den drei Hauptpeaks des Chromatogramms verbergen.. Ich habe dafür die

Fraktionen zunächst auf ein SDS-Gel aufgetragen, um die Komponenten anhand ihres

Molekulargewichtes zu trennen.

Das SDS-Gel in Abbildung 3.32 zeigt nahezu identische Bandenmuster für die Fraktionen 9

und 10. Man kann hier jeweils drei prominente Banden erkennen. Eine Hauptkomponente in

diesen Fraktionen stellen Peptide dar, mit einem Molekulargewicht von etwa 6 kDa. Daneben

finden sich noch etwas größere Peptide und Proteine von etwa 9,5 bzw. 19 kDa.

MW (kDa)

Fraktion

8 9 10

MW (kDa)

97

64

45

30

20

14,4

19

15

9,5

6

Abb. 3.32 SDS-Gelelekrophorese der Fraktionen 8, 9 und 10 des Giftes der Kobra Naja siamensis. Links

ist der Größenmarker mit den entsprechenden Molekulargewichten dargestellt. Die apparenten

Molekulargewichte der einzelnen Banden von Fraktion 8, 9 und 10 wurden extrapoliert. Das Gel wurde mit

Coomassie gefärbt.

Wie bei Fraktion 9 und 10, so lässt sich auch bei Fraktion 8 die prominente Bande bei ≈ 6

kDa erkennen. Neben dieser Bande zeigen sich bei Fraktion 8 lediglich einige schwache

Banden, die Molekulargewichten von ≈ 9 bzw. 15 und 17 kDa entsprechen.


Ergebnisse 99

Es ist bekannt, dass Schlangengifte Peptide und Proteine mit Molekulargewichten zwischen

5-150 kDa enthalten (siehe 1.4.4), wobei die höhermolekularen Proteine meist Enzyme sind.

Peptid-Toxine, die man in Schlangengiften findet, sind alle zwischen 5 und 10 kDa groß. Alle

drei Fraktionen enthalten also Peptid-Toxine als Hauptkomponenten. Dabei kann man davon

ausgehen, dass die jeweiligen Banden nicht für einzelne Toxine stehen, sondern sich

vermutlich aus verschiedenen Peptid-Toxinen zusammensetzen. Obwohl die Toxine zum Teil

sehr unterschiedliche Wirkungen vermitteln, ist ihre molekulare Struktur nahezu identisch.

Deshalb ist es schwer sie anhand des Molekulargewichtes aufzutrennen

In Zusammenarbeit mit Dr. Eberhard Krause vom Forschungsinstitut für Molekulare

Pharmakologie in Berlin wurden die drei Fraktionen massenspektrometrisch untersucht. Auch

hier zeigte sich, dass die drei Fraktionen in ihrer Zusammensetzung sehr ähnlich sind. Bei der

Bestimmung der molekularen Massen wurden für jede Fraktion Peptide von ≈ 6,7 kDa als

Hauptkomponente nachgewiesen. Die Proben wurden anschließend tryptisch verdaut und

weiteren massenspektometrischen Untersuchungen unterzogen. Die Peptide-Fingerprints

wurden mit Datenbankeinträgen verglichen. Einige wenige Peptid-Fragmente (insgesamt drei)

konnten zugeordnet werden. Dabei wurde eindeutig das „three-finger“-Toxin Cytotoxin-2

und Variationen davon in jedem der drei Peaks identifiziert. Dass in der

massenspektometrischen Analyse der Peptide-Fingerprints lediglich Cytotoxin-2 identifiziert

wurde bedeutet nicht, dass in den Fraktionen keine anderen Toxine enthalten sind. Nur für

wenige bekannte Peptidtoxine aus Schlangengiften liegen Datenbankeinträge vor, was eine

Identifizierung von Toxinen anhand von Peptide-Fingerprints schwierig macht. Deshalb

konnten nur wenige Peptidfragmente zugeordnet werden.

Es ist bekannt, dass Cytotoxine aus Kobragiften auf bestimmte Zellen wie z.B. Myozyten,

Erythrozyten, Lmphozyten und interessanter Weise auch auf Tumorzellen, zytotoxische

Wirkung haben und zur Lyse dieser Zellen führen können. Der Wirkungsmechanismus dieser

Toxine ist nicht genau bekannt. Es wird vermutet, dass Cytotoxine, dazu gehören auch die

sogenannten Cardiotoxine, in die Membran gelangen, dort Poren formen und so die Zellen

zerstören (Überblick: Z.B. TSETLIN V., 1999). Die Tatsache, dass in den drei Fraktionen

Cytotoxin-2 nachgewiesen werden konnte, erklärt zumindest den unspezifischen Effekt, den

alle drei Fraktionen auf die Kulturzellen zeigten.


Diskussion 100

4. Diskussion

HCN-Kanäle sind unter anderem an der rhythmischen Aktivität im Herzen und Gehirn

beteiligt. Sowohl aus wissenschaftlicher als auch medizinischer Sicht ist es von großem

Interesse, neue, hochspezifische Wirkstoffe zu finden, die HCN-Kanäle beeinflussen. In

dieser Arbeit wurde für HCN1- und HCN4-Kanäle ein Hochdurchsatz-Testverfahren im

Mikrotiterplattenformat entwickelt. Mit Hilfe spannungssensitiver Farbstoffe wurde das

Membranpotenzial von Kulturzellen beobachtet, die HCN-Kanäle heterolog exprimieren.

Bekannte Wirkstoffe für HCN-Kanäle wurden mit dem Testverfahren charakterisiert.

Anschließend wurden Tiergifte auf HCN-spezifische Wirkstoffe untersucht. Dabei wurden

einige Gifte identifiziert, die möglicherweise spezifisch auf HCN-Kanäle wirken.

