Presentación de PowerPoint - Medio Rural

Estación de Viticultura e
Enoloxía de Galicia
• Microorganismos en la industria enológica
y su relación con la calidad del vino
Pilar Blanco Camba

Las levaduras y el vino
CARACTERÍSTICAS GENERALES
•Hongos microscópicos unicelulares
•Células eucariotas
•Morfología variada: esféricas, elípticas , ovaladas, alargadas,
apiculadas
•Reproducción vegetativa o asexual por gemación (algunas por
bipartición)
•Reproducción sexual. Formación de esporas
•Responsables de la fermentación alcohólica (transformación de
azúcar en alcohol +CO 2)
•Alteraciones (flor, refermentaciones)

Organización de una célula procariota (A) y eucariota (B)
A B

Principales levaduras vínicas
Nombre: Saccharomyces cerevisiae
Características:
•Morfología elípticas u ovoides
•Alta capacidad fermentativa
•Formadora de esporas (ascosporas con 4 esporas)
•No asimila nitratos ni escinde arbutina
•Crecimiento en presencia de etanol
•Fermenta y asimila glucosa, galactosa, maltosa,
sacarosa y rafinosa.
•No fermenta ni asimila lactosa

Principales levaduras vínicas
Nombre: Kloeckera apiculata
Hanseniaspora guillermondii
•Morfología: apiculadas (forma de limón)
•Aparece al inicio de la fermentación
•Fermenta la glucosa
•Bajo poder fermentativo (4%)
•Fuerte producción de ácidos volátiles
•No esporula (Hanseniaspora si esporula)
•No asimila nitratos
•No escinde la arbutina

Principales levaduras vínicas
Nombre: Metschnikowia pulcherrima
•Morfología: células ovoides aisladas o en parejas. A
veces células grandes con un grueso gránulo central de
grasa.
•Fermenta la glucosa
•Bajo poder fermentativo (1%)
•No asimila nitratos
•Escinde la arbutina
•Crece bien en presencia de alcohol
•No esporula
•En placa colonias blancas, brillantes con ligera
coloración rojiza

Principales levaduras vínicas
Nombre: Schizosaccharomyces pombe
•Morfología : Células alargada o cilíndricas
aisladas o en parejas (3-5 X 6-16) µm
•División por fisión
•Esporulada
•No asimila nitratos ni escinde la arbutina
•Buena capacidad fermentativa
•Capacidad para degradar ácido málico a
etanol y CO 2 (fermentación maloalcohólica)

Brettanomyces
Torulaspora
Cryptococcus
Debaryomyces hansenii
Rhodotorula
Otras levaduras vínicas
Levaduras formadoras de velo
•Saccharomyces (flor)
•Candida
•Pichia
•Hansénula
•Zygosaccharomyces
Debaryomyces hansenii

Requerimientos nutricionales de las levaduras
•Fuente de carbono: azúcares
•Fuente de nitrógeno
•Sustancias minerales
•Factores de crecimiento (vitaminas)
El mosto reúne los requisitos adecuados para el desarrollo de las
levaduras (Excepciones: maduración inadecuada, el ataque por botritis-
falta de nitrógeno, etc). pH ácido-impide el desarrollo de muchas
bacterias

Origen de las levaduras de vinificación
Uva (flora epifítica)
Material de bodega
Inóculo (LSA)

Sucesión de la población de levaduras a lo largo de la
fermentación
Fase inicial
Predominio de levaduras apiculadas y de
otras morfologías con baja producción de
alcohol y elevada producción de ácidos
volátiles (acético) Ex: Kloeckera apiculata,
Metschnikowia pulcherrima, Candida
sp,etc.
Fase tumultuosa
Saccharomyces invade el medio, acaba
dominando la fermentación y desaparecen
las levaduras de la fase inicial
Fase final
Predominio de especies del género
Saccharomyces. Produce más alcohol y
menos productos secundarios
Densidad
1150
1100
1050
1000
950
900
Albariño
1 3 5 7 9 11 13 15
Tiempo (días)

Evolución de la población de levaduras viables durante
la fermentación
Fase inicial : 10 4 -10 5
Fase tumultuosa: 10 7 -10 8
Fase final: 10 5
Log NLV
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
0 5 10 15
Tiempo (días)

La fermentación alcohólica
Glucolisis
Glucosa Acido pirúvico
Piruvato descarboxilasa
Alcohol deshidrogenasa
Acetaldehido
Etanol
CO 2
NADH2
NAD+

