Roche Diagnostics informa - Roche España

Roche
Diagnostics
informa
Especial 6 as Jornadas de Residentes
39%
Octubre 2010
61%
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18
36
50
Inflamación y aterosclerosis subclínica
en el paciente trasplantado renal.
Relación con la edad y la función renal.
Cristian Morales-Indiano
Incorporación de la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa
a tiempo real para el diagnóstico de la
tuberculosis.
Esther Clapés Sánchez
Mecanismo de acción de kaliocina-1,
un nuevo péptido antimicrobiano
derivado de la lactoferrina humana.
Mónica Viejo Díaz
Abstracts

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
[2]
InflaMaCIón y atEroSClEroSIS SubClínICa En El paCIEntE
traSplantaDo rEnal. rElaCIón Con la EDaD y la funCIón
rEnal.
Cristian Morales-Indiano 4
InCorporaCIón DE la téCnICa DE rEaCCIón En CaDEna DE
la polIMEraSa a tIEMpo rEal para El DIagnóStICo DE la
tubErCuloSIS.
Esther Clapés Sánchez 18
MECanISMo DE aCCIón DE kalIoCIna-1, un nuEVo péptIDo
antIMICrobIano DErIVaDo DE la laCtofErrIna huMana.
Mónica Viejo Díaz 36
CuantIfICaCIón DE antígEno lEuCoCItarIo huMano g
SolublE En SobrEnaDantE DEl CultIVo DE EMbrIonES
CoMo InDICaDor DE Su CapaCIDaD DE IMplantaCIón En un
prograMa DE rEproDuCCIón aSIStIDa.
MªJosé artacho reinoso 51
prEValEnCIa DEl SínDroME MEtabólICo traS Infarto
aguDo DE MIoCarDIo, MarCaDorES pro-InflaMatorIoS
aSoCIaDoS.
lina benali 53
EStaDo aCtual DE loS pragraMaS DE CrIbaDo DEl CánCEr
DE pulMón. papEl DE loS bIoMarCaDorES En El CrIbaDo.
Ignacio Constanso Conde 55
Valor DIagnóStICo y pronóStICo DE loS autoantICuErpoS
En DIfErEntES EnfErMEDaDES autoInMunES: CElIaquía,
artrItIS rEuMatoIDE, CIrroSIS bIlIar prIMarIa y lupuS
ErItEMatoSo SIStéMICo.
luís Manuel fernández Domínguez. 57
nanotECnología aplICaDa al laboratorIo ClínICo.
María gutiérrez agulló 59
utIlIDaD DIagnóStICa y pronóStICa DE la DEtECCIón DE
MutaCIonES En El gEn p53 En MuEStraS DE tEJIDo
pulMonar.
Silvia Martínez Couselo 61
tIrotropIna y horMonaS tIroIDEaS DISCorDantES.
ana Mª Santo quiles 63
EStuDIo DE la rElaCIón EntrE El polIMorfISMo I/D DEl
gEn aCE y la prESIón artErIal.
gemma Solé i Enrech 65
InMunotErapIa DEl CánCEr baSaDa En CélulaS
DEnDrítICaS.
natalia Suárez fuentetaja 67
Edita: Roche Diagnostics S.L. Av. Generalitat s/n 08174 Sant Cugat del Vallès Tel. 935834000 Fax 935834340
Directora: Maite Panadero Comite de redacción: Luis de Cabo, Maribel Villarino, José Luis Salvador y José Mari Sanz
Realización: Miguel Luis Maier e-mail: rd.informa@roche.com Depósito legal: B-4684 1980

las Jornadas para residentes de laboratorios de análisis Clínicos son un reflejo del interés de roche
Diagnostics por la formación. organizadas conjuntamente con la universidad Europea de Madrid, pretenden
ser un marco en el que los actuales residentes de los laboratorios de análisis clínicos puedan ampliar o
complementar su formación; intentan así contribuir a allanar un poco el difícil camino que les ha de llevar
a ser los grandes profesionales que la sociedad en general y el cambiante entorno sanitario en particular
demanda.
la quinta edición de estas jornadas tuvo lugar en otoño de 2009. al igual que en la edición anterior,
se trataron los aspectos más novedosos de las áreas temáticas de Sistemas de Información, Calidad,
Investigación, tecnología, bioinformática y bioseguridad. la elaboración de un trabajo por parte de los
asistentes sobre alguno de los temas tratados puso como siempre el punto y final a las jornadas. al igual
que en la edición anterior, se premiaron los mejores trabajos, tanto económicamente como mediante su
publicación.
El tribunal designado para la evaluación de los distintos trabajos estuvo formado por dos
miembros de la universidad Europea de Madrid y dos miembros de roche Diagnostics, quienes tras una
minuciosa revisión de los mismos seleccionaron los trece mejores trabajos, un primer premio, dos accésits ex
aequos y 10 menciones especiales.
la valoración se hizo atendiendo a diversos criterios como son la originalidad del trabajo, su objetivo, la
bondad de la bibliografía asociada, las conclusiones, si se trataba de un
trabajo experimental o de una revisión y la presentación del mismo. Este número especial de la revista
roche Diagnostics informa recoge los trabajos seleccionados; los tres primeros se publican completos y los
restantes aparecen en forma de resúmenes según el orden alfabético del apellido del autor. a petición de su
autor, uno de los resúmenes no ha sido publicado.
nos sentimos orgullosos de poder decir que han sido muchos los trabajos excelentes y la selección no ha
sido fácil. probablemente algunos de los que han quedado fuera son tan dignos de ser publicados como los
aquí expuestos, pero hay que elegir y se ha intentado hacer de la forma más justa posible, consensuando las
opiniones de diversos profesionales. felicitamos, sin embargo, a todos los participantes, y les alentamos a
seguir en el camino de profesionalidad.
El primer premio ha recaído en Christian Morales del hospital universiari germans trias i pujol de badalona y
los dos accésits han recaido en Esther Clapés del hospital universitario Dr. Josep trueta de girona y Mónica
Viejo del hospital general yagüe de burgos.
El resto de trabajos seleccionados, ya por orden alfabético de autor, corresponden a Mª José artacho
(hospital general universitario de alicante), lina benali (hospital universitario Virgen de la arrixaca,
Murcia), Ignacio Constanso (Complejo hospitalario universitario a Coruña), luís Manuel fernández
(Complejo hospitalario universitario de albacete), María gutiérrez (hospital universitari Vall d’hebron,
barcelona), Silvia Martínez (hospital de la Santa Creu i Sant pau, barcelona), ana Mª Santo (hospital general
de Elda Virgen de la Salud), gemma Solé (hospital universitario de bellvitge) y natalia Suárez (Clínica
universitaria de navarra, pamplona). Vaya desde aquí nuestra felicitación a todos ellos.
[3]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
Inflamación y
aterosclerosis subclínica
en el paciente
trasplantado renal.
Relación con la edad y la
función renal.
CRISTIAN MORALES-INDIANO
Laboratorio analisis clínicos del
Hospital Universitari Germans
Trias i Pujol. Badalona.
[4]