4.1 Entwicklung eines HTS-Assays

Wirkstoffe für Ionenkanäle werden in der biomedizinischen Grundlagenforschung als

„Werkzeuge“ benutzt, um Eigenschaften und physiologische Funktionen von Ionenkanälen zu

untersuchen. Darüber hinaus hat sich die pharmakologische Beeinflussung von Ionenkanälen

bei der medikamentösen Therapie einer Vielzahl von Krankheiten als sehr erfolgreich

erwiesen. Fünfzehn Prozent der 100 meistverkauften Medikamente wirken auf Ionenkanäle

(ENGLAND, 1999). Die Indikationsgebiete sind beispielsweise neurologische Erkrankungen,

Bluthochdruck und Herzrhythmusstörungen. Immer mehr Erkrankungen werden mit

Ionenkanälen in Verbindung gebracht (Überblick: CLARE ET AL., 2000; CURRAN, 1998;

WEINREICH & JENSCH 2000). Die Suche nach neuen potenten Wirkstoffen für diese Kanäle

erfordert die Entwicklung von Assays, die es erlauben, mit möglichst mit hohem Durchsatz

den Einfluss von Substanzen auf die Aktivität des jeweiligen Ionenkanal-Typs zu testen.

Für die Untersuchung der Kanaleigenschaften gilt die Patch-Clamp-Technik als „Gold-

Standard“. Lange Zeit erschien diese Technik aufgrund des sehr geringen Durchsatzes als

ungeeignet für ein Wirkstoffscreening. Um die Patch-Clamp-Technik als HTS-Technologie

nutzbar zu machen, wird die Automatisierung dieses Verfahrens intensiv vorangetrieben.

Mittlerweile sind die ersten automatisierten Patch-Clamp-Stationen auf dem Markt. Erste viel

versprechende Assays, z.B. für hERG-Kanäle, sind mit diesen Systemen bereits entwickelt

worden (DUBIN ET AL., 2005). Vor allem für Assays mit spannungsaktivierten Ionenkanälen,

wie den HCN-Kanälen, ist diese Technologie sehr vielversprechend. Sie ermöglicht, die

Wirkung von Substanzen auf die jeweiligen Ionenkanäle unter physiologischen Bedingungen


Diskussion 101

zu testen. Nicht-invasive, zelluläre Assays erlauben allerdings momentan immer noch eine

schnellere Wirkstoffsuche.

Für Kalium-Kanäle, wie die spannungsabhängigen hERG, K V 1.3, K V 7.2- Kanäle, sowie K ATP -

Kanäle wurden klassische Rb + -Fluß-Assays im Mikrotiterplattenformat entwickelt (GILL ET

AL., 2003; CHENG ET AL. 2003.; TANG ET AL., 2001; DANIELS ET AL., 1991; HANSON ET AL.,

1999). Dabei wird die Akkumulation von radioaktivem Rb + in den Kulturzellen nach einer

gezielten Aktivierung des jeweiligen Kalium-Kanals gemessen. Die Aktivierung der Kanäle

erfolgt dabei meist durch eine Depolarisation (K + -Injektion) oder durch die Zugabe bekannter

Kanal-Öffner. Wirkstoffe werden daraufhin getestet, ob sie die Rb + -Akkumulation

beeinflussen. Der experimentelle Aufwand solcher Assays ist sehr groß, weshalb sich diese

Verfahren bisher nicht durchsetzen konnten. Ich habe einen Assay entwickelt, der es erlaubt,

den Einfluß von Wirkstoffen auf die Aktivität von HCN-Kanälen anhand von

Fluoreszenzänderungen „auszulesen“. Dafür wurde das Membranpotenzial von Zellen, die

HCN-Kanäle exprimieren, mit spannungssensitiven Fluoreszenzfarbstoffen verfolgt. Ich

konnte zeigen, dass das sogenannte „MembraneKit“ besonders gut für solche Messungen

geeignet ist. BAXTER ET AL. (2002), WHITEAKER ET AL. (2001) und WOLF ET AL. (2003)

kommen ebenfalls zu dem Ergebnis, dass das MembraneKit größere und schnellere

spannungsabhängige Fluoreszenzänderungen zeigt als Farbstoffe, die bisher für HTS-Assays

verwendet wurden (z.B. DiBAC 4 (3)).

Das MembraneKit wurde im Rahmen dieser Arbeit detailliert charakterisiert. Die

Kombination von Patch-Clamp-Experimenten mit Fluorimetrie hat ergeben, dass sich die

Fluoreszenzintensität des MembraneKits um 2,5%/mV ändert. BAXTER ET AL. (2002) haben

für das MembraneKit ein ∆F/F von 1-1,2%/mV ermittelt. Dieser Wert beruhte allerdings auf

einer Abschätzung.

Das MembraneKit wurde bereits in einigen anderen Assays erfolgreich eingesetzt, z.B. für

Glycin-Rezeptoren, exzitatorische Aminosäure-Transporter und K ATP -Kanäle (JENSEN &

BRAUNER-OSBORNE, 2004; JENSEN & KRISTIANSEN, 2004; WHITEAKER ET AL., 2001).

Für HTS-Assays sind neben dem MembraneKit auch innovative Farbstoff-Kombinationen

interessant, bei denen spannungsabhängig Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET)

stattfindet (GONZALEZ & MAHER, 2002; GONZALEZ & TSIEN, 1997; GONZALEZ &

TSIEN, 1995). Seit einiger Zeit ist dieses System zur Detektion des Membranpotenzials bei der

Firma Invitrogen erhältlich. Die Zeitkonstante der Fluoreszenzänderung ist bei dem FRET-

System schneller als bei dem MembraneKit. Allerdings zeigt das MembraneKit größere

spannungsabhängige Fluoreszenzänderungen (WOLF ET AL., 2003). Es wäre interessant zu


Diskussion 102

untersuchen, ob dieses neue Farbstoffsystem die Qualität des HCN-Kanal-Assays weiter

verbessern kann.