Fermentación alcohólica: Influencia del
temperatura y O 2
Rango de Temperatura para fermentación en blancos: 14-20ºC
Rango para fermentación en tintos: 25-30ºC
Temperatura crítica >35ºC
Densidad
1120
1100
1080
1060
1040
1020
1000
980
TREIXADURA
0 10 20
Tiempo (Días)
nTT16
nTT19
nTT22
O 2: Las levaduras requieren O 2 para su multiplicación ya que interviene en
la síntesis de AG y esteroles, constituyentes de la membrana celular y
responsables de su permeabilidad (práctica de remontado)

Productos secundarios originados durante
la fermentación alcohólica
•Glicerina – suavidad y aterciopelado
Fermentación gliceropirúvica
glucosa Glicerina + pirúvico
•Succínico- es el ácido que más impresiona el gusto (sabor a bebida
fermentada, entre salado y amargo)
•Ácidos orgánicos (málico, cítrico, láctico, ácidos volátiles
• Acético y su éster, acetato de etilo- producido por las levaduras de la 1ª
fase y levaduras oxidativas. Efecto negativo sobre el vino
•Metabolitos del ciclo diacetilo-acetoínico (a concentraciones elevadas son
negativos)

BACTERIAS LÁCTICAS
•Gram +, catalasa -, no esporuladas, no móviles
•División por bipartición
•Microaerófilas o anaerobias facultativas y fermentadoras
de azúcares
•Morfología: cocos y bacilos
•Según el metabolismo de la glucosa pueden ser:
-Homofermentativas- ác. láctico
-Heterofermentativas-ác. láctico, acético, CO 2 ,
etanol, acetaldehido, acetoína, diacetilo,etc
•Responsables de la fermentación maloláctica
•Bajo ciertas condiciones pueden causar alteraciones
•Metabolismo de aminoacidos-origina sustancias peligrosas
para la salud
Oenococcus oeni

BACTERIAS LÁCTICAS
aldolasa
Metabolismo homofermentativo de la glucosa (vía
glucolítica de Embden-Meyerhof)

BACTERIAS LÁCTICAS
Metabolismo heterofermentativo de la glucosa
(ruta de Warburg-Dickens)

Forma
Cocos
Bacilos
Género
Clasificación de las bacterias lácticas
Pediococcus
Leuconostoc
Lactobacillus
Metabolismo de la glucosa
Homofermentativos
Heterofermentativos
I. Homofermentativos estrictos
(No fermentan pentosas
Glucosa- 2 ác. Láctico)
II. Heterofermentativ. facultativos
(Fermenta las pentosas y la glucosa)
II. Heterofermentativ. obligatorios
(No poseen el enzima aldolasa,
fermentan la glucosa mediante la vía
de las pentosa fosfato)
Especies
P. damnosus
P. pentosaceous
L. oeni (O.oeni)
L. mesenteroides
(ssp. mesenteroides)
No descritas en vino
L. casei
L. plantarum
L. brevis
L. hilgardii

Características de los principales géneros de bacterias lácticas
Característica
Morfología de
las células
Tamaño
Metabolismo de
la glucosa
Hidrólisis de la
arginina
(G+C)%
Pared celular
Leuconostoc
Esféricas o un
poco alargadas
En pares o en
cadenas
0,5-0,7 µmø
CO 2, láctico,
etanol
Algunas cepas
38-44%
Sin ácido
teicoico
Pediococcus
Esféricas
División en dos
planos-tétradas
1-2 µmø
DL ó L láctico
No carbónico
No
34-42%
Sin ácido
teicoico
Lactobacillus
Alargadas en
pares e en
cadenas
0,5-1,2 X 1,0-10
µm
láctico, etanol,
acético, CO 2
No
36-47%
Algunas sp
contienen ácidos
teicoicos

Origen
•Uva
•Material de bodega
BACTERIAS LÁCTICAS: ecología
•Inóculo (Cultivos iniciadores de Oenococcus oeni. Se trata de cultivos
puros o mezclas de 2-3 cepas)
Evolución durante la fermentación
•En uva- población muy baja
•Mosto- 10 2 -10 4 UCF/ml. Disminuyen por proliferación de las levaduras
durante la fermentación alcohólica
•Fase final – Empieza a aumentar la población de bacterias lácticas (lisis
de las levaduras), desaparecen los bacilos homofermentativos, luego los
heterofermentativos y acaba predominando O. oeni, mejor adaptado a las
condiciones de bajo pH y elevada concentración de etanol
•La fermentación maloláctica se inicia cuando las UFC/ml= 10 6

FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA
Málico Láctico + CO 2
Repercusiones en el vino
•Desadificación biológica del vino
Enzima maloláctica
(Bacterias lácticas)
•Disminuye la acidez total y el málico (sabor astringente)
•Aumenta el ácido láctico (suavidad)
•Protege al vino de las enfermedades por bacterias lácticas
•Otras: Producción de diacetilo (aroma a “mantequilla”)
•A bajas concentraciones –bouquet
•A elevadas concentraciones - rancio