INTRODUCCIÓN
Enfermedad renal y riesgo cardiovascular
En la actualidad la enfermedad renal crónica (ERC) afecta a
un alto porcentaje de la población y constituye un importante
problema de salud pública. El envejecimiento junto con la
alta prevalencia de la diabetes y la enfermedad vascular son
una de las principales causas de este hecho.
Tanto los pacientes con ERC como en tratamiento sustitutivo
en diálisis o transplante renal presentan una
morbimortalidad más elevada que la población general,
debido principalmente a la enfermedad aterosclerótica
cardiovascular (1, 2). Es conocido que la enfermedad renal y
la patología cardiaca guardan una estrecha relación, por un
lado la ERC genera un estado aterosclerótico y el efecto que
ejerce dicho estado sobre las arterias renales acentúa aún más
la insuficiencia renal entrando en un círculo vicioso que
agrava ambas patologías. La ERC refleja un estado acelerado
de enfermedad vascular aterosclerótica incrementando así la
aparición de episodios cardiovasculares y el riesgo de
mortalidad (2,3).
Por si misma, la ERC es considerada un factor de riesgo
independiente tanto de enfermedad como de mortalidad
cardiovascular en la población general (4). Según el 7º
informe del Joint Nacional Committé, un filtrado glomerular
(FG) estimado inferior a 60 mL/min es considerado como uno
de los principales factores de riesgo cardiovasculares (5).
Varios estudios han relacionado la disminución de la función
renal con una alta prevalencia de enfermedad (6) y
mortalidad cardiovascular (7). En una cohorte de 15350
sujetos Manjunath et al. (8) expone que el riesgo de
morbimortalidad cardiovascular o no, está incrementado por
cada 10 mL/min que disminuye el FG. Henry et al (9) por su
parte encuentra resultados similares para cada 5 mL/min que
dismunye el FG.
Los pacientes con tratamiento en diálisis tienen una
mortalidad cardiovascular más elevada que los pacientes que
han recibido un transplante renal (TR) (10). El TR como
terapia sustitutiva implica, en comparación con la diálisis,
una mejor calidad de vida (11), un menor coste económico
(12) y un incremento en aproximadamente 10 años en la
esperanza de vida del paciente (10, 13). A pesar de los
beneficios citados, la mortalidad en el paciente trasplantado
renal sigue siendo en la actualidad elevada donde la
enfermedad aterosclerótica es la principal causa de muerte,
incluso con riñón funcionante. En este sentido, el riesgo
anual de padecer un episodio cardiovascular (mortal o no) en
la población transplantada se encuentra entre un 3,5% y un
5%, siendo 50 veces superior que en la población general (1).
La lesión aterosclerótica está caracterizada por un aumento
del grosor de la íntima media (GIM) y/o la presencia de placa
de ateroma. Existen varios métodos para determinar el GIM
y la presencia de placa, siendo la técnica de elección la
ultrasonografía carotídea (US). La US es una técnica de
imagen no invasiva que ha demostrado una gran utilidad
como marcador independiente de enfermedad aterosclerótica
(14, 15). La determinación de estos dos parámetros es útil en
el cribado de la aterosclerosis asintomática, también conocida
como subclínica o preclínica, ya que tanto el GIM (16) como
la presencia de placa (17, 18) han demostrado ser fuertes
factores predictores de episodios cardiovasculares en la
población general. Así mismo, también se han descrito como
buenos predictores de enfermedad y mortalidad
cardiovascular en pacientes con ERC, en hemodiálisis y en
transplantados renales (19).
Es conocido que la aparición y desarrollo de la ERC está
asociada a una alta prevalencia de factores de riesgo
“TRADICIONALES” y relacionados con la uremia tales como
la hipertensión, diabetes mellitus, sobrecarga hemodinámica,
anemia, etc. Sin embargo, la combinación de estos factores de
riesgo conocidos, explicarían solo parcialmente el aumento
del riesgo cardiovascular en los pacientes con ERC o en
diálisis, indicando que existen otros factores, conocidos como
“NO TRADICIONALES” (emergentes) que incidirían en
mejor medida en esta población. La homocisteina, la
inflamación o el estrés oxidativo son algunos ejemplos. En la
tabla I se muestran los principales factores tradicionales y no
Tabla I: Factores tradicionales y no tradicionales de riesgo
cardiovascular en enfermos renales.
Factores de riesgo
tradicionales
Factores de riesgo no
tradicionales
Edad Disminución FG
Sexo (masculino) Proteinuria
Hipertensión Anemia
Hipercolesterolemia Activación sistema reninaangiotensiva
Diabetes mellitus Malnutrición
Tabaquismo INFLAMACIÓN
Historia familiar de ECV Infección
Menopausia Estrés oxidativo
Obesidad Hiperhomocisteinemia
Sedentarismo/alcohol Factores trombogénicos
FG: Filtrado glomerular; ECV: Enfermedad cardiovascular
tradicionales responsables de un incremento cardiovascular
en el enfermo renal. La base de nuestro estudio se centra
sobretodo en la inflamación como proceso implicado en la
aparición y desarrollo de la aterosclerosis.
La aterosclerosis como enfermedad inflamatoria
Es conocido que la aterosclerosis no es una simple
acumulación de lípidos y colesterol en la pared vascular de las
[5]

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arterias, sino que se trata de una patología mucho más
compleja, considerada actualmente como una enfermedad
inflamatoria (20, 21) cuya aparición y desarrollo se producen
en respuesta al daño de la pared vascular.
En los últimos años, se ha descrito como origen de la
aterosclerosis una disfunción endotelial en el interior de la
pared vascular. Dicha disfunción vendría causada por
múltiples factores que originarían un daño en el endotelio. La
lesión en el endotelio vascular altera su funcionalidad
habitual, originando un estado inflamatorio que desencadena
múltiples cascadas moleculares y celulares dando paso al
desarrollo de la enfermedad aterosclerótica. La disfunción
endotelial está implicada en cada etapa de la progresión de la
aterosclerosis, desde la formación de la estría grasa en la fase
inicial hasta la ruptura de la placa, mediante varios
mecanismos como una regulación de moléculas de adhesión,
incremento en la secreción de quimiocinas, adherencia de
leucocitos, aumento de la permeabilidad, oxidación de
moléculas LDL, activación de plaquetas, formación de
citocinas y migración y proliferación de células del músculo
liso de la pared vascular (22-24). En este sentido existe
evidencia suficiente para considerar que la inflamación juega
un papel clave en el inicio y progresión de la aterosclerosis.
Asimismo, es necesario el estudio de biomarcadores que
reflejen de una manera fiable la extensión de la inflamación y
de esta manera poder valorar el riesgo cardiovascular.
Se han propuesto varias moléculas como marcadores del
estado inflamatorio (MIF), tanto en individuos sanos como
en enfermos con ERC (25). Destaca la proteína C reactiva
(PCR), de origen hepático, considerada actualmente la
principal proteína humana de fase aguda e indicador no
específico bien establecido de inflamación. Niveles elevados
de PCR se han asociado a enfermedad y mortalidad
cardiovascular tanto en individuos sanos como enfermos
renales (26, 27). También se han descrito otras moléculas,
menos estudiadas aunque bien conocidas, como marcadores
inflamatorios asociados a enfermedad aterosclerótica tales
como la interleucina-6 (IL-6), el factor de necrosis tumoral
alfa (TNFα) o la proteina del suero amiloide tipo A (SAA).
Niveles elevados de IL-6, una citocina proinflamatoria que
regula la síntesis hepática de la PCR, se han asociados tanto a
episodios cardiovasculares como a mortalidad
cardiovascular en individuos sanos (26, 28-30) y en pacientes
con disminución del FG (31) o en HD (31-33). El TNFα otra
citocina proinflamatoria que, junto con la IL-6 también
regula la secreción de la PCR, se ha descrito como predictor
de episodios cardiovasculares (30, 34). El SAA es una proteína
de fase aguda descrita por algunos autores como marcador de
riesgo de aterosclerosis (35). Junto con la PCR se ha asociado
a angina inestable, utilizándose como valor pronóstico de
episodios cardiovasculares (37).
En resumen, destacar el importante papel que desarrollaría el
análisis de determinados marcadores en el estado
[6]
inflamatorio que presentan los enfermos transplantados
evaluando y estratificando así el posible riesgo
cardiovascular.
Objetivo
El presente trabajo consta de un estudio prospectivo cuyo
objetivo se divide en dos partes; por un lado se evalúa la
relación existente entre los marcadores de inflamación
analizados en el pretransplante con el aumento del GIM y la
aparición de placa. Un segundo punto estudia la evolución de
la inflamación a los 3 meses del transplante y si dicha
evolución se puede asociar con un empeoramiento de la
función renal al año.
MATERIAL Y MÉTODOS
Pacientes
Estudio prospectivo de 131 pacientes con ERC y sometidos a
un TR de donante cadáver. El periodo durante el que se
realizaron los transplantes renales transcurre entre enero del
2003 y junio del 2006.
MUESTRA PRETRANSPLANTE (PRE-TR).
Las muestras sanguíneas se obtuvieron entre 6 y 8 horas
previas al transplante renal. Todos los pacientes se
encontraron en ayunas durante al menos 8 horas.
MUESTRA POSTRANSPLANTE (POST-TR).
A los 3 meses y al año del transplante renal se obtuvo una
nueva muestra de cada paciente. Igualmente todos los
pacientes se encontraron en ayunas durante al menos 8 horas.
En el momento de la recogida de la muestra el paciente se
encontraba en una situación estable y no presentaba ningún
proceso agudo infeccioso, inflamatorio ni rechazo. Ambas
muestras (preTR y postTR), tras la extracción fueron
centrifugadas durante 15 minutos a 1450g y almacenadas a
una temperatura de conservación de -80ºC. Las muestras
fueron analizadas juntas bajo las mismas condiciones
analíticas.
Marcadores de Inflamación
Se estudiaron los siguientes marcadores de la inflamación
(MIF): proteina C reactiva (PCR), proteína del suero amiloide
A (SAA), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), factor de
necrosis tumoral α (TNFα) y receptor soluble del factor de
necrosis tumoral α (sTNFα-R). La determinación de los MIF
se realizó previa al transplante y a los 3 meses del mismo.
Para estudiar la evolución de la inflamación en los 3 primeros