Bei der Entwicklung von fluoreszenzoptischen HTS-Assays für spannungsabhängige

Ionenkanäle, die auf der Messung des Membranpotenzials basieren, stellt sich immer die

Frage, wie sich eine Änderung der Kanalaktivität anhand von Membranpotenzialänderungen

registrieren lässt. Oftmals sind die Kanäle unter Ruhebedingungen nicht aktiv. Nachfolgend

gebe ich ein paar Beispiele für etablierte Assays:

Spannungsabhängige Natrium-Kanäle werden meist durch gezielte Injektion eines bekannten

„Kanal-Öffners“ aktiviert, was zu einer messbaren Depolarisation der Zellen führt. VICKERY

ET AL. (2003) haben mit dieser Methode die pharmakologischen Eigenschaften von Na v 1.8,

Na v 1.2a und Na v 1.5 untersucht. Die Kanäle wurden dabei durch Injektion von Veratridin bzw.

Deltamethrin aktiviert. Der Einfluß verschiedener Wirkstoffe auf die Amplitude der

Depolarisation wurde mit dem MembraneKit gemessen.

Bei Kalium-Kanälen wird dagegen oft die Methode des sog. „permeant ion jump“ angewandt

(Übersicht z.B. WORLEY & MAIN, 2002). Das Prinzip basiert darauf, dass viele Kalium-

Kanäle in den Kulturzellen eine mehr oder weniger ausgeprägte Grundaktivität zeigen. Die

Injektion einer hohen Kalium-Konzentration (permeant ion) zum extrazellulären Medium

führt in diesem Fall zu einer gut messbaren Depolarisation. In Assays für hERG-Kanäle und

hElk-Kanäle wurde der Einfluß potentieller Wirkstoffe auf die Amplitude der K + -induzierten

Depolarisation als Messparameter verwendet (z.B. NETZER ET AL., 2001; BAXTER ET AL.,

2002). Ich konnte zeigen, dass ein Assay nach diesem Prinzip auch für HCN-Kanäle möglich

ist. Die Fluoreszenzantworten der Kulturzellen auf eine Kalium-Injektion werden von den

HCN-Kanälen beeinflusst. Ich konnte ebenfalls zeigen, dass Assays dieser Art auch für

bEAG1 und IRK1-Kanäle funktionieren. Ein Nachteil der „permeant ion jump“ Methode ist

allerdings, dass nach der Injektion der Testsubstanzen in einer zweiten Injektion KCl injiziert

werden muss. Das erhöht den experimentellen Aufwand und ist zudem kostenintensiv. Ein

weiterer Nachteil ist, dass die Bedingungen, unter denen die Substanzen getestet werden eher

unphysiologisch sind.

Ich konnte zeigen, dass der Einfluß von Wirkstoffen auf die Aktivität der HCN-Kanäle direkt

anhand von Membranpotenzialänderungen nachweisbar ist. Das hat die Entwicklung eines

experimentell einfachen Assays ermöglicht, bei dem der Einfluß potentieller Wirkstoffe auf

die Kanalaktivität unter physiologischen Bedingungen getestet werden kann. Die HCN-

Kanäle wurden sowohl in Wildtypzellen als auch in Kombination mit EAG-Kanälen

exprimiert. Es zeigte sich, dass die HCN-abhängigen Spannungsänderungen je nach


Diskussion 103

verwendetem Zellsystem unterschiedlich sind. Beispielsweise ist die Hyperpolarisation nach

der Zugabe bekannter HCN-Kanalblocker bei der einfachstabilen HCN1-Zelllinie etwas

ausgeprägter als bei der doppeltstabilen HCN1/EAG-Zelllinie. Genau umgekehrt verhält es

sich für die HCN4- und HCN4/EAG-Zelllinien: Hier findet man die größeren Amplituden bei

der HCN4/EAG-Zelllinie. Die Aktivierung von HCN4 über Colforsin ändert dieses

Verhältnis: Unter diesen Bedingungen zeigt die einfachstabile HCN4-Zelllinie die größere

Hyperpolarisation.

Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass sich für einen optimalen Assay die verschiedenen

Leitfähigkeiten der Zellen in der richtigen Balance befinden müssen. Es ist denkbar, dass bei

Kombination der HCN-Kanäle mit einem anderen Ionenkanal als EAG, noch größere HCNabhängige

Spannungsänderungen zu beobachten sind.

4.2 Wirtschaftlichkeit des HTS-Assays

Die Entwicklung von Wirkstoffen, die Ionenkanäle beeinflussen, wurde in den letzten Jahren

stark vorangetrieben. Weltweit wird mit Medikamenten, die auf Ionenkanäle wirken, ein

Jahresumsatz von ≈ 6 Milliarden Dollar erzielt (GILL ET AL., 2003). Durchschnittlich dauert es

von der Entdeckung eines Wirkstoffes ca. 12 Jahre bis zu dessen Markteinführung als

Medikament. Nur ein Bruchteil der entdeckten Wirkstoffe schafft es überhaupt bis zur

Marktreife. Eine Tatsache, die die Pharmaforschung sehr kostenintensiv macht. Die

durchschnittlichen Forschungs- und Entwicklungskosten eines Medikamentes betragen ≈ 800

Millionen Dollar. In Anbetracht dieser enormen Kosten ist die Wirtschaftlichkeit eines HTS-

Assays ein wichtiges Kriterium. Die Wirtschaftlichkeit eines Assays kann anhand der Kosten,

die pro Datenpunkt (Test eines Wirkstoffes) anfallen, beurteilt werden.

Da bei den Tiergiften ein komplexes Muster aus spezifischer und unspezifischer Wirkung

auftreten konnte, wurde ein verhältnismäßig aufwendiges experimentelles Design gewählt.

Ich habe die Kosten abgeschätzt, die der Test eines Giftes (bzw. Giftfraktion) auf HCN1-

bzw. HCN4-Kanäle verursacht hat. Hierbei wurden Personalkosten nicht berücksichtigt.