Posibles rutas del ácido málico

BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón maloláctica
Factores que influyen en la fermentación maloláctica
•Características de la variedad (relación tartárico/málico), residuos
fitosanitarios
•pH del medio (Actúan mejor a pH> 3.5; Tª óptima 4.2-4.5). El pH
condiciona el crecimiento bacteriano y los sustratos que van a metabolizar
(*enfermedades del vino). A mayor pH mayor facilidad para que se
desarrolle la FML pero también mayor peligro de que aparezcan
enfermedades.
•temperatura (19-25º)
•Aireación (la presencia de una pequeña proporción de O 2 es favorable)
•Etanol (< 13%)
•SO 2 (no superior a 50 mg/L)
•Prácticas de vinificación (El tiempo de contacto del vino con los hollejos,
contacto con las lías, trasiegos, etc. determinan la población de bacterias
lácticas al final de la fermentación alcohólica)
•Interacción de las bacterias con otros microorganismos

BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón maloláctica
Aplicación de la fermentación maloláctica
•En tintos Mejora gustativa
Color menos rojo vivo
Aroma evolucionado (menos a uva y más a
vinosidad)
•En blancos Puede ser deseable:
•Repercute en el equilibrio grado/acidez
•Disminuye la sensación de dureza y verdor
•Peligroso en vino dulce

BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón maloláctica
Ventajas e inconvenientes de la fermentación maloláctica
Ventajas
Reducción de la acidez y suavización
organoléptica
Garantía de estabilidad
Incremento aromático
Reducción de amargor y astringencia
Mayor complejidad y atributos de
envejecimiento
Inconvenientes
Reducción del color
Reducción de aromas varietales
Incremento de acidez volátil
Aparición de olores y sabores
anómalos
Formación de aminas biógenas y
carbamato de etilo

Metabolismo del cítrico

Bacterias acéticas
•Gram negativas, Catalasa positivas, no esporuladas
•Morfología variable (células elípticas o con forma de bastón corto
agrupadas en pares o en cadenas)
•Tamaño: 0.6-0.8 x 1-4 µm
•Inmóviles o móviles por flagelos:
polares (G. Gluconobacter)
peritricos (G. Acetobacter)
•Aerobias estrictas*(sobrevive en barrica)
•Oxidan el alcohol a ácido acético e incluso a CO 2 y H 2O
•Producción de polisacáridos extracelulares (celulosa-afecta la
filtrabilidad del vino) y pigmentos
•Tolerancia a la acidez, al etanol y moderada al SO 2
• Formación de velo
.
•En el vino pueden dar lugar al picado acético y su desarrollo es
indeseable en todas las etapas de vinificación

Bacterias acéticas
ECOLOGÍA DE LAS BACTERIAS ACÉTICAS
•Muy extendidas en la naturaleza, especialmente en bebidas fermentadas
alcohólicas como el vino, la cerveza o la sidra
•En uva la población de bacterias acéticas depende del estado sanitario de la
vendimia.
En uva sana: 10 2 -10 3 UFC/mL (G. oxydans)
En uva atacada por Botrytis: 10 5 -10 6 (mezcla de Guconobacter y
Acetobacter)
•Durante la fermentación alcohólica la adición de sulfuroso y el desarrollo de las
levaduras no afecta la población de bacterias acéticas. Existe una sucesión de
bacterias acéticas: G. oxydans predomina al inicio y va siendo reemplazado por
A. pasteurianus y A. aceti.
•Durante la fermentación maloláctica se mantiene la población
•Durante la conservación la población de bacterias acéticas puede aumentar y
causar enfermedades.

Característica
Flagelación
Crecimiento a pH 4.5
Clasificación de las bacterias acéticas
Oxidación de etanol a acético
Oxidación de acético hasta CO 2
(G+C)%
Especies
Gluconobacter
polar
+
+
-
56-64
G. oxydans
Acetobacter
peritrica
+
+
+
53-65
A. aceti
A. pasteurianus
A. liquefaciens
A. hansenii

Metabolismo de las bacterias acéticas
•Oxidación del etanol a ácido acético (Gluconobacter y Acetobacter)
etanol acetaldehido Ácido acético
Alcohol
deshidrogenasa
•Oxidación del ácido acético a CO 2 (Acetobacter)
Ácido acético
TCA
Aldehido
deshidrogenasa
CO 2+H 2O
*Gluconobacter carece de algunos enzimas del TCA, la α-cetoglutarato
deshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa

Metabolismo de las bacterias acéticas
•Metabolismo de los azúcares
Oxidación de los azúcares vía
hexosas monofosfato
Oxidación de azúcares a cetonas
Glucosa – ácido 2-5
dicetoglucónico
Fructosa-cetofructosa
Xylosa-cetoxylosa
•Metabolismo del ácido láctico
Oxidación a pirúvico,
acetaldehido y acético
•Metabolismo del glicerol
Oxidación a dihidroxiacetona

ALTERACIONES DEL VINO DE ORIGEN MICROBIANO
•Introducción
•Alteraciones microbianas
Bacterias lácticas
Picado láctico
Amargor
Vuelta
Grasa o ahilado
Bacterias del ácido acético: Picado acético
Levaduras
Flor
Refermentaciones
Brettanomyces
•Sustancias tóxicas de origen microbiano

INTRODUCCIÓN
•Las alteraciones microbianas del vino pueden aparecer durante la
elaboración y/o durante la conservación del vino
• Se producen por el ataque de componentes del vino y/o formación
de sustancias indeseables
•Evidencias: Turbidez, Gas, Transformación del color
•Factores a favor:
Composición del vino (ácidos orgánicos, azúcares, factores
de crecimiento y sales minerales)
•Factores en contra:
Grado alcohólico elevado
pH bajo
Baja temperatura

Las bacterias lácticas
Producen alteraciones graves porque atacan la totalidad de la masa del
vino aunque haya sido bien elaborado
Microaerófilos o anaerobios facultativos
Importancia de la higiene en la bodega
Alteraciones producidas
Picado láctico- fermentación de azúcares residuales
Amargor- fermentación del glicerol
Vuelta – fermentación del tartárico
Grasa o ahilado –formación de polisacáridos en el vino

Bacterias lácticas: PICADO LÁCTICO
PICADO LÁCTICO
•Fermentación de azúcares residuales con formación de acético y
láctico
•Puede aparecer en vinos con azúcares residuales por cese de la
fermentación alcohólica (Ex. Por altas temperaturas)
•Efecto en el vino: sabor agridulce (por el acético y el azúcar) y
aumento de la acidez volátil
•También tiene lugar la fermentación manítica – formación de
manitol a partir de fructosa (Vuelta manítica)
• Prevenir las paradas fermentativas y envasado apropiado, sulfitado
racional control de la temperatura

Bacterias lácticas: AMARGOR
AMARGOR
•Fermentación del glicerol formando lactico, acético, ácidos grasos
y acroleína (reacciona con compuestos fenólicos como los taninos
dando sabores amargos)
•Efecto en el vino: sabor amargo
•Muy rara, aparece e casos de mala cosecha
•Afecta a vinos con poco grado y pH bajo (3.2-3.3); La fermentación
de tartárico (vuelta) afecta a vinos de pH alto (3.5-3.3)

Bacterias lácticas: VUELTA
VUELTA
•Origen: Fermentación del ácido tartárico para dar láctico, acético
y CO2
•Efecto en el vino:
No apto para el consumo
Disminuye la acidez fija y aumenta la acidez volátil y el pH
Pierde sabor (insípido, flojo)
Color apagado
Turbidez
Formación de gas, vino con “aguja”
“olor a ratón” (vuelta + otras causas-formación de 2acetiltetrahidroxipìridina
)
•Ataca a vinos poco ácidos, los mejores vinos son los más propensos
•No suele darse.

Bacterias lácticas: GRASA
GRASA O AHILADO
•Causa: formación de polisacáridos en el vino que le dan aspecto
oleoso.
•Efectos en el vino: aspecto de aceite, vino pesado que se desliza sin
ruido. La acidez volátil no siempre es elevada.
•Peligro: puede ir seguido de otras alteraciones
•Prevención: empleo racional de sulfuroso que no impida la
Fermentación Maloláctica pero sí la formación de grasa
•Corrección: con sulfuroso y agitado

Alteración
Olor a mantequilla
Olor a ratón
Olor a geranio
Formación de aminas
biógenas
Formación de
carbamato de etilo
Bacterias lácticas: Otras alteraciones
Causa
Producción de diacetilo a partir del cítrico o
del piruvato
Formación de 2-acetil-tetrahidropiridina
Formación de 2-etoxi-3,5-hexadieno a partir
del ácido sórbico
Metabolismo de los aminoácidos del mosto
Metabolismo de la arginina

Bacterias acéticas: PICADO ACÉTICO
PICADO ACÉTICO O AVINAGRAMIENTO
•Oxidación del alcohol a ácido acético- Necesitan O 2
•Causado por las bacterias acéticas o del vinagre que constituyen parte de la
microflora de la uva y pernanecen durante todo el procesado. Desaparecen
tras el embotellado por las condiciones de anaerobiosis
•Picado- inicio del proceso , solo afecta a las capas superficiales
•Avinagramiento- afecta a más volumen
•Efecto en el vino:
En cata- olor a acetaldehido
Enturbiamento y formación de velo
Aumento de la acidez volátil (Máxima permitida 0,65 g/L)
Producen acético (retrogusto, final de boca áspero y agrio) y acetato
de etilo (indicativo de mala calidad)