meses tras el TR, se utilizó la “ratio” de los MIF analizados.
La “ratio” de los MIF se calculó a partir de la determinación
realizada a los 3 meses del transplante (posTR) respecto a la
determinación previa al transplante (preTR).
Ratio= MIF 3meses / MIF preTR.
Las concentraciones séricas de IL-6 y TNFα se determinaron
mediante un inmunoanálisis quimioluminiscente
automatizado en Immulite 1 (DPC, Los Angeles, CA, USA).
El coeficiente de variación interserial (CV) fue de 3,7% y 5,9%
para concentraciones de IL-6 de 78 ng/L y 459 ng/L
respectivamente. Respecto el TNFα , el CV interserial fue de
2,5% y 4,8% para unas concentraciones de 96 ng/L y 567 ng/L
respectivamente.
La determinación sérica de SAA y PCR ultrasensible se
realizó por nefelometría utilizando un BN-ProSpect (Dade
Behring, GMBH, Marburg, Germany). El CV interserial para
PCR ultrasensible fue de 3,7% y 3,5% para una concentración
de 2,38 mg/L y 52,2 mg/L respectivamente.
Concentraciones de IL-8 se realizaron a partir de
inmunoanálisis quimioluminiscente mediante un Evidence
Investigador TM (Randox) obteniendo un CV de 9,7 % para
una concentración de 39,8 ng/L.
El sTNFα-R se determinó mediante un método ELISA
(BKline) obteniendo un CV intersrial de 10,89 % para una
concentración de 4,5 μg/L.
Ultrasonografía carotídea
Para el estudio de la aterosclerosis subclínica se determinó el
grosor de la íntima-media (GIM) y la presencia de placa en
arterias carotídeas. La medición de ambos parámetros se
realizó mediante ultrasonografía carotídea (US). La US fue
realizada con un sistema Duplex-Doppler color (Acuson
Sequoia 512) durante el primer mes del transplante. Se utilizó
un transductor de señal de alta resolución de 7,5 a 14 MHz de
frecuencia en modo B para la imagen a tiempo real y de 3,5
MHz para el estudio del Doppler. Se analizó las arterias
carotídeas mientras el paciente se encontraba en posición
supina con el cuello extendido. Los vasos se escanearon
utilizando las secciones anterior-oblicua, lateral, posterioroblicua
y transversa. En la ecografía carotídea se analizaron 3
segmentos: la arteria carótida común, la externa y la interna
(incluyendo la bifurcación).
El GIM corresponde a la distancia existente entre la luz de la
íntima carotídea y la media adventicia de la pared distal
(figura 1). Se consideró la presencia de placa como un
engrosamiento focal de la pared vascular superior a 1,2 mm
(figura 2). Los resultados obtenidos se realizaron en base al
GIM medio, que corresponde a la media de los GIM máximo
de la carótida derecha e izquierda.
Figura 1: Medición del grosor de la íntima medio por ultrasonografía.
Figura 2: Presencia de placa determinada por ultrasonografía en arteria
carotídea.
Función renal
Es conocido que el filtrado glomerular (FG) es el mejor índice
para valorar la función renal tanto en enfermos renales como
en individuos sanos. Existen varias ecuaciones para estimar
la FG siendo la de mayor consenso la fórmula desarrollada
y validada en el estudio de la Modification of Diet in Renal
Disease (MDRD) publicada por el grupo de Levey (36). Existe
una ecuación abreviada descrita para la fórmula MDRD
inicial, dicha ecuación se correlaciona muy bien con su
homóloga, es menos compleja y más fácilmente aplicable (37).
[7]

