Microbial Biotechnology BIO-512 (ATW)

khairulanam.files.wordpress.com
  • No tags were found...

Kul 1 PGPR Rhizobia

Microbial Biotechnology

BIO-512 (ATW)

• Plant Growth Promoting Rhizobacteria

o Symbiotic PGPR (Rhizobia)

o Non-symbiotic PGPR

Microbial Insecticide (Bt)

• Genetic Engineering of Plant

• Therapeutic Agent and Vaccin

• Molecular Diagnosis

• Assignment (8-10 pages)


Plant Growth-Promoting Rhizobacteria

(PGPR): Rhizobia

Dr. Aris Tri Wahyudi

Department of Biology FMIPA

Bogor Agricultural University


Biological N 2 -Fixation

~Approximately 80 % is free N 2

~It can not be used by microbes, directly

~It must be converted to N2-fixed:

Nitrogen Fixation

~Microbe : Symbiotic; Non-Symbiotic

~Enzyme: Nitrogenase

~Biofertilizer


Biological Nitrogen Fixation

N 2

(~80 %)

N 2 Fixation

NH 3

N-Compound

Amino Acid

Air

Non-Symbiotic

Symbiotic

Cell Activity

To Plant

Carbohydrate


Root Nodule Bacterium :

N 2 Fixation


Nitrogen Fixation

N 2 +8H + +8e - +16MgATP 2NH 3 +H 2 +16 MgADP+16Pi

Nitrogenase

Symbiotic: Bradyrhizobium, Rhizobium,

Azorhizobium, etc

Non-symbiotic: Azospirillum, Azotobacter, etc


Symbiotic N 2 Fixing Bacteria:

(Form Root Nodule)

1. Azorhizobium

2. Bradyrhizobium

3. Rhizobium

Azorhizobium :

Form root nodule and stem nodule

Stem Nodule : Sesbania rostrata

RHIZOBIA


Metabolism and Translocation

Hasil fiksasi N 2 yaitu NH 3 , diekskresikan sel Rhizobium atau

Bradyrhizobium

masuk ke bintil (nodul)

NH 3 dlm bintil diproses menjadi :

Temperate

Tropik

glutamin 11% 9%

Asparagin 81% 88% ureide

Asam amino 8% 3%

ditranslokasikan ke tanaman bagian atas lewat xylem.

Bakteri bintil akar memperoleh sumber energi (karbohidrat) dari

hasil fotosintesis tanaman (fotosintat) dari tanaman bagian atas

ke akar lewat phloem.


Sesbania rostrata


Rhizobium

Tumbuh cepat (3-5 hari) diatas YMA,

2-4 mm diameter

Menghasilkan asam

DNA : 59-64% G+C

Membentuk bintil pada pepolongan subtropis

Waktu generasi ~ 4 jam

Bradyrhizobium

Tumbuh lambat (5-7 hari) di atas YMA,

diameter < sama dgn 1 mm

Menghasilkan basa

DNA : 61-65% G+C

Membentuk bintil pada pepolongan tropis

Waktu generasi ~ > 8jam


Bradyrhizobium japonicum

Bacterial root nodule of

soybean

Gram negative

Fix N 2 molecular

Slow growing

Potential strain : inoculant


Bradyrhizobium japonicum Strains


Fig. Root Nodule Formation of Siratro

by Bradyrhizobium japonicum


Fig. Physical map of the complete sequence of

Bradyrhizobium japonicum USDA110


Nitrogen (N 2 ) Fixation

Nitrogenase:

1. Komponen I : Mo-Fe-protein = dinitrogenase

2. Komponen II : Fe-protein = dinitrogenase reduktase

Nitrogenase dikontrol oleh gen nif

K. pneumoniae : > 20 gen nif teridentifikasi

Gen-gen nif H D K

nif H-----sintesis dinitrogenase reduktase

nif D, nif K------sintesis dinitrogenase

Nitrogenase sensitif terhadap oksigen (O 2 )

Bakteri aerob : punya mekanisme khusus untuk mempertahankan

O 2 intraseluler tetap rendah

Bakteri anaerobik fakultatif :

Fiksasi N 2 pada ada O 2 atau tanpa O 2

Bakteri anaerob : tanpa O 2


Gen-gen nif pertama kali dipelajari pada K. pneumoniae

~dekat dengan E. coli

~model yang paling baik

Fe-protein : terdiri dari 2 unit (dimer) disandikan oleh

gen nifH 60 kDa

Mo-Fe protein : tdr 4 subunit (tetradimer) : nifDK

Gen-gen nif terletak pada plasmid (Rhizobium) dan pada

kromosom (Bradyrhizobium)

Penyusunan gen-gen nif sangat bervariasi :