Welche Kosten spielen eine Rolle? Standardpipettenspitzen stellen in der Molekularbiologie

kaum noch einen signifikanten Kostenfaktor dar. Anders ist die Situation bei Pipettenspitzen

für automatisierte Pipettiersysteme, insbesondere für das 384 Multiwellplattenformat. Die

Kosten für eine einzelne Pipettenspitze liegen bei etwa 10 ct. Ich habe jedes Gift in einer

Doppelbestimmung sowohl auf den HCN-Kanalzelllinien, als auch auf zwei unterschiedlichen

Kontrollzelllinien getestet. Es wurden pro Multiwellplatte und Zelllinie jeweils 8

Negativkontrollen bzw. Positivkontrollen durchgeführt. Zudem erfolgte der Test in zwei


Diskussion 104

Schritten (Messkonfiguration 1 und Messkonfiguration 2), mit jeweils einer Injektion. Alleine

für die Pipettenspitzen ergeben sich ≈ 1,25 € pro Datenpunkt bzw. Gift.

Die Beladung einer 384 Multiwellplatte mit Farbstoff verursacht Kosten von ≈ 25 €. Das

entspricht ≈ 30 ct/Gift. Dazu kommen noch die Multiwellplatte selber mit etwa 12 ct/Gift.

Sieht man von weiteren Aufwendungen wie z.B. für Verbrauchsmaterialien in der Zellkultur

ab, lassen sich insgesamt mindestens 1,75 € pro Gift und HCN-Isoform ermitteln.

Diese Kosten sind für ein Hochdurchsatz-Screening im industriellen Maßstab verhältnismäßig

hoch und nicht wirtschaftlich. Bedenkt man, dass große Pharmaunternehmen im Jahre 2005

≈ 1.000.000 Substanzen pro Wirkstoffscreening testen (GILL ET AL. 2003), wird deutlich, wie

wichtig die Kostenoptimierung meines HTS-Assays ist.

Der hohe Z-Faktor meines Assays lässt allerdings Einsparmöglichkeiten zu. Vor allem wenn

man bedenkt, dass bei einem industriellen Wirkstoffscreening solch komplexe

Wirkungsspektren, wie sie beiden Tiergiften beobachtet wurden, nicht zu erwarten sind. Hier

wird jede Substanz einzeln und in definierter Konzentration (meist 1-10 µM) getestet. Die

Substanzen einer organischen Wirkstoffbibliothek wurden schon vorher auf mögliche

zytotoxische Wirkungen getestet. Das experimentelle Design des Assays kann an diese

Situation angepasst werden.

Eine Kostenverringerung könnte deshalb erfolgen, indem man: (a) keine Kontrollzellen

verwendet, (b) ausschließlich Einfachbestimmungen durchführt, (c) die Anzahl von Positivund

Negativkontrollen reduziert und (d) die Substanzen nur in Messkonfiguration (1) testet.

Werden die o.g. Einsparmöglichkeiten realisiert, kostet ein Datenpunkt nur noch ≈ 25 Cent.

Ein Bereich, in dem eine industrielle Nutzung realisierbar erscheint. Eine weitere

Kostenersparnis könnte durch die Miniaturisierung des Assays auf das Format von 1536er

Multiwellplatten erreicht werden. Bei einigen HTS-Assays wird dieses Plattenformat bereits

eingesetzt. Allerdings erweist sich das „liquid-handling“ noch als schwierig.

Wie erwähnt, stellen die Farbstoffe einen großen Kostenfaktor dar. SAKAI ET AL. (2001) und

GUERRERO ET AL. (2002) ist es gelungen, Fusionsproteine aus GFPs und spannungsaktivierten

Kalium-Kanälen herzustellen, deren Fluoreszenzintensität von der Membranspannung

bestimmt wird. Die Eigenschaften dieser proteinbasierten Spannungssensoren entsprechen

denen „schneller“ spannungssensitiver Farbstoffe. Die spannungsabhängigen

Fluoreszenzänderungen sind zwar sehr schnell, aber auch klein (0,1%/mV). Die weitere

Optimierung solcher fluoreszenzoptischer Spannungssensoren erscheint vielversprechend.


Diskussion 105

4.3 Charakterisierung von HCN-Kanal Blockern

ZD7288 und Ivabradine gehören zur Wirkstoffgruppe der sogenannten „specific bradycardic

agents“ (Überblick: YUSUF & CAMM, 2003). Die Namensgebung beruht auf der Beobachtung,

dass Wirkstoffe dieser Art den I h -Strom in Sinusknotenmyozyten blockieren. Dadurch wird

die Herzfrequenz reduziert. ZD7288 und Ivabradine wirken intrazellulär. Die Bindestellen für

Ivabradine und ZD7288 befinden sich nahe des Selektivitätsfilters der Kanäle. Dabei erfolgen

die Bindung und der Block nur bei Kanälen, die geöffnet sind (open channel block). Der

Block durch ZD7288 und Ivabradine ist spannungsabhängig: Je positiver die

Membranspannung, desto effektiver werden die Kanäle blockiert. Lange Hyperpolarisationen

führen dazu, dass bereits gebundene Blocker-Moleküle wieder von den Kanälen dissoziieren

(BUCCHI ET AL., 2002; ROTHBERG ET AL., 2002). Im Gegensatz zu ZD7288 scheint dabei für

Ivabradine nicht nur die Membranspannung allein, sondern auch der größere

elektrochemische Gradient für Na + verantwortlich zu sein (BUCCHI ET AL., 2002). Ivabradine

wird unter diesen Bedingungen vermutlich durch permeierende Na + -Ionen von seiner

Bindestelle verdrängt. Dieses Verhalten wird auch als „current-dependent block“ bezeichnet

(BUCCHI ET AL., 2002).