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En nuestro trabajo se estimó el FG al año del transplante a
partir de la fórmula abreviada del MDRD:
FG estimado = 186 x (creatinina) -1,154 x (edad) -0,203 x (0,742 si
mujer) x (1,210 si raza negra)
Las guías de práctica clínica elaboradas por la Kidney Disease
Outcomes Quality Initiative (K/DOQI) de la Nacional Kidney
Fundation (NKF) clasifican la enfermedad renal crónica en 5
estadios (38) (tabla II). Debido a que en nuestra población de
Tabla II: Clasificación de la enfermedad renal crónica en estadios según
las guías de la Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (K/DOQI).
Estadio Descripción FG (mL/min)
1 Lesión renal y FG normal o aumentado ≥ 90
2 Lesión renal y Disminución leve del FG 60 – 89
3 Disminución moderada del FG 30 – 59
4 Disminución grave del FG 15 – 29
5 Fallo renal o diálisis < 15
FG: filtrado glomerular
estudio, transcurrido un año del transplante, tan solo hay 4
pacientes con un FG inferior a 15 mL/min, se ha utilizado
como punto de corte un FG inferior a 30 mL/min. De esta
manera englobamos tanto a pacientes con una disminución
grave del FG (estadio 4) como a pacientes con fallo renal o en
diálisis (estadio 5).
Análisis estadístico
En un primer momento se realizó el test de Kolmogorov-
Smirnov para comprobar que las variables a estudio seguían
una distribución normal.
Para describir las características demográficas y clínicas se
utilizaron la media (m), desviación estándar (DS) y porcentaje
(%).
Se usó el t-test Student para comparar medias en aquellas
variables con distribución normal, mientras que en el caso
opuesto se aplicó el test no paramétrico de U-Mann Whitney.
En el estudio de correlación entre dos variables se utilizó,
dependiendo si la distribución era normal o no, una
correlación de Pearson o Spearman.
Tanto el análisis univariante como el multivariante se realiza
a partir de un modelo de regresión logística utilizando un
intervalo de confianza para la Odds ratio del 95%. Las
variables respuesta (o dependientes) que se utilizaron en los
modelos de regresión logística fueron: GIM medio superior a
0,77 mm, la presencia de placa y un MDRD inferior a 30 ml/
min. Como covariables se utilizaron las características
demográficas y clínicas de los pacientes transplantados y los
MIF estudiados.
[8]
La bondad del ajuste para el modelo multivariante de
regresión logística se comprobó a partir del test de Hosmer y
Lemeshow (39).
Se consideraron significativos los resultados con P-valores
inferiores a 0,05. Los resultados obtenidos se analizaron
utilizaron el paquete estadístico SPSS V14.0.
RESULTADOS
Se estudiaron 131 pacientes con una media de edad de 53,63 ±
11,97 años. Los hombres representaban el 67,9 % (n=89) y las
mujeres el 32,1 % (n=42) de los pacientes estudiados. Previo al
TR, el 79,8% de los pacientes se encontraban en hemodiálisis
(HD) y el 20,2 % en diálisis peritoneal (DP). El tiempo medio
en diálisis fue de 28,91 ± 25,67 meses, independientemente
del tipo de diálisis. Las características demográficas y clínicas
de la población estudiada se muestran en la tabla III.
En relación a la ecografía carotídea, se obtuvo una media para
GIM de 0,82 ± 0,32 mm y se determinó la presencia de placa
en el 49,5 % de los pacientes.
Tabla III: Características demográficas y clínicas de los pacientes
estudiados. Las variables continuas están expresadas como media ± DS
mientras que las variables categóricas en porcentaje.
Variable
Número Pacientes 131
Edad receptor (años) 53,63 ± 11,97
Edad donante (años) 51,52 ± 14,4
Sexo (%): Hombres / Mujeres 67,9 / 32,1
ÍMC (Kg/m2)
Causa de la enfermedad renal (%)
25,17 ± 3,70
Poliquistosis 11,9
HTA /Nefroangiosclerosis 14,3
Túbulo intersticial/pielonefritis crónica 7,9
Glomerulonefritis 20,6
Nefropatia diabética 13,5
No filiada 19,1
Otras 11,9
Tipo de diálisis (%): DP / HD 20,2 / 79,8
Meses en diálisis 28,91 ± 25,67
Isquemia fría (horas) 19,04 ± 5,57
DM preTR (%): Si/No 19,5 / 80,5
Presencia de placa: (%): Si/No 49,5 / 50,5
Grosor de la íntima-media carotídeo (mm)
Función renal
0,82 ± 0,32
Creatinina sérica (μmol/l) 156,51 ± 51
MDRD abreviado (mL/min/1,73m2) 45,87 ± 15,48
IMC: índice de masa corporal; HTA: hipertensión; DP: diálisis peritoneal;
HD: hemodiálisis; DM: diabetes mellitus; TR: transplante renal; MDRD:
fórmula del estudio Modification of diet in renal disease

Influencia de la Edad
En relación con la edad, los resultados muestran que los
pacientes que presentan placa son de edad más avanzada
respecto a los que no tienen placa (placa No: 49,06 ± 12,41
años versus placa Si: 56,91 ± 10,19 años; p=0,001). Tomando
como punto de corte la mediana del GIM medio, se obtiene
que los pacientes con un GIM superior a 0,77mm muestran
diferencias significativas respecto la edad en comparación a
los que tienen un GIM inferior a 0,77 (GIM < 0,77mm = 47,30
± 11,63 años versus GIM > 0,77= 58,90 ± 9,40años; p

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En la figura 5 se puede observar la dispersión de algunos de
los marcadores de inflamación que se correlacionaron entre sí
significativamente.
Evaluación del Grosor de la Íntima-media
Los pacientes estudiados presentan una media para GIM de
0,82 ± 0,32 mm. Tomando como valor de referencia los
valores descritos en la población general catalana por Junyent
et al (40) en el que consideran como patológico un GIM
superior a 0,80 mm (p75 del GIM máximo sin diferencias
respecto al sexo), obtenemos que en nuestra población el 41,9
% de los pacientes transplantados se encuentran por encima
de este valor. En la figura 6 se puede observar como se
incrementa el porcentaje de pacientes con un GIM superior a
0,80 en cada cuartil de edad.
Se obtiene una correlación positiva entre el GIM medio y los
siguientes MIF: IL-8 (r=0,219; p=0,034), TNFα (r=0,222;
p=0,026) y sTNFα-R (r=0,308; p=0,02).
Tomando como punto de corte la mediana del GIM medio
(0,77 mm) se observan diferencias estadísticamente
significativas en relación con la IL-6, el TNFα y el sTNFα-R.
En la tabla V se muestran los estadísticos descriptivos de los
MIF en relación con un GIM superior a 0,77mm.
[10]
En el análisis univariante utilizando como variable
dependiente la mediana del GIM medio y como covariables la
edad del receptor, el sexo, el IMC, el tipo y meses en diálisis,
Figura 5: Gráficos de
dispersión que muestra
la distribución de los
marcadores de inflamación
que se correlacionaron
significativamente.
PCR: proteína C reactiva; IL6:
interleucina 6; TNFalfa: factor
de necrosis tumoral α.
Fig 6: Porcentaje de pacientes con un GIM
medio >0,80 mm en relación a los cuartiles
de edad.
GIM: Grosor de la íntima-media carotídea.

Tabla V: Comparación de los marcadores de inflamación estudiados en
relación con un grosor de la íntima medio carotideo superior a 0,77mm.
El cálculo del p-valor se realizó con la prueba estadística T-test de
Student en caso de distribución normal y con el test U de Mann-Whitney
en caso contrario.
GIM medio p50
MIF Estudiado
PCR (mg/L)
0,77mm p
Mediana 4,12 3,78 0,348
Rango (p25-p75)
SAA (mg/L)
1,43-7,03 1,39-12,82
Mediana 5,91 8,15 0,157
Rango (p25-p75)
IL-6 (ng/L)
3,23-11,2 3,40-19,30
Mediana 3,81 5,44 0,035*
Rango (p25-p75)
IL-8 (ng/L)
2,68-7,39 3,80-7,85
Mediana 12,27 16,28 0,113
Rango (p25-p75)
TNFα (ng/L)
7,09-16,73 8,35-22,73
Mediana 12,00 14,00 0,017*
Rango (p25-p75)
sTNFα-R (ng/mL)
9,95-15,29 10,9-19,20
Media ± DS 33,2 ± 10,8 38,6 ± 10,3 0,003*
MIF: marcadores inflamatorios; GIM: grosor de la íntima-media
carotídea; PCR: proteina C reactiva; SAA: suero amiloide A; IL-6:
interleucina 6; IL-8: interleucina 8; TNFα: factor de necrosis tumoral
α; sTNFα-R: receptor soluble del TNFα.
Tabla VI: Análisis de regresión logística univariante de factores de
riesgo para un incremento del GIM >0,77 mm.
GIM medio p50
OR I.C [95%] p
Edad (años) 1,10 1,06-1,15