R. meliloti : nif HDK berdampingan

B. japonicum : nif H terpisah dari nif DK+ 17 kb

nif E, N, S, B terletak diantaranya

K. pneumoniae: nif HDK berdampingan

Ekspresi gen nif dipengaruhi oleh faktor lingkungan:

NH 3 dan O 2 berlebih menghambat aktivitas nitrogenase


Structure of Symbiotic Genes in

Bradyrhizobium japonicum

nodVW nifDKE N X nifS nifB fixA nifH fixBCX Nod-2

Cluster I

? 70 kb

Lokus III II I

nolA nodD D1

nodYABCSUIJ

Orf123 nodZ fixR nifA fixA

Cluster II


Biological Nitrogen Fixation : Klebsiella pneunoniae


Klebsiella pneumoniae


Nitrogenase Complex

Two protein components: nitrogenase reductase

and nitrogenase

• Nitrogenase reductase is a 60 kDa homodimer

with a single 4Fe-4S cluster

• Very oxygen-sensitive

• Binds MgATP

• 4ATP required per pair of electrons transferred

• Reduction of N 2 to 2NH 3 + H 2 requires 4 pairs of

electrons, so 16 ATP are consumed per N 2


Why should nitrogenase

need ATP?

• N 2 reduction to ammonia is thermodynamically

favorable

• However, the activation barrier for breaking

the N-N triple bond is enormous

• 16 ATP provide the needed activation energy


NitrogenaseFunction


Symbiotic Genes in Bradyrhizobium

Gene Species function

nifA B. japonicum transcriptional regulator of

B. sp (Parasponia) nif & fix expression

nifH B. japonicum structural gene for dinitro-

B. sp (cowpea) genase reductase

B. sp (Parasponia)

nifDK B. japonicum structural genes for dinitro-

B. sp (cowpea) genase

B. sp (Parasponia)

nifB B. japonicum Fe MoCo synthesis

B. sp (Parasponia)

nifE B. japonicum

Fe MoCo synthesis

B. sp (Parasponia)


Symbiotic Genes in Bradyrhizobium

(Continued)

Gen Species Function

nifN Fe Moco synthesis

nifS B. japonicum Maturation of nitrogenase

fixA B. japonicum Electron transport to nitrogenase

fixBC B. japonicum Electron transport to nitrogenase

B. sp (Parasponia)

fixIJ B. japonicum Sequence similarity to family of

two-component regulatory

proteins

fixR B. japonicum Function unknown : sequence

similarity to dehydrogenases


Hydrogen Uptake (HUP)

Penambatan N 2 NH 3 , selalu dibebaskan H 2

Gen hup + (hidrogen uptake) menyandikan :

hidrogenase, meningkatkan fiksasi N 2 simbiotik

Beberapa Alasan :

1. Oksidasi H 2 , memungkinkan pengambilan kembali ATP

yang digunakan oleh nitrogenase

2. Oksidasi H 2 mengurangi resiko penghambatan nitrogenase

oleh H 2

3. Penggunaan O 2 untuk mengoksidasi H 2 dapat melindungi

nitrogenase terhadap O 2 . nitrogenase sensitif thd O 2 .


Hidrogenase

ATP

Generation

ATP

ADP

Energi

Electron

Carrier

Komplek

Nitrogenase

N 2 H +

H 2 2NH 3

Bradyrhizobium japonicum: hup + and hup -

Rhizobium leguminosarum


Nodulation

A. Tahap-tahap pembentukan bintil akar

1. Pengenalan thd pasangan yg benar pd tanaman dan pelekatan

bakteri ke rambut akar

2. Penyerbuan rambut akar oleh bakteri melalui pembentukan

benang infeksi (infection threat)

3. Perjalanan bakteri ke akar utama lewat benang infeksi

4. Pembentukan bakteroid dlm sel tanaman

5. Pembelahan sel tanaman dan bakteri yg terus menerus, menghasilkan

bintil akar dewasa


Akar tanaman pepolongan mengeluarkan bahan organik untuk

menarik mikroorganisme di sekitar perakaran (termasuk BBA)

Pelekatan BBA dgn akar pepolongan tergantung dari makromolekul

pd permukaan rambut akar yg berinteraksi dgn polisakarida BBA

makromolekul : lektin

polisakarida : 2-deoksiglukosa (R. trifolii)

Rambut akar selanjutnya melengkung, lalu bakteri masuk

membentuk benang infeksi.

Sel-sel akar yg berdekatan menjadi terinfeksi BBA

Sel yg terinfeksi, terangsang membelah (Sitokinin).

Bakteri dlm sel tanaman membelah, berganda, menggembung membentuk

sel yg tdk beraturan dan bercabang : bakteroid

Dikelilingi membran sel tanaman (peribacteroid membrane)

fiksasi nitrogen mulai terjadi


Root Nodule Formation

1. Pengenalan thd pasangan dan pelekatan

bakteri ke rambut akar

2. Ekskresi nod faktor yang menyebabkan pelengkungan

rambut-rambut akar

3. Penyerbuan rambut akar oleh bakteri dan pembentukan

benang infeksi (infection threat)

4. Perjalanan bakteri ke akar utama

5. Pembentukan bakteroid dlm sel tanaman

6. Pembelahan sel tanaman dan bakteri yg terus menerus,

menghasilkan bintil akar dewasa


Nodulation

Tanaman

Dinodulasi Kec Tumbuh

Pea R. leguminosarum cepat

Bean R. phaseoli

cepat

Clover R. trifolii

cepat

Alfalfa R. meliloti

cepat

Soybean B. japonicum

lambat

Siratro B. japonicum

lambat

Lupinus B. lupini lambat

Parasponia B. parasponiae

lambat


B. Pembentukan bintil akar : nodulasi

1. Sintesis polisakarida

- B-1,2 glukan EPS ------ proses infeksi

- Eksopolisakarida (EPS) ----- perkembangan nodul

- Lipopolisakarida (LPS) ----- pembentukan nodul

Mempunyai peranan penting utk nodulasi

R. meliloti mutan (B-1,2 glukan) dpt membentuk bintil tapi

tdk berisi bakteri (pseudonodul)

-Mutan Rhizobium EPS : tidak mampu membentuk nodul

Mampu membentuk nodul, tapi tdk mampu menambat N 2

-Efek mutasi, bergantung pada inang

-R. leguminosarum bv. phaseoli (EPS) : bintil normal

-R. leguminosarum bv. viciae (EPS) : tdk membentuk bintil

-Mutan R. leguminosarum bv. phaseoli (LPS) :

mampu membentuk bintil akar, tapi tdk menambat N 2


2. Gen-gen untuk nodulasi (nod)

-Banyak dipelajari pd R. meliloti, R. leguminosarum bv.

trifolii, R. leguminosarum bv. viciae

-Pada plasmid pSym : gen-gen nod berada pd fragmen 20 kb

Transfer pSym ke spesies lain (resipien), resipien mampu

membentuk bintil penambat N2

-Transfer pSym ke Agrobacterium menyebabkan nodul

abnormal, fix

-Plasmid pSym pRL1JI dari R. leguminosarum bv. viciae

-Dua kelompok gen nod :

nod ABCIJ : nod umum

nod EFGH : penentu spektrum inang

nod D : nod regulator = juga penentu inang


Nodulation Genes in Bradyrhizobium

Gene Species function

nodABC B. japonicum Synthesis of essential factor

B. sp (Parasponia) for hair curling & cell div.

nodD1 B. japonicum Positive transcriptional re-

B. sp (Parasponia) gulation for gene expression

nodD2 B. japonicum Unknown function: mutation

B. sp (Parasponia) caused nod -

nodI B. japonicum Unknown function: ATP de-

B. sp (Parasponia) pendent transport protein

nodJ B. japonicum Unknown function: Mem-

B. sp (Parasponia) brane location

nodK B. sp. (Parasponia) Unknown function


Nadulation Genes in Bradyrhizobium

(Continued)

Gene Species Function

nodLMN B. sp (Parasponia) Host range determination

nodSU B. japonicum Unknown function

nodV B. japonicum Host range determination

nodW B. japonicum Transcriptional regulation

nodY B. japonicum Unknown function

nodZ B. japonicum Genotype specific noduation


Structure of Nodulation Genes

R. leguminosarum


Model for Regulation of B. japonicum

Nodulation Genes

nodA nodY

nodD1-box

nodY-box

nodD1

DNA

Isoflavon

NodD1 Protein


Structure of nod Genes of R. leguminosarum

bv. viciae Sym Plasmid pRL1JI

Aktivasi

nodM nodL nodE nodF nodD nodA nodB nodC nodI nodJ

Represi


3. Regulasi ekspresi gen nod

a. R. leguminosarum bv. viciae

nod ABCIJ, nod FE, dan nod D ditumbuhkan pada media

penumbuhan yang normal ----- hanya nod D yg ditranskripsi

Jika eksudat akar (pea) ditambahkan pd media, nodFE dan

nod ABCIJ aktif terekspresi, berarti eksudat akar tanaman

inang dan gen nod D diperlukan untuk mengaktivasi operon

nod.

b. Flavonoid merupakan suatu inducer

Flavon luteolin, menginduksi ekspresi gen nod R. meliloti

7,4-dihidroksi flavon, menginduksi ekspresi gen nod

R. meliloti flavon dan flavanon mengaktivasi gen nod

R. leguminosarum bv. viciae.


Biotechnological

Application

Biofertilizer

Produksi inokulan untuk Tanaman Legum

Inokulan pada Tanah Marginal & Netral

Bioremediasi: Bioakumulasi Logam Berat

More magazines by this user
Similar magazines