Arrestin hetero/oge Expression/l Mutagenese und biophy,sikalische Untersuchungen

28 MATERIAL UND METHODEN
Herstellung VOIl klaren Zellysaten (Uberstdnden)
Das Zellysat wird durch Zentrifugation fur 30 min bei 4°C, 20000 Upm (SS34 Rotor) und
anschlieBender Zentrifugation fur 60 min bei 4°C, 35000 Upm im Ti70 Rotor von den
unloslichen Bestandteilen getrennt. Kleine Partikel und Schwebestoffe werden anschlieBend
durch Filtration durch eine 0,45 f.lm Filtrationseinheit aus der Losung entfernt. Zur
Reextraktion der unloslichen Zellbestandteile wird das Pellet in einem halben Volumen
ZellaufschiuBpuffer resnspendiert und 5 mal I min auf Eis mit dem Ultraschallstab behandelt.
Diese Suspension wird ebenso wie zuvor das Zellysat durch Zentrifugation und Filtration von
unloslichen Bestandteilen getrennt.
2.6.1. Zellaufschlu6 von S. cerevisiae mit Glasperlen nach
Spharoplastlerung
Die Zellen einer 5 ml Ubernachtkultur werden in der Megafuge bei 4°C, 6000 Upm fur 5 min
zentrifugiert, mit I mi SCE-Puffer gewaschen und in 500 ul SCE-Puffer mit I % (v/v)
p-Mercaptoethanol und 100 ug/ml Zymolyase aufgenommen. Das Gemisch wird bei 37°C
fur 15 bis 60 min inkubiert und die Bildung von Spharoplasten dabei regelmiiBig unter dem
Durchlichtmikroskop (Zeiss) uberpruft. Der Spharoplastensuspension wird ein Protease­
Inhibitor-Cocktail (2.3.1.) und ein halbes Volumen Glasperlen (sauregewaschen,
Durchmesser 0,425-0,600 mm, Sigma) zugefiigt. Das Gemisch wird mindestens 15 min bei
RT bewegt (Eppendorf-Mixer 5432), und das Zellysat anschlieBend wie unter 2.6.
beschrieben behandelt.
2.6.2. Herstellen von 'I'Ca-Oesamtzellextrakten aus S. cerevisiae fur
analytische Zwecke
2 mi einer Ubernachtkultur (OD 600 zwischen 1 und 2) werden in der Mikrozentrifuge bei RT
fur I min mit 13.000 Upm zentrifugiert und die Zellen in 500 f.lI5 % (w/v) Trichloressigsaure
resuspendiert. Der Suspension wird ein halbes Volumen Glasperlen (saurcgewaschen,
Durchmesser 0,425 -0,600 mm, Sigma) zugefugt und das Gemisch mindestens 15 min bei RT
geschuttelt (Eppcndorf-Mixer 5432). Das Lysat wird abgenommen und die Glasperlen mit
250 ul 5 % (w/v) Trichloressigsaure gewaschen. Die vereinigten Lysate werden fur 15 min
auf Eis inkubiert. Die ausgefallten Proteine werden in der Mikrozentrifuge 10 min mit
13.000 Upm sedimentiert, mit 500 ul eiskaltem (-20°C) Azeton gewaschen und in 10 f.lI
3 M Tris, pH 8,8 und 100 ul Harnstoffprobenpuffer resuspendiert. Nach 5-miniitiger