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Tabla VIII: Comparación de los marcadores de inflamación estudiados
en relación con la presencia de placa.
El cálculo del p-valor se realizó con la prueba estadística T-test de
Student en caso de distribución normal y con el test U de Mann-Whitney
en caso contrario.
MIF Estudiado
PCR (mg/L)
No
PLACA
Si p
Mediana
Rango (p25-p75)
SAA (mg/L)
2,81
1,24-5,04
6,34
1,83-14,70
0,003*
Mediana
Rango (p25-p75)
IL-6 (ng/L)
5,88
3,26-11,90
7,46
3,56-16,00
0,400
Mediana
Rango (p25-p75)
IL-8 (ng/L)
4,05
2,81-6,89
5,18
3,80-8,38
0,093
Mediana
Rango (p25-p75)
TNF-α (ng/L)
11,42
7,62-15,59
16,86
9,96-31,41
0,001*
Mediana
Rango (p25-p75)
sTNFα-R (ng/mL)
12,1
9,76-16,7
13,45
11,17-18,5
0,080
Media ± DS 32,1 ± 9,9 37,2 ± 13,2 0,038*
MIF: marcadores de inflamación; PCR: proteina C reactiva; SAA:
suero amiloide A; IL-6: interleucina 6; IL-8: interleucina 8; TNFα:
factor de necrosis tumoral α; sTNFα-R: receptor soluble del TNFα.
Tabla IX: Análisis de regresión logística univariante de factores de
riesgo para la presencia de placa.
OR
PLACA
I.C [95%] P
Edad (años) 1,06 1,02-1,10 0,001*
Sexo (Hombre) 1,39 0,60-3,20 0,435
ÍMC (Kg/m2) 1,03 0,93-1,14 0,542
Tipo de diálisi (DP) 1,53 0,58-4,03 0,382
Meses en diálisis 1,01 0,99-1,02 0,428
DM preTR (Si)
MIF:
3,66 1,09-12,20 0,035*
PCR (p75: 9,01 mg/L) 5,55 1,98-15,55 0,001*
SAA (p75: 13,65 mg/L) 1,81 0,65-5,03 0,255
IL-6 (p75: 7,62 ng/L) 2,05 0,80-5,24 0,135
IL-8 (p75: 20,75 ng/L) 3,90 1,26-12,08 0,018*
TNF-α (p75: 17,10 ng/L) 1,60 0,65-3,93 0,307
sTNFα-R (p75: 43,04 ng/mL) 4,50 1,59-12,74 0,005*
OR: Odds ratio; I.C: intervalo de confianza; IMC: índice de masa
corporal; DP: diálisis peritoneal; DM: Diabetes Mellitus. TR:
trasplante renal; MIF: marcadores de inflamación; PCR: proteina C
reactiva; SAA: suero amiloide A; IL-6: interleucina 6; IL-8:
interleucina 8; TNFα: factor de necrosis tumoral α; sTNFα-R:
receptor soluble del TNFα
[12]
respectivamente (Tabla X).
La bondad del ajuste para el modelo obtenido se calculó a
Tabla X: Análisis de regresión logística multivariante para la presencia
de placa en pacientes transplantados renales.
OR
PLACA
I.C [95%] p
PCR (p75: 9,01 mg/L) 5,92 1,61-21,77 0,007*
IL-8 (p75: 20,75 ng/L) 3,93 1,04-14,87 0,043*
sTNFα-R (p75: 43,04 ng/mL) 5,49 1,57-19,14 0,008*
OR: Odds ratio; I.C: intervalo de confianza; PCR: proteina C reactiva;
IL-8: Interleucina 8; sR-TNFα: receptor soluble del factor de necrosis
tumoral.
partir de la prueba de Hosmer y Lemeshow obteniendo un
estadístico del Chi-cuadrado de 5,35 (p=0,719).
En resumen, PCR, IL-8 y sTNFα-R preTR son buenos
marcadores predictores de presencia de placa en el
transplante inmediato, mientras que el TNFα es un marcador
de riesgo independiente para un GIM >0,77 mm.
Inflamación y Función Renal
Al año de recibir el transplante renal los pacientes
presentaron un MDRD de 45,87 ± 15,48 mL/min. El 15,8% de
los pacientes presentaban un MDRD inferior a 30 mL/min, el
69% entre 30-60 mL/min y tan solo el 15,2% presentaban un
MDRD superior a 60 mL/min.
En la figura 7 se muestra una clasificación de los pacientes
estudiados en función al grupo de edad que pertenecen y el
Figura 7: Clasificación de pacientes según el MDRD al año en relación
con los cuartiles de edad.
MDRD: fórmula del estudio Modification of diet in renal disease

MDRD que presentan al año de recibir el transplante. Se
puede observar como entre los pacientes más jóvenes
predomina una función renal superior a 60 mL/min, sin
encontrarse ningún paciente con un FG inferior a 30mL/min.
Sin embargo en el cuartil de mayor edad, la mayoría de
pacientes presenta un FG inferior a 30 mL/min.
Las concentraciones de los MIF estudiados previo al
transplante, a los tres meses y la ratio calculada de cada uno
se muestran en la tabla XI. Se puede observar como tras el TR
Tabla XI: Concentraciones previas al transplante, a los 3 meses del
mismo y las ratios de cada marcador inflamatorio estudiado.
El cálculo del p-valor se realizó con la prueba estadística T-test de
Student en caso de distribución normal y con el test U de Mann-Whitney
en caso contrario.
MIF PreTR postTR
(3 meses)
p Ratio
(3meses/
preTR)
PCR (mg/L)
Mediana
Rango (p25-p75)
IL-6 (ng/L)
4,21
1,42-9,01
3,45
1,31-10,27
0,482
0,863
0,347-3,03
Mediana
Rango (p25-p75)
IL-8 (ng/L)
5,00
3,30-7,62
4,65
3,10-7,17
0,918
0,95
0,62-1,68
Mediana
Rango (p25-p75)
TNF-α (ng/L)
13,69
8,51-20,75
12,01
7,86-21,08
0,420
0,91
0,53-1,83
Mediana
Rango (p25-p75)
staffα-R (ng/mL)
12,30
10,10-17,10
10,40
8,18-13,77