Ich habe gezeigt, dass ZD7288 sowohl HCN1- als auch HCN4-Kanäle blockiert. Für beide

Kanaltypen liegt der EC50-Wert im submikromolaren Bereich. Ich konnte die Wirkung von

Ivabradine auf HCN1-und HCN4-Kanäle ebenfalls nachweisen. Der EC50-Wert für HCN1

liegt bei 2 µM und für die HCN4-Kanäle bei > 100 µM. Die geringe Wirkung von Ivabradine

auf HCN4-Kanäle ist überraschend, da BUCCHI ET AL. (2002) schon bei submikromolaren

Konzentrationen einen blockierenden Effekt auf I h -Ströme in Sinusknotenmyozyten, die

hauptsächlich HCN4 exprimieren, nachweisen konnten. Allerdings konnten diese Autoren nur

bei Applikation von repititiven Spannungsprotokollen, die alternierend zu einer Aktivierung

und Deaktivierung der I h -Ströme führten, den blockierenden Effekt von Ivabradine auf I h

messen. Mit dieser Methode, die die rhythmische Abfolge von Aktionspotentialen einer

Sinusknotenzelle simuliert, konnten sie mit 30 µM Ivabradine ~ 90% des I h -Stroms

blockieren. Der Versuch, den I h -Strom bei -100 mV im Steady-State zu blockieren führte

lediglich zu einer Abnahme des Stroms um 6,5 %. Für ZD7288 wurden Experimente unter

identischen Bedingungen wie für Ivabradine bisher nicht durchgeführt. Allerdings konnten

ROTHBERG ET AL. 2002 in ähnlichen Experimenten zeigen, dass mit 100 µM ZD7288 unter

Gleichgewichts-Bedingungen ≈ 90% des Stroms durch HCN1-Kanäle blockiert werden (bei -

100 mV).


Diskussion 106

Bei konstantem Membranpotenzial und Aktivierungszustand, wie er für HCN4-Kanäle in den

Kulturzellen vorliegt, findet anscheinend nur eine sehr geringe Wechselwirkung von

Ivabradine mit dem Kanal statt. In dieser Hinsicht scheinen sich die Wirkungsmechanismen

von ZD7288 und Ivabradine zu unterscheiden.

Ivabradine ist bis heute der einzige Wirkstoff, der in weiterführenden klinischen Studien für

die Therapie von Herzerkrankungen, wie z.B. Sinustachykardien und auch kardiale Ischämien

untersucht wird (z.B. BORER ET AL., 2003). ZD7288 zeigt neben der kardialen Wirkung

zentralnervöse Nebenwirkungen und ist deshalb therapeutisch nicht verwendbar (Übersicht

z.B: YUSUF & CAMM, 2003). Wie auch die vorliegende Arbeit zeigt, müssen HCN4-Kanäle

für einen Block durch ZD7288 lediglich geöffnet sein. Dagegen blockiert Ivabradine die

HCN4-Kanäle offensichtlich nur dann, wenn sie in einer zeitlichen Abfolge Aktivierungsund

Deaktivierungszustände durchlaufen. Das würde bedeuten, dass Ivabradine in Zellen, die

keine Aktionspotentiale feuern, keine Wirkung auf HCN4-Kanäle zeigt. Dieser Unterschied

im Wirkungsmechanismus könnte für die herzspezifische Wirkung von Ivabradine

verantwortlich sein. Die Überprüfung dieser Hypothese bietet sich als ein interessantes

Folgeprojekt an.

Die Ergebnisse für Ivabradine verdeutlichen zudem, dass man mit dem entwickelten HTS-

Assay nur HCN-spezifische Wirkstoffe mit bestimmten Eigenschaften identifizieren kann.

Der Wirkstoff muss bei Membranpotenzialen, die in den Kulturzellen vorliegen, mit den

Kanälen wechselwirken. Substanzen, die z.B. nur bei starker Depolarisation oder

Hyperpolarisation auf die Kanäle wirken, können mit diesem Assay vermutlich nicht

identifiziert werden. Gleiches gilt für Wirkstoffe, die nur an Kanäle binden, die sich in einem

ganz bestimmten inaktivierten oder deaktivierten Zustand befinden. Solche Limitationen sind

allerdings bei nicht-invasiven Assays kaum zu vermeiden. Das ist einer der Gründe, warum

für spannungsabhängige Ionenkanäle die Automatisierung der Patch-Clamp-Technik

vorangetrieben wird.

Es wird angenommen, dass I h -Ströme teilweise von Kanälen getragen werden, die sich aus

verschiedenen HCN-Kanal Isoformen zusammensetzen (Überblick: FRERE ET AL., 2004).

Substanzen, die spezifisch heterooligomere HCN-Kanäle beeinflussen, können mit dem Assay

nicht identifiziert werden. Ein Wirkstoff, der hochspezifisch nur heterooligomere Kanäle

beeinflusst, wäre allerdings aus wissenschaftlicher und medizinischer Sicht ein interessantes

„Werkzeug“. Mit diesem „Werkzeug“ könnte die physiologische Bedeutung heteroligomerer

Kanäle entschlüsselt werden.


Diskussion 107

4.4 Zellbasierte Assays für G-Protein gekoppelte Rezeptoren

Membranproteine aus der Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) sind von

großer Bedeutung als Zielproteine für die pharmakologische Wirkstoffforschung. Fast 60%

aller verschreibungspflichtigen Medikamente wirken auf GPCRs. Dabei wird fast jedes

Indikationsgebiet abgedeckt. Der jährliche Umsatz mit Wirkstoffen für G-Protein gekoppelte

Rezeptoren beträgt rund 200 Milliarden Dollar. In Folge dessen wird auf diesem Gebiet die

Entwicklung innovativer HTS-Technologien mit Nachdruck vorangetrieben. Bei

Wirkstoffscreenings für GPCRs werden unter anderem zellfreie Bindungsassays durchgeführt.

Oft wird dafür die sogenannte SPR-Technik verwendet (surface-plasmon-resonance). Dabei

wird untersucht, ob eine Substanz an den jeweiligen Rezeptor bindet. Solche Bindungsassays

liefern weder Informationen darüber, ob es sich um einen Agonisten oder Antagonisten für

den jeweiligen Rezeptor handelt, noch kann auf diese Weise die pharmakologische Potenz des

Wirkstoffes untersucht werden. Aufgrund des höheren Informationsgehaltes werden

vorzugsweise zellbasierende Assays angewendet und entwickelt. Dabei kann die Wirkung von

Substanzen auf verschiedene Art und Weise gemessen werden (Überblick: COOPER, 2004).