Bacterias acéticas: PICADO ACÉTICO
•Enfermedad muy corriente, perjudicial y difícil de corregir
•Prevención: Relleno de los depósitos y cierre hermético
Evitar trasiegos en períodos cálidos (la elevada
temperatura aumenta la probabilidad de picado
acético)
Sulfitado a dosis adecuadas (25-30 mg/l)
Higiene de la bodega y los depósitos
•Aparece con mayor frecuencia en uvas atacadas con Botritis

LEVADURAS: Flor
FLOR
•Enmohecimiento de la superficie del vino, velo
•Causado por levaduras que requieren O 2
Candida mycoderma
Pichia membranifaciens
Hansenula anómala
Zygosaccharomyces
•Crecen en vino con alcohol < 13º y no tienen capacidad fermentativa
•Saccharomyces-”flor” útil para crianza biológica de los vinos
•Diferenciación: morfología al microscopio, aspecto del velo, capacidad
fermentativa

Característica
Observación a
microscopio (forma y
agrupación)
Aspecto del velo
Capacidad fermentativa
LEVADURAS: Flor
Levaduras de velo
Células cilíndricas,
alargadas. A veces forman
cadenas ramificadas
Velo delgado, blanco o
grisaceo, liso o poco
plegado
Nula o muy baja. En mosto
forman velo
Saccharomyces “Flor”
Células elípticas-ovoides
En parejas o flóculos
Velo grueso, color crema y
rugoso
Buena. En mosto dan
turbidez y carbónico

•Efectos en el vino:
LEVADURAS: Flor
Disminuye la acidez fija y volátil
Disminuye el alcohol
en caso exagerado da lugar a un sabor soso u acuoso del
vino y origina turbidez
• La aparición de “flor” no es grave
•Recomendaciones para su prevención:
Filtración amicróbica
Cerrar bien los depósitos
Sulfitado adecuado

Refermentaciones
LEVADURAS: Refermentaciones
• Provocan enturbiamiento y formación de gas
•No se forma velo
•Causadas por Saccharomyces, vía anaerobia
•Ocurren cuando hay azúcares residuales (

LEVADURAS: Brettanomyces
Brettanomyces (forma asexual)/Dekkera (esporógena)
•Frecuente en barrica y vinos de crianza (rara en uva y fermentación)
•Se desarrolla en vinos de elevado grado alcohólico con o sin azúcares
•Especie más frecuente: Brettanomyces bruxellensis
•Origina fenoles volátiles
p-cumárico 4-vinil-fenol 4-etil-fenol
descarboxilasa
VPR
p-ferúlico 4-vinil-guayacol 4-etil-guayacol
*VRP-vinil fenol reductasa

LEVADURAS: Brettanomyces
•Afecta las características organoléptica del vino
•Defectos causados por Brettanomyces:
Olores fenólicos (cuero, sudor de caballo) *Debido al
metabolismo de bacterias y levaduras
4-etil-fenol: bajo contenido- complejidad
Alto contenido-defecto
Gusto a ratón (más raro)- derivados de la tetrahidropirina.
*También originados por bacterias lácticas Lactobacillus y
Pediococcus
Producción de aminas biógenas
•Puede causar acidez volátil elevada
•Prevención: limpieza y desinfección de las barricas

Sustancias tóxicas de origen microbiano
Origen de sustancias tóxicas en el vino
•Contaminantes (fungicidas, pesticidas, etc)
•Aditivos (SO 2)
•Metabolismo microbiano
Etanol
Metanol
Aminas biógenas (descarboxilación de aminoácidos)
Carbamato de etilo (Metabolismo de la arginina)
Ocratoxina A
•Peligrosas para la salud humana

Aminas biógenas
•Se originan por descarboxilación de los aminoácidos
•Principales aminas biógenas en el vino:
Histidina-Histamina
Ornitina-Putrescina (diaminobutano)
Tirosina-Tiramina
Etilamina
Feniletilamina
Cadaverina
•Origen de las aminas biógenas:
Bacterias lácticas
Levaduras

Efectos sobre la salud:
•Dolor de cabeza
•Problemas respiratorios
Aminas biógenas
•Problemas de corazón (Palpitaciones)
•Hipertensión, hipotensión
•Cuadros de alergia
La sensibilidad a estos compuestos depende de cada
individuo y puede alterarse con el consumo de alcohol
y/o drogas.
La histamina es la más tóxica.