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Tabla XIII: Análisis de regresión logística univariante de factores de
riesgo para un MDRD < 30mL/min al año del transplante.
OR
MDRD < 30 mL/min
I.C [95%] p
Edad (años) 1,02 0,97-1,07 0,394
Sexo (Hombre) 2,17 0,70-6,67 0,177
ÍMC (Kg/m2) 1,02 0,88-1,18 0,803
Edad donante 1,01 0,97-1,05 0,598
Tipo de diálisi (DP) 1,13 0,32-3,97 0,850
Meses en diálisis 1,01 0,98-1,02 0,952
Isquemia fría (horas) 1,06 0,93-1,19 0,380
DM preTR (Si)
MIF:
3,50 0,99-12,36 0,052*
PCR ratio 1,21 1,05-1,40 0,009*
SAA ratio 1,065 0,99-1,142 0,073
IL-6 ratio 1,27 0,89-1,81 0,178
IL-8 ratio 1,04 0,90- 1,21 0,586
TNF-α ratio 3,90 1,13-13,50 0,032*
MDRD: fórmula del estudio Modification of diet in renal disease;
PCR: proteina C reactiva; IMC: índice de masa corporal; DP: diálisis
peritoneal; DM: Diabetes Mellitus. TR: trasplante renal; MIF:
marcadores de inflamación; PCR: proteina C reactiva; SAA: suero
amiloide A; IL-6: interleucina 6; IL-8: interleucina 8; TNFα: factor
de necrosis tumoral α; sTNFα-R: receptor soluble del TNFα
N/v: no valorable, debido al estrecho intervalo que muestra el ratio del
sR-TNFα.
*: significación estadística.
Tabla XIV: Modelo final del análisis de regresión logística multivariante
para un MDRD < 30 mL/min.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
El presente trabajo demuestra que la inflamación, medida a
partir de determinados biomarcadores, es uno de los
principales factores de riesgo para la aparición de placa, un
incremento del GIM y para un deterioro de la función renal
en los pacientes trasplantados. Este hecho, podría explicar el
aumento de episodios cardiovasculares en pacientes
transplantados renales.
Los resultados obtenidos muestran como la edad contribuye a
[14]
MDRD < 30 mL/min
OR I.C [95%] p
Ratio PCR 1,20 1,01-1,43 0,022*
Ratio TNFα 3,44 0,89-13,36 0,074
MDRD: fórmula del estudio Modification of diet in renal disease; OR:
Odds ratio; I.C: intervalo de confianza; PCR: proteina C reactiva;
TNFα: factor de necrosis tumoral α.
un incremento del estado inflamatorio en nuestra población
estudiada, correlacionándose con la PCR, el SAA y la IL-6. Es
conocido que la edad se correlaciona claramente con un
incremento del GIM así como con la aparición de placa de
ateroma. Nuestros resultados corroboran este hecho y
demuestran una vez más que los pacientes con presencia de
placa y/o un GIM aumentado son de mayor edad.
En la población estudiada cabe resaltar dos características
importantes; el elevado porcentaje de pacientes con presencia
de placa, 49,5 % y que el 41,9% de los transplantados
estudiados tienen un GIM superior al considerado como
patológico en la población catalana general (40). La
determinación de estos dos parámetros es útil en el cribado
de la aterosclerosis asintomática (subclínica o preclínica) ya
que tanto la presencia de placa como un incremento en el
GIM se han descrito como factores de riesgo predictores tanto
de enfermedad como de mortalidad cardiovascular en
pacientes con IRC, en diálisis (tanto HD como DP) y en
transplantados renales (24). Existen varias técnicas para
determinar la presencia de placa y el GIM, en nuestro estudio
estos dos parámetros se han determinado mediante
ultrasonografía carotídea. Se trata de una técnica de imagen
de alta resolución, no invasiva y cuya buena reproducibilidad
hace que sea el método de elección para evaluar la presencia y
extensión de aterosclerosis subclínica (19, 20). Su utilidad
como marcador independiente de enfermedad cardiovascular
ha sido ampliamente demostrada, aportando una información
pronostica importante en el seguimiento de la lesión
aterosclerótica para prevenir futuros episodios
cardiovasculares (41, 42).
Se han descrito varios marcadores para explicar la relación de
la inflamación con el inicio y progresión de la aterosclerosis,
siendo la PCR la más ampliamente estudiada y mejor descrita.
De esta manera, incrementos de la PCR se han asociado tanto
a un aumento del GIM (34, 43, 44) como a la existencia de
placa (34, 43, 45). Además de la PCR, la IL-6 también se ha
asociado con un incremento del GIM en pacientes en
hemodiálisis (46). En este sentido, es importante resaltar la
implicación que tiene la inflamación en el aumento del GIM y
en la aparición de la placa ateromatosa. Los resultados
obtenidos exponen que existe una relación entre la
inflamación y la aterosclerosis subclínica y que dicha relación
podría explicarse a partir de determinados marcadores
inflamatorios como tales como la PCR, el TNFα o la IL-8.
Inflamación-GIM
En relación con el grosor de la íntima-media, es conocido
como se ha comentado anteriormente que la edad es un factor
importante en el aumento del GIM. En el presente trabajo se
obtiene que por cada año que aumentados de edad, existe 1,14
veces más riesgo de presentar un GIM por encima de 0,77mm.
En nuestra población estudiada, el aumento del GIM no

estaría definido únicamente por la edad, sino que la
inflamación en los pacientes trasplantados también jugaría
un papel importante. Los resultados obtenidos demuestran
una elevación de la inflamación de acuerdo con un
incremento del GIM, y en este sentido se obtiene que el TNFα,
una citocina proinflamatoria, sería junto con la edad un
marcador independiente para un GIM superior a 0,77mm.
Los resultados obtenidos están relacionados con los descritos
en la bibliografía, que describen al TNFα como predictor
independiente de eventos cardiovasculares (34).
Inflamación-Placa
Referente a la placa, se obtiene que PCR, IL-8 y sTNFα-R son
factores predictores para la presencia de placa ateromatosa en
pacientes con ERC que reciben un transplante. La relación
entre la inflamación y la presencia de placa está ampliamente
documentada en la bibliografía, como se ha comentado
anteriormente la PCR es el más descrito (34, 43, 45), aunque
también se han propuesto la IL-6 (46, 47) o el TNFα (34)
como factores independientes de presencia de placa.
La PCR es conocida como el prototipo de reactante de fase
aguda, su síntesis en los hepatocitos está regulada mediante
citocinas inflamatorias como la IL-6 o el TNFα. Varios
estudios evidencian que una acumulación en la PCR puede
contribuir directamente sobre la patogénesis de la
aterosclerosis y sobre sus implicaciones clínicas a partir de
varios mecanismos como una activación del sistema del
complemento, acumulación de lipoproteínas LDL y VLDL o la
activación del factor tisular (48).
En el presente trabajo se obtiene que la PCR es un importante
marcador de presencia de placa, aumentando 6 veces el
riesgo de aparición de placa en aquellos pacientes con una
concentración, previa al transplante, superior a 9,01 mg/L.
Dicha concentración no es difícil de conseguir ya que la
mayoría de pacientes presentan un estado inflamatorio
crónico previo al transplante renal. Varios estudios han
descrito a la PCR como un buen predictor de enfermedad y de
mortalidad cardiovascular, tanto en individuos sanos (30,
49-51) como en pacientes con IRC, en HD y transplantados
renales (52, 53).
Por otra parte, nuestros resultados describen por primera vez
a la IL-8 y al sTNFα-R como marcadores relacionados con la
existencia de placa en el TR. La IL-8 es una citocina
proinflamatoria con múltiples funciones, de las que destaca
su papel quimiotáctico en el inicio de la patogénesis en la
aterosclerosis (54). Está presente en la inflamación aguda y
promueve la proliferación de células del endotelio vascular así
como su migración, además también participa en la
quimiotaxis y adhesión de monocitos en células endoteliales
(55). Las células espumosas derivadas de macrófagos
contienen grandes cantidades de IL-8, la cual puede aumentar
la inestabilidad de la placa aterosclerótica incrementando así
el riesgo de episodios cardiovasculares (56). Se han
encontrados niveles incrementados de IL-8 en lesiones
ateroscleróticas de arterias carotideas (57). Estos datos
sugieren que la IL-8 tiene un importante papel tanto en el
inicio como en la progresión de la enfermedad aterosclerótica.
En relación a los pacientes con ERC o en diálisis existen pocos
estudios que relacionen a la IL-8 con la enfermedad
aterosclerótica, Panichi et al (58) en un estudio con pacientes
en diálisis obtiene que la IL-8 es un fuerte predictor
independiente de eventos cardiovasculares.
Por su parte, el receptor soluble del TNFalfa (sTNFα-R) es
una citocina que se secreta en respuesta a un incremento del
TNFα, presenta unos niveles más elevados y estables que su
ligando siendo más fácil su monitorización. Niveles séricos de
TNFα se encuentra incrementado en pacientes con ERC, en
HD y transplantados renales (59, 60) y se piensa juegan un
papel importante en la inmunocompetencia del transplante.
Algunos estudios lo consideran un marcador útil en el
diagnóstico y pronóstico en el rechazo del injerto (61). Datos
experimentales exponen que el receptor del TNFα contribuye
a la patogénesis de la aterosclerosis (62). Actúa aumentando la
expresión de quimiocinas y moléculas de adhesión además de
incrementar la proliferación y migración de células del
endotelio vascular. Elkins et al (63) por su parte encuentran
en individuos asintomáticos una asociación entre el sTNFα-R
y la aterosclerosis carotidea. Estos datos coinciden con los
obtenidos en nuestro trabajo.
En nuestro conocimiento no se había descrito anteriormente
a la IL-8 ni al sTNFα-R como marcadores predictores de la
existencia de placa en pacientes transplantados. Nuestros
resultados obtenidos concluyen que tanto en el análisis
univariante como en el multivariante, la IL-8 y el sTNFα-R
además de la PCR, son marcadores independientes de la
aparición de placa. De esta manera aquellos pacientes que
previo al transplante tengan valores incrementados por
encima del p75 de la IL-8 y el sRTNFα tendrán
respectivamente 4 y 5 veces más riesgo de presentar placa de
ateroma.
Evolución de la Inflamación y Función Renal
En el presente trabajo la valoración de la evolución del estado
inflamatorio se realiza mediante la ratio de los marcadores
inflamatorios analizados. Una ratio de un MIF inferior a 1
indicaría una mejoría del estado inflamatorio a los 3 meses
del transplante, mientras que una ratio superior a 1
representaría que la inflamación en el paciente se ha
incrementado y que sus consecuencias en relación a la
aparición de episodios cardiovasculares, rechazo crónico y
empeoramiento de la función renal podrían estar
incrementadas. De esta manera, se propone la ratio de los
MIF como un marcador inflamatorio predictor de futuras
complicaciones en el paciente transplantado.
[15]