Die Firma Sibion-Biosciences bietet einen innovativen zellbasierten HTS-Assay für G s -

gekoppelte Rezeptoren an (SIBISCREEN). Bei diesem Assay wird ein zyklisch Nukleotidgesteuerter

Ionenkanal (CNG-Kanal) als Sensor (SIBISCREEN-Sensor) für die intrazelluläre

cAMP-Konzentration verwendet. Zu untersuchende Rezeptoren werden heterolog in

Kulturzellen exprimiert, die den SIBISCREEN-Sensor konstitutiv exprimieren. Für das

Wirkstoffscreening werden diese Zellen mit einem Ca 2+ -sensitiven Fluoreszenzfarbstoff

beladen. Agonisten des Rezeptors führen über G s zur Aktivierung endogener

Adenylatzyklasen. Die intrazelluläre cAMP-Konzentration steigt. Durch Bindung von cAMP

werden die SIBISCREEN-Sensoren aktiviert, die einen Na + /Ca 2+ -Einstrom leiten. Der

Anstieg der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration wird über die Änderung der

Fluoreszenzintensität des Ca 2+ -Farbstoffs ausgelesen. Der SIBISCREEN-Assay weist

Änderungen der cAMP-Konzentration und damit die Aktivierung G s -gekoppelter Rezeptoren

sehr zuverlässig und sensitiv nach.


Diskussion 108

∆F/F (%)

Ein Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration lässt sich auch über die Aktivierung von

HCN4-Kanälen verfolgen. Colforsin aktiviert Adenylatzyklasen und der daraus resultierende

cAMP-Anstieg führt bei Zellen, die HCN4 exprimieren, zu einer dosisabhängigen

Depolarisation.

100

80

60

40

20

SIBISCREEN hHCN4 Hill-Plot

Colforsin (µM)

30/50

20

10

5

1

0

0

0 200 400 600 800

Zeit (s)

∆F/F (%)

30

25

20

15

10

5

0

Colforsin (µM)

0 200 400 600 800

Zeit (s)

3/10

1

0,3

0,1

0,03

0,01

∆F/F (norm.)

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

SIBISCREEN

hHCN4

0.01 0.1 1 10 100

[Colforsin]

Abb. 4.1: HCN4–Kanäle als Sensoren für intrazelluläres cAMP. Dargestellt ist der Zeitverlauf der

Fluoreszenzintensität von Zellen, die den SIBISCREEN cAMP-Sensor bzw. hHCN4-Kanäle exprimieren, vor und

nach Injektion von Colforsin. Bei den Zellen mit dem SIBISCREEN-Sensor wurde die intrazelluläre Ca 2+ -

Konzentration verfolgt, bei den Zellen, die HCN4 exprimieren, das Membranpotenzial. Dazu wurden die Zellen

mit dem Ca 2+ -sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 bzw. mit dem MembraneKit inkubiert. Rechts sind die

entsprechenden Dosis-Wirkungs-Kurven in Form von Hill-Plots dargestellt.

Die Fluoreszenzänderungen von Zellen, die den SIBISCREEN-Sensor exprimieren, beträgt

nach Colforsin-Injektion ≈90%. Bei Zellen, die HCN4 exprimieren, ändert sich die

Fluoreszenz um max. ~ 30%. Die Kinetik der Fluoreszenzantworten ist schneller bei den

HCN4-Zellen im Vergleich zum SIBISCREEN-System. Die Dosis-Wirkungs-Kurven für

Colforsin zeigen zudem, dass mit der HCN4-Zelllinie wesentlich kleinere Änderungen der

intrazellulären cAMP-Konzentration gemessen werden können. Die EC50-Werte für

Colforsin liegen bei dem SIBISCREEN-System mit 3,9 µM um mehr als eine Größenordnung

höher als bei der HCN4-Kanalzelllinie (180 nM).

Alternativ zum SIBISCREEN-Sensor könnten also Wirkstoffe für GPCRs auch über HCN4-

vermittelte Membranpotenzialänderungen verlässlich identifiziert werden.


Diskussion 109

4.5 Suche nach spezifischen Wirkstoffen in Tiergiften

In dieser Arbeit wurden Gifte von ≈ 60 verschiedenen Kegelschnecken, Spinnen, Skorpionen

und Schlangen auf HCN-spezifische Wirkstoffe untersucht. Einige der getesteten Gifte

führten zum Teil zu großen HCN-unabhängigen Fluoreszenzantworten. Es ist bei diesen

Giften nicht auszuschließen, dass HCN-spezifische Wirkungen von den unspezifischen

Wirkungen nicht zu trennen waren. Da für die Schlangengifte bereits bekannt war, dass die

Applikation des Rohgifts zur Lyse der Kulturzellen führen kann, wurden diese vor dem Test

mit der RP-HPLC fraktioniert. Anhand der Daten des Wirkstoffscreenings erkennt man, dass

die Fraktionierung der Schlangengifte erfolgreich war. Bei den Rohgiften waren oft große,

unspezifische Fluoreszenzantworten zu beobachten, die sich nachher auf wenige Gift-

Fraktionen aufteilten. Anhand des Chromatogramms konnten diesen Fraktionen meist

einzelne Peaks zugeordnet werden. Die unspezifisch wirkenden Komponenten der Gifte

wurden also von den übrigen abgetrennt.

In dieser Arbeit hat sich die RP-HPLC als geeignete Methode für eine solche Auftrennung

erwiesen. Prinzipiell sind aber auch andere chromatographische Verfahren anwendbar. Mit

einer Ionenaustausch-Chromatographie werden die Komponenten der Gifte z.B. anhand ihrer

Ladung aufgetrennt. Ebenso denkbar ist eine Größenausschlußchromatographie. Für die

Schlangengifte wurde mit dieser Methode allerdings keine annähernd so gute Trennung wie

mit RP-HPLC erreicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine Auftrennung und anschließende

Untersuchung der unspezifisch wirkenden Gifte nicht mehr vorgenommen werden.