Aminas biógenas: papel de las bacterias lácticas
•Histamina, tiramina y putrescina son las principales aminas
biógenas presentes en el vino.
•Baja concentración después de la F. Alcohólica
•El contenido aumenta durante la FML
•El contenido de aminas en vino varía de unas zonas a otras
•Depende de la microflora (varía con la cepa bacteriana) y de la
presencia de aminoácidos en el vino (composición del mosto,
metabolismo levaduras, prácticas enológicas-contacto con las lías)
•La microflora es más compleja cuanto más alto es el pH
•Pedioccocus, Oenoccocus, Lactobacillus ,
•La descarboxilación de aminoácidos tiene lugar en condiciones de
estrés, como vía alternativa para obtención de energía

Carbamato de etilo
• Se forma en el vino por reacción entre:
Etanol+compuesto carbamílico
• El precursor en el vino es la urea que procede del metabolismo de la
arginina, relacionado con la actividad arginasa de las cepas de levaduras
que conducen la fermentación. Las bacterias lácticas también degradan la
arginina
• También se forma urea a partir de la degradación de ácidos nucleicos o de
componentes de la uva
Prevención
Limitar el contenido de nitrógeno en los mostos (evitar abonos
nitrogenados y terrenos muy fértiles)
Limitar activadores de fermentación y controlar las levaduras utilizadas
Control de la temperatura durante las fermentaciones
Eliminación de la urea con ureasa ácida
Baja acidez y alta temperatura inducen aumento de carbamato de etilo

Alteraciones causadas por mohos
•Los mohos atacan el grano de uva, especialmente durante la maduración
•Botrytis cinerea, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Cladosporium, otros
•Efectos causados en el mosto y/o vino:
Reducción de la cosecha
Afecta el contenido de nitrógeno
Presencia de enzimas como la lacasa (oxidasas)-quiebra
oxidásica
Alteraciones organolépticas
Afecta la estabilidad fisico-química del vino
Olor y sabor a moho
Aspergillus niger
Penicillium citroviride

Ocratoxina A
•Micotoxina producida por sp de Aspergillus y Penicillium (A. ochraceous,
P. verrucosum, A. carbonarum)
•Efectos sobre la salud: Persistencia en sangre- 35 días
Nefrotóxico
Cancerígeno (Grupo 2B-IARC “International Agency for
Research on Cancer”
•Nivel tolerado establecido OMS: 100 ng/Kg peso y semana (1995); 5
ng/Kg dia (1998).
•Contenido máximo en vinos para el 2005 (2µg/L). (Propuesto en la 82
asamblea de la OIV)
•Detección : ELISA ó HPLC
•Incidencia:
Mayor en los países calidos, mediterráneos que en zonas frías
Mayor en vinos tintos que blancos

Ocratoxina A
Presencia de Ocratoxina A en mostos y vino

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS EN ENOLOGÍA
•Toma de muestras
•Tratamiento de las muestras
•Siembra en medios de cultivo adecuados
•Recuento de células viables
•Aislamiento de microorganismos en cultivo puro
•Identificación de los microorganismos aislados

Controles microbiológicos: Toma de muestras
•Viña (de uva, suelo, madera...)
•Bodega (suelo, paredes, material de bodega, agua...)
•Mosto (antes y después de sulfitar)
•Fermentación (diariamente o en las distintas fases)
•Vino (después de la estabilización, clarificación, filtrado,
embotellado...)
NOTA: Utilizar un recipiente estéril y manipular todo lo más
asépticamente posible

Tratamiento de las muestras
•Uva-Incubación en medio líquido apropiado durante 1h
y siembra en placa para el recuento de células
•Mosto- Recuento al microscopio y cálculo de la
dilución adecuada para siembra en placa y recuento de
células
•Muestras de fermentación-Recuento, dilución apropiada
y siembra
•Vino-filtración

Recuento del nº de células viables por mL

Medios de cultivo
•Generales (YEPD, Agar mosto, WL)
•Selectivos- suplementados con compuestos que inhiben el
crecimiento de los distintos grupos microbiano
Bacterias-antibióticos como el cloranfenicol
Bacterias lácticas- estreptomicina, penicilina, nisina
Levaduras-cicloheximida, pimaricina
Hongos- propionato sódico
•Microorganismos viables, no cultivables (Seguimiento mediante
microscopía con epifluorescencia)
•Conservación de las cepas (a -80ºC)
Bacterias: (medio de cultivo+ 40% glicerol)
Levaduras: YEPD+15% glicerol

Aislamiento de levaduras
Toma de muestras
• Uva
• Mosto (sulfitado y sin sulfitar)
• Fermentación
– Fase inicial
– Fase tumultuosa
– Fase lenta o final
Recuento y dilución adecuada de la muestra
Siembra en un medio de cultivo (suplementado con un inhibidor de
crecimiento bacteriano y de hongos)
– YEPD
– Agar malta
– Agar Mosto
– WL nutrient agar
Aislamiento en cultivo puro y conservación
– Aislamiento: YEPD // Conservación: YEPD+15% glicerol

•Pruebas de identificación:
Identificación de levaduras
•Morfológicas (en placa, medio líquido y al microscopio)
•Esporulación
•Fisiológicas y Bioquímicas (dependen del estado fisiológico
y del medio de cultivo)
Asimilación y fermentación de azúcares
Asimilación de compuestos nitrogenados
Producción de enzimas
Requerimiento de factores de crecimiento
Resistencia a cicloheximida,etc

Identificación de levaduras
Pruebas de biología molecular:
•Análisis del cariotipo
•Análisis de DNA mitocondrial
•Secuenciación y análisis de restricción del rDNA
•PCR
Métodos rápidos de detección y cuantificación:
(Especialmente útiles para microorganismos de crecimiento
lento o para células viables pero no cultivables)
•Bioluminiscencia: (actividad metabólica; Ex. luciferasa)
•Epifluorescencia: (tinción con un colorante fluorescente,
Ex. Naranja de acridina)
•PCR a tiempo real: seguimiento de mRNA mediante RT-
PCR
•Hibridación in situ con sondas específicas marcadas con
un fluorocromo

Análisis del cariotipo
•Mediante electroforesis de campo pulsante
•Detecta polimorfismo del DNA genómico
•Diferenciación entre especies y cepas, mediante
diferencias de número y tamaño de los
cromosomas (S. cerevisiae- 16 cromosomas de
tamaño entre 250 y 2500 Kpb)
•Equipamiento específico, costoso y largo
•Requiere personal especializado y cepas
aisladas
•Más discriminante que la técnica de PCR y
DNA mitocondrial
Schuller et al. 2003

EVEGA 2004
Análisis del DNA mitocondrial
•Análisis del polimorfismo del DNA
mitocondrial (muy polimorfo y estable)
•Requiere poca infraestructura de
laboratorio
•Relativamente rápida y económica
•Diferenciación entre especies
•Diferenciación entre cepas de S.
cerevisiae
•Requiere cepas aisladas y personal
especializado

Análisis de restricción del rDNA
•Implica la comparación de secuencias de genes que
codifican el rRNA y de los espaciadores entre ellos
(ITS
Comparación de secuencias
Comparación de fragmentos de restricción
(PCR-RFLP)
•Requiere previa amplificación mediante PCR

Schuller etal. 2003
PCR
•Amplificación de secuencias específicas utilizando un
termociclador
•Equipamiento costoso, personal especializado
•Técnica rápida que permite actuar en caso de necesidad
•Seguimiento de implantación de levaduras inoculadas
en fermentación (Permite diferenciar LSA)
•RAPDs- amplificación de regiones genomicas al azar utilizando primers
cortos e inespecíficos (poco reproducible)
•ITS
•Amplificación de secuencias delta- flanquean el retrotransposón Ty

Aislamiento e identificación de Brettanomyces
•Filtración de la muestra
•Siembra en un medio específico (crecimiento lento, en medios
convencionales las otras levaduras crecen más rápido)
Medio DBDM
Crecimiento 25º C, 2 semanas
•Identificación : métodos convencionales
•Métodos moleculares: PCR, hibridación in situ con fluorescencia,
PCR a tiempo real

Aislamiento e identificación de bacterias acéticas
•Medios de cultivo
•Suplementados con inhibidor del crecimiento de
levaduras y de bacterias lácticas
WL+ 2% etanol (ó 10% de vino estéril). Colonias color
verde
GYC (Glucosa 5%, extracto de levadura 1%, , CaCO 3
3%, agar %)
Mannitol medium (manitol 2,5%, extracto de levadura
1%, agar 1,5%)
MRS + 2% etanol
•Temperatura de incubación: 25-28º C (5-7 días)
•Condiciones aeróbicas

Aislamiento e identificación de bacterias acéticas
•Pruebas de identificación
Gram +, Catalasa –
Oxidación del etanol, glicerol y lactato
Formación de compuestos cetónicos
Crecimiento en acetato sódico o etanol como única
fuente de carbono
Crecimiento en dulcitol
Producción de pigmentos marrones en GYC
Producción de celulosa (filtrabilidad del vino)
•Métodos moleculares (PCR y secuenciación de rRNA 16S)