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No existe bibliografía referente a la ratio de biomarcadores
inflamatorios como marcadores que reflejen la evolución del
estado inflamatorio ni como factores de riesgo para
complicaciones a largo termino. Únicamente Mehta et al en
un estudio con pacientes transplantados expone que una ratio
del receptor soluble de la interleucina-2 (sRIL-2) superior a
0,6 puede predecir el rechazo del injerto (64). Nuestros
resultados exponen que niveles individuales de los MIF
estudiados, tanto pre-TR como a los 3 meses, no predicen la
función renal del paciente al año del transplante, mientras
que la ratio de la PCR si es un buen marcador predictor de la
FG al año del transplante. No obstante, concentraciones
elevadas de algunos MIF a los 3 meses posTR si se
correlacionan con el FG a ese mismo tiempo, debido
probablemente a su eliminación por vía renal. De ahí que sea
de interés conocer si la variación temporal de determinados
marcadores inflamatorios puede ayudar a prevenir posibles
complicaciones a largo plazo en pacientes transplantados.
Esta descrito que la PCR está independientemente asociada
con una disminución de la filtración glomerular (65). En
nuestros resultados obtenemos que la ratio de la PCR es un
buen marcador de evolución de la inflamación y que, tanto en
el análisis univariante como en el multivariante, es un
marcador independiente de riesgo para un FG inferior a 30
mL/min. Por cada punto que aumente la ratio de la PCR, se
incrementa 1,2 veces el riesgo de presentar, al año del
transplante, un FG inferior a 30 mL/min.
En resumen, la medición de la evolución de la PCR en una
fase temprana postransplante (3meses), podría demostrar
estados inflamatorios subclínicos que reflejen la inflamación
vascular con la consiguiente afectación renal a largo plazo
(año).
Conclusiones
Los resultados obtenidos en el presente trabajo ponen de
manifiesto dos puntos importantes: el incremento del estado
inflamatorio que presentan los pacientes transplantados
renales y la relación que existe entre la inflamación y la
prevalencia de factores de riesgo cardiovasculares como son
la presencia de placa, un GIM aumentado y deterioro de la
función renal.
PCR, IL-8 y sRTNFα son marcadores de riesgo independiente
para la presencia de placa, mientras que el TNFα lo es para un
incremento del GIM, ambos determinados por
ultrasonografía carotídea.
La evaluación de estos marcadores inflamatorios reflejan un
estado de aterosclerosis subclínica y su determinación puede
servir de ayuda para estratificar el riesgo cardiovascular en
pacientes con ERC que han sido transplantados.
Por otra parte, una desfavorable evolución del estado
inflamatorio en el posTR inmediato (3meses), medido a partir
de un marcador de progresión inflamatoria, la “ratio”, está
[16]
asociada a una peor función renal al año de recibir el TR. La
ratio de la PCR constituiría un marcador importante en la
evolución de la inflamación y un predictor independiente
para el deterioro de la función renal al año del transplante,
pudiéndose utilizar en la prevención del fallo renal
postransplante.
BIBLIOGRAFÍA
1. Ojo AO. Cardiovascular complications after renal transplantation and their
prevention. Transplantation 2006; 82:603.
2. Foley RN, Parfrey PS, Sarnak MJ. Epidemiology of cardiovascular disease in
chronic renal disease. J Am Soc Nephrol 1998; 9(sup 12):S16
3. Foley RN, Murray AM, Li S, Herzog CA, McBean M, Eggers PW, Collins AJ.
Chronic disease, renal replacement, and death in the United States Medicare
population, 1998 to 1999. J Am Soc Nephrol 2005;16:489-495.
4. Weiner DE, Tighiouart H, Amin MG, Stara PC, MacLeod B, Griffith JL, Salem
DN, Levey AS, Sarnak MJ. Chronic Kidney Disease as a Risk Factor for
Cardiovascular Disease and All-Cause Mortality: A Pooled Analysis of
Community-Based Studies. J Am Soc Nephrol 2004; 15(5):1307-15.
5. Chobanian AV, Bakris GL, Black HR, Cushman WC, Green LA, et al. The
seventh report of the joint national committee on prevention, detection,
evaluation, and treatment of high blood pressure. JAMA 2003;289:2560-2571.
6. Culleton BF, Larson MG, Wilson PWF, Evans JC, Parfrey PS, and Levy D.
Cardiovascular disease and mortality in a community-based cohort with mild
renal insufficiency. Kidney Int 1999;56:2114-2219.
7. Meier-Kriesche HU, Baliga R, Kaplan B. Decreased renal function is a strong
risk factor for cardiovascular death after renl transplantation. Transplantation
2003; 75(8):1291.
8. Manjunath G, Tighiouart H, Ibrahim H, MacLeod B, Salem DN, Griffith JL,
Coresh J, Levey AS, Sarnak MJ. Level of kidney function as a risk factor for
atherosclerotic cardiovascular outcomes in the community. JACC 2003;41(1):47-
55.
9. Henry RMA, Kostense PJ, Bos G, Dekker JM, Nijpels G, Heine RJ and et al.
Mild renal insufficiency is associated with increased cardiovacular mortality: the
Hoorn study. Kidney int 2002;62:1402-1407.
10. Wolfe RA, Ashby VB, Milford EL, et al. Comparison of mortality in all
patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients
of a first cadaveric transplant. N Engl J Med 1999; 341:1725
11. Evans RW, Manninen DL, Garrison LP, Hart LG, Blagg CR, Gutman RA,
Hull AR, Lowrie EG. The quality of life of patients with end-stage renal disease.
N Engl J Med. 1985;312(9):553-9.
12. Laupacis A, Keown P, Pus N, Krueger H, Ferguson B, Wong, Muirhead N. A
study of the quality of live and cost-utility of renal transplantation. Kidney Int.
1996;50(1):235-42.
13. Port FK, Wolfe RA, Mauger EA, Berling DP, Jiang K. Comparison of survival
probabilities for dialysis patients vs cadaveric renal transplant recipients. JAMA
1993;270:1339.
14. Smilde TJ, Wollersheim H, Van Langen H, Stalenhoef AF. Reproducibility of
ultrasonographic measuraments of different carotid and femoral artery segments
in healthly subjects and in patients with increased intima-media thickness. Clin
Sci. 1997;93:317-24.
15. Srámek A, Bosch JG, Reiber JH, Van Oostayen JA, Rosendaal FR. Ultrasod
assessment of atherosclerotic vessel wall changes: reproducibility of intimamedia
thickness measurements in carotid and femoral arteries. Invest Radiol.
2000;35(12):699-706.
16. O´Leary DH, Polak JF, Kronmal RA, Manolio TA, Burke GL, Wolfson SK for
the cardiovascular health study collaborative research group. Carotid-artery
intima and media thickness as a risk factor for miocardialinfarction and stroke
in older adults. N Engl J Med 1999; 340:14
17. Hollander M, Bots ML, del Sol AI, et al: Carotid plaques increase the risk of
stroke and subtypes of cerebral infarction in asymptomatic elderly: The
Rotterdam Study. Circulation 2002;105:2872-2877.
18. Ebrahim S, Papacosta O, Winchup P, et al. Carotid plaque, intima-media
thickness, cardiovascular risk factor, and prevalent cardiovascular disease in