Bei Giften, die keine Wirkung auf die Zellen zeigten, ist es denkbar, dass die eingesetzte

Menge zu gering war. Keine Fraktion der Kegelschneckengifte zeigte eine Wirkung auf

Zellen, die HCN-Kanäle exprimieren. Wenn man davon ausgeht, dass das Gift einer

Kegelschnecke etwa 150 verschiedene Substanzen enthält, sollten sich in jeder der 5

Giftfraktionen ≈ 30 verschiedenen Toxine befinden. Die Peptidkonzentration in den

Fraktionen betrug ≈ 4 mg/ml. Conotoxine bestehen durchschnittlich aus 20 Aminoäuren.

Daraus ergibt sich für die einzelnen Toxine eine Konzentration von etwa 15 µM. Es wurden

6 µl jeder Fraktion in die Wells injiziert. Das entspricht einer 1:10 Verdünnung, so dass eine

Endkonzentration von je ≈ 1,5 µM abgeschätzt werden kann. Üblicherweise haben

Conotoxine für ihre Zielproteine Affinitäten im nanomolaren Bereich (Überblick: OLIVERAA

& CRUZAB, 2001). Deshalb gehe ich davon aus, dass die eingesetzte Gift-Menge ausreichend

war.


Diskussion 110

Kein getestetes Gift zeigte eine eindeutige blockierende Wirkung auf HCN1- oder HCN4-

Kanäle. Drei Fraktionen eines Kobra-Giftes wurden zunächst als vielversprechende

Kandidaten mit blockierender Wirkung für HCN1 und HCN4-Kanäle identifiziert. Es zeigte

sich, dass diese Fraktionen, neben einige anderen Komponenten, vor allem Peptid-Toxine

enthalten. Allerdings konnte die blockierende Wirkung dieser Gift-Fraktionen in einem

erneuten Test nicht bestätigt werden.

Es wurden jedoch insgesamt 3 verschiedene Skorpion- bzw. Spinnengifte identifiziert, die

eindeutig und reproduzierbar zu einer Aktivierung von HCN-Kanälen in den Zellen führen.

Zwei dieser Gifte (#268 und #269) führen selektiv zu einer Aktivierung von HCN4-Kanälen,

während bei Gift #264 ein aktivierender Effekt sowohl auf HCN4 als auch auf HCN1

beobachtet werden kann. Die Gifte #268 und 269 stammen von dem Skorpion Pandinus

imperator bzw. Heterometrus spinifer (siehe Tabelle 2.4). Gift #264 stammt von einer

Tarantel (Heteroscodra maculata). Es ist bekannt, dass Skorpion-Gifte unter anderem den

Neurotransmitter Noradrenalin enthalten können (Überblick: GWEE ET AL. 2002). Bei

Heterometrus spinifer (#269) kann die Noradrenalin-Konzentration im Gift sogar mehrere

mM betragen. Die FlpIn-293 Kulturzellen exprimieren endogene β-adrenerge Rezeptoren. Die

Stimulation dieser Rezeptoren mit Noradrenalin führt, über das G-Protein G s , zu einem

Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration. Die Affinität der Rezeptoren für

Noradrenalin liegt im nanomolaren Bereich. In weiterführenden Experimenten muss geklärt

werden, ob diese Gifte Substanzen enthalten, die direkt mit den HCN-Kanäle wechselwirken

Möglicherweise erfolgt die Aktivierung der Kanäle „indirekt“ durch die Erhöhung der

intrazellulären cAMP-Konzentration. Um das herauszufinden, sollte man die Wirkung der

Gifte auf HCN-Zellen testen, die mit Colforsin oder Noradrenalin vorstimuliert wurden.

Wenn die Gifte die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen, sollte unter diesen

Bedingungen kein Effekt der Gifte auf die Kanäle zu beobachten sein. Ebenso kann die

Wirkung der Gifte mit der Patch-Clamp-Technik untersucht werden. Dabei sollte man die

Experimente mit cAMP in der Pipettenlösung durchführen, um einen direkten Effekt auf die

HCN-Kanäle messen zu können.

In dieser Arbeit wurden ca. 60 verschiedene Gifte untersucht. Wenn man davon ausgeht, dass

jedes Gift einen Cocktail von 50-200 verschiedenen Substanzen enthält, entspricht das einer

Wirkstoffbibliothek von 3000-12000 verschiedener Toxine. Verglichen mit

Wirkstoffscreenings im industriellen Maßstab, wo bis zu 1.000.000 verschiedene Substanzen

getestet werden, ist das eine eher geringe Anzahl von getesteten Wirkstoffen.


Diskussion 111

Für weitere Tests könnten z.B. von der Firma SpiderPharm weitere Gifte bezogen werden.

Insgesamt sind dort Gifte von mehr als 100 verschiedenen Spezies erhältlich. Es scheint auch

interessant andere Kegelschneckengifte zu untersuchen. Auch die Gifte von Seeanemonen

sind sehr interessant. DICHOT ET AL. (2003, 2004) konnten erst kürzlich, durch den Test einer

großen Anzahl verschiedener Tiergifte, Toxine aus dem Gift von Seeanemonen isolieren, die

hochspezifisch auf HERG-Kanäle bzw. auf Protonen-aktivierte ASIC3-Kanäle wirken.

Vor allem sollte aber ein Screening organischer Wirkstoffbibliotheken angestrebt werden. Das

müsste in Kooperation mit einem Pharmaunternehmen durchgeführt werden. Davon

abgesehen besitzt z.B. das Forschungsinstitut für molekulare Pharmakologie in Berlin eine

sogenannte „Screening-Unit“, die sich auf die Synthese von organischen

Wirkstoffbibliotheken spezialisiert hat. Diese Bibliothek von mittlerweile 20.000

verschiedenen Substanzen wird für akademische Wirkstoffscreenings zur Verfügung gestellt.

In dem Projekt „Suche nach neuen Wirkstoffen für Hyperpolarisationsaktivierte und zyklisch

Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle“ steckt also ein Potenzial, welches weit über die hier

durchgeführte Arbeit hinausgeht. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen zudem eine

ausgezeichnete Basis zur Entwicklung von HTS-Assays für die HCN-Kanalisoformen

2 und 3 dar.


Literatur 112

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6. Anhang

Dokumentation der Fraktionierung der verschiedenen Schlangengifte. Es ist angegeben, über

welchen Zeitraum nach dem Auftagen der Probe das Eluat für die jeweilige Fraktion

aufgefangen wurde.

Schlange: Naja haje

Fraktion-Nr. t Anfang (min) t Ende (min)

1 5,00 10,40

2 10,40 16,30

3 16,80 20,00

4 20,00 23,40

5 23,40 24,30

6 24,30 29,00

7 29,00 32,00

8 32,00 34,20

9 34,20 35,10

10 35,10 37,50

11 39,00 41,00

12 41,00 45,00

13 45,00 51,50

Schlange Vipera ursinii

Fraktion-Nr. t Anfang (min) t Ende (min)

1 0,00 5,00

2 5,00 10,00

3 10,00 12

4 12,50 18,00

5 18,00 21,00

6 21,00 25,00

7 25,00 27,60

8 27,60 30,00

9 30,00 31,50

10 31,50 33,50

11 33,50 34,90

12 34,90 37,00

13 37,00 38,50

14 38,50 39,60

15 39,60 42,60

16 42,60 44,00

17 44,00 46,70

18 46,70 47,70

19 47,70 50,20

20 50,20 55,00

21 55,00 60,50

22 60,50 67,00

23 67,00 71,30

24 71,30 74,30


Schlange Bitis arietans

Fraktion-Nr. t Anfang (min) t Ende (min)

1 0,00 4,50

2 4,50 10,00

3 10,00 13,50

4 13,50 15,00

5 15,00 17,00

6 17,00 20,00

7 20,00 26,00

8 26,00 29,00

9 29,00 30,00

10 30,00 31,50

11 31,50 33,40

12 33,40 36,50

13 36,50 39,00

14 39,00 43,00

15 43,00 50,00

16 50,00 53,70

17 53,70 55,70

18 55,70 56,90

19 56,90 63,50

Schlange Naja siamensis

Fraktion-Nr. t Anfang (min) t Ende (min)

1 0,00 5,00

2 5,00 9,50

3 9,50 12,60

4 12,60 15,00

5 15,00 22,00

6 22,00 23,20

7 23,20 25,30

8 25,30 27,70

9 27,70 28,50

10 28,50 30,50

11 30,50 32,90

12 32,90 40,00

13 40,00 44,00

14 44,00 55,00

15 55,00 63,00


Ich versichere, dass ich die von mir vorgelegte Dissertation selbständig angefertigt, die

benutzten Quellen und Hilfsmittel vollständig angegeben und die Stellen der Arbeit -

einschließlich Tabellen, Karten und Abbildungen -, die anderen Werken im Wortlaut oder

dem Sinn nach entnommen sind, in jedem Einzelfall als Entlehnung kenntlich gemacht habe;

dass diese Dissertation noch keiner anderen Fakultät oder Universität zur Prüfung vorgelegen

hat; dass sie noch nicht veröffentlicht worden ist (auch nicht in Teilpuplikationen) sowie, dass

ich eine solche Veröffentlichung vor Abschluss des Promotionsverfahrens nicht vornehmen

werde. Die Bestimmungen dieser Promotionsordnung sind mir bekannt. Die von mir

vorgelegte Dissertation ist von Prof. Dr. U.B. Kaupp betreut worden.


Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Biologische Informationsverarbeitung 1

(Forschungszentrum Jülich) angefertigt. Ich bedanke mich bei allen Mitarbeiterinnen und

Mitarbeitern für ihre Unterstützung und die gute Zusammenarbeit. Insbesondere gilt mein

Dank:

-Herrn Prof. Dr. U. Benjamin Kaupp für die Überlassung des Themas, für inspirierende

Diskussionen und die Möglichkeit an seinem Institut diese Arbeit anfertigen zu dürfen.

Ich möchte mich auch dafür bedanken, dass ich drei spannende Sommer in Woods Hole

erleben durfte.

- Herrn Dr. Reinhard Seifert für die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit. Die Art und

Weise der Betreuung und die ständige Diskussionsbereitschaft haben motiviert. Sein

großes persönliches Engagement hat wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Weiterhin danke ich ihm für seine geduldige Unterstützung bei der Niederschrift dieser

Arbeit.

- Herrn PD Dr. Arnd Baumann für die anregenden Diskussionen, seine große

Hilfsbereitschaft und die gute Zusammenarbeit.

- Herrn Dipl. Ing. Hartmut Prast für die Unterstützung bei der Fraktionierung der Gifte.

- Herrn Prof. Peter Kloppenburg für die Übernahme der Beurteilung dieser Arbeit

- Prof. Joe Lynch, Dr. Richard Lewis und Prof. Yuri Utkin für die großzügige

Bereitstellung der Tiergifte.

- Frau Mechthilde Bruns für die Unterstützung bei den zellbiologischen Arbeiten.

- Frau Anita Eckert und den Herren Rudolf (Rudi) Esser und Daniel Portz dafür, dass sie

immer schnell und unkompliziert halfen, wenn es nötig war.

-Frau Dagmar Harzheim für die ständige Versorgung mit Lebensmitteln aller Art.

Ich möchte mich vor allem bei meinen Eltern bedanken, die mir dieses Studium ermöglicht

haben und mir immer alle erdenkliche Unterstützung haben zukommen lassen Einen großen

Beitrag hat auch meine Freundin Mirjam geleistet, die immer bedingungslos zu mir gestanden

hat und der entscheidende Rückhalt während dieser drei Jahre war. Dafür möchte ich ihr aus

tiefstem Herzen danken.


Forschungszentrum Jülich

in der Helmholtz-Gemeinschaft

Jül-4192

Dezember 2005

ISSN 0944-2952

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