Aislamiento e identificación de bacterias lácticas
AISLAMIENTO
• Medios de Cultivo
AGB (acidic grape broth, pH4,8) (O. oeni)
MRS
• Incubación en estufa de anerobiosis
• Temperatura y tiempo de incubación. 30º durante 48 h
• Pruebas de Identificación
–Gram+
– Morfología (coco o bacilo)
– Homofermentativa o heterofermentativa
– Fermentación de azúcares
– Crecimiento en determinadas condiciones de pH, Tª
• Técnicas moleculares
–PCR específica (primers del gen-enzima maloláctica) (O. oeni)

Aislamiento e identificación de bacterias lácticas
Características identificativas de Oenoccocus oeni

Control microbiológico de vinos embotellados
Filtración de una cantidad de vino conocida
utilizando un sistema adecuado
Colocación de la membrana en un medio de cultivo
adecuado
Crecimiento a temperatura adecuada
Recuento de microorganismos viables presentes en la
muestras
Identificación de los microorganismos encontrados
Evaluación del riesgo

Como prevenir las enfermedades microbianas de los vinos
•Mantener unas condiciones higiénicas adecuadas en la
bodega
•Procurar que la uva entre en buenas condiciones
•Evitar paradas fermentativas procurando obtener vinos con
una concentración de azúcar < 2g/l
•Sulfitado adecuado (25-30 mg/L)
•Conservación adecuada: Mantener los depósitos llenos y
cerrados y a baja temperatura
•Filtración amicróbica de los vinos antes del embotellado

Selección de levaduras y bacterias en
enología
• Papel en la calidad del vino
• Bacterias
Criterios de selección
Uso de bacterias seleccionadas
• Levaduras
Criterios de selección
Levaduras seleccionadas
Levaduras autóctonas: ventajas e inconvenientes

Selección de bacterias
Características deseables para cultivos iniciadores de bacterias lácticas
•Elevada degradación de ácido L-málico
•Resistencia a grado alcohólico elevado (en torno al 15%)
•Resistencia a SO 2 (a concentración 50 mg/L)
•Capacidad de crecimiento a bajo pH (Resistencia a la acidez)
•Capacidad de crecimiento a bajas temperaturas
•Baja producción de acidez volátil
•Buenas propiedades organolépticas (ausencia de caracteres sensoriales -)
•Metabolismo limitado de azúcares
•Resistencia al ataque de bacteriofagos
•No producción de polisacáridos extracelulares
•No producción de compuestos tóxicos (Ej: aminas biógenas)
•Fácil obtención de biomasa y resistencia a los procesos de congelación y
liofilización

Selección de bacterias
Obtención de cultivos iniciadores de bacterias
Obtención de biomasa, centrifugado y liofilización
Utilización de bacterias comerciales
Siembra directa o con rehidratación y/o reactivación previa
Control de calidad de las cepas comerciales
•Caracterización de la especie
•Viabilidad (UFC/g)
•Determinación de la actividad maloláctica
•Verificación de la ausencia de contaminantes (coliformes,
estreptococos, sulfitoreductores, leavduras y mohos)
•Verificación de caracteres fisiológicos sobre medios sintéticos
y vinos
•Verificación de la ausencia de fagos

Criterios generales:
•Ser autóctona
Selección de levaduras autóctonas
•Buena capacidad fermentativa (rápido arranque y acabado)
•Alta producción de etanol y regularidad fermentativa
• Alta tolerancia al etanol
•Producción baja de acidez volátil
•No formación de espuma
•Resistencia a sulfuroso
•Baja producción de sulfhídrico
•Otras: fenotipo killer

Selección de levaduras autóctonas
Levaduras seleccionadas para elaboración de blancos
•Tolerancia a bajas temperaturas
•Potenciación de aromas varietales y expresión de aromas
secundarios
•Capacidad de acidificación y desacidificación biológica
•Crecimiento disperso en medio líquido
Levaduras seleccionadas para tintos
•Alta producción de acetaldehido y pirúvico-estabilización del
color
•Baja capacidad de adsorción de antocianos a la PC
•Producción de glicerol- suavidad
•Degradación del ácido málico

Ventajas
Selección de levaduras autóctonas
Uso de levaduras comerciales (LSA)
•Calidad más uniforme, garantiza repetitividad
•Ayuda a resolver problemas de posible arranque, ralentización o
paradas de fermentación
•Homogeneidad en los vinos
Inconvenientes
•Pérdida de complejidad en el vino final
•No son propias de la región
•Pueden no implantarse por competencia entre las levaduras
presentes en el mosto

Selección de levaduras autóctonas
Ventajas de las levaduras autóctonas
•Específicas del área
•Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona
•Totalmente adaptada al tipo de mosto
•Responsables de características únicas de los vinos (tipicidad)

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