men and women. The British Regional Heart Study. Stroke 1999; 30:841-850.
19. Schwaiger JP, Lamina C, Neyer U, et al. Carotid plaques and their predictive
value for cardiovascular disease and all-cause mortality in hemodialysis patients
considering renal transplantation: a decade follow-up. Am J Kidney Dis 2006;
47:888.
20. Ross R. Atherosclerosis: an inflammatory disease. N Engl J Med 1999;
340:115.
21. Libby P, Ridker PM, Maseri A. Inflammation and aterosclerosis. Circulation
2002;105:1135-1143.
22. Szmitko PE, Wang CH, Weisel RD, de Almeida JR, Anderson TJ, Verma S.
New markers of inflammation and endotelial cell activation. Circulation
2003;108(16):1917-1923.
23. Szmitko PE, Wang CH, Weisel RD, Jeffries GA, Anderson TJ, Verma S.
Biomarkers of vascular disease linking inflammation to endothelial activation.
Circulation 2003;108(17):2041-2048.
24. Verma S, Buchanan MR, Anderson TJ. Endothelial function testing as a
biomarker of vascular disease. Circulation 2003;108(17):2054-9.
25. Roberts MA, Hare DL, Ratnaike S, Ierino FL. Cardiovascular biomarkers in
CKD: Pathophisiology and implications for clinical management of cardiac
disease Am J Kidney Dis 2006; 48:341
26. Knight EL, Rimm EB, Pai JK, Rexrode KM, et al. Kidney dysfunction,
inflammation, and coronary events: a prospective study. J Am Soc Nephrol
2004;15:1897-1903.
27. Liuzzo G, Biasucci LM, Gallimore JR, Grillo RL, Rebuzzi AG, Pepys MB, and
Attilio. The prognostic Value of C-Reactive Protein and Serum Amyloid A
Protein in Severe Unstable Angina. N Eng J Med 1994;331(7):417-22.
28. Bermudez EA, Rifai N, Buring J, et al. Interrelationships among circulating
interleukin-6, C- reactive protein , and traditional cardiovascular risk factors in
women. Arteroscler Thromb Vasc Biol. 2002; 22:1668-1673.
29. Francisco G, Hernández C, Simó R. Serum markers of vascular inflammation
in dyslipemia. Clin Chim Acta 2006;369:1-16.
30. Ridker PM, Buring JE, Cook NR, Rifai N. C-Reactive protein, the metabolic
syndrome, and risk of incident cardiovascular events: an 8-year follow-up of
14719 initially healthy American women. Circulation 2003; 107: 391.
31. Shlipak MG, Fried LF, Cushman M, et al. Cardiovascular mortality risk in
chronic kidney disease: comparison of traditional and novel risk factors. JAMA
2005;293:1737-1743.
32. Panichi V, Maggiore U, Taccola D, et al. Interleukin-6 is a stronger predictor
of total and cardiovascular mortality than C-reactive protein in haemodialysis
patients. Nephrol DialTransplant 2004; 19: 1154-1160.
33. Rao M, Guo D, Perianayagam MC, et al. Plasma interleukin-6 predicts
cardiovascular mortality in haemodialysis patients. Am J Kidney Dis 2005; 45:
324-333.
34. Stevinkeln P, Heimburger O, Paultre F, et al: Strong associaciation between
malnutition, inflamation and atherosclerosis in chronic renal failure. Kidney Int
1999; 55:1899-1911.
35. Schillinger M, Exner M, Mlekusch W et al Imflammation and carotid artery-
Risk for atherosclerosis study (ICARAS). Circulation 2005; 111:2203.
36. Levey AS, Bosch JP, Lewis JB, Greene T, Rogers N, Roth D: A more accurate
method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: A new
prediction equation. Modification of Diet in Renal Disease Study Group. Ann
Intern Med 1999; 130:461-470.
37. Levey AS, Greene T, Kusek JW, Beck GJ: A simplified equation to predict
glomerular filtration rate from serum creatinine. J Am Soc Nephrol 2000;
11:A0828.
38. Clinical practice guidelines for chronic kidney disease: evaluation,
classification and stratification. Am J Kidney Dis 2002;39 Suppl 1:S17-31.
39. Lemeshow S, Hosmer DW Jr: A review of goodness of fit statístics for use in
development of logistic regression models. Am J Epidemiol 1982;115:92-106.
40. Junyent M, Gilabert R, Nuñez I et al. Ecografia carotidea en la evaluacion de
aterosclerosia preclinica. Distribución de valores del grosor intima-media y
frecuencia de placas de ateroma en una cohorte comunitaria española. Med Clin
(Barc). 2005; 125:770
41. Naghavi M, Falk E, Hecht HS, et al. From vulnerable plaque to vulnerable
patient- Part III: executive summary of the screening for heart attack prevention
and education (SHAPE) task force report. Am J Cardiol 2006; 98(2A):2H-15H.
42. Hodis HN, Mack WJ, Laurie L, Selzer RH, Liu C, LiuC, Azen SP. The role of
carotid arterial intima-media thickness in predicting clinical coronary events.
Ann Intern Med 1998;128(4):262-9.
43. Blackburn R, Giral Ph, Bruckert E, et al. Elevated C-reactive protein
constitutes an independent predictor of advanced carotid plaques in dyslipidemic
subjects. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:1962.
44. Cao JJ, Thach C, Manolio TA, et al. C-reactive protein, carotid intima-media
thickness, and incidence of ischemia stroke in the elderly: The cardiovascular
health study. Circulation 2003; 108:166-170.
45. CREDD (Cardiovascular Risk Extended Evaluation in Dialysis Patients)
Investigators: C-reactive protein and atherosclerosis in dialysis patients. Nephrol
Dial Transplant 1998;13:2710-2711.
46. Kato A, Odamaki M, Takita T, Maruyama Y, Kumagai H, Hishida A.
Association between interleukin-6 and carotid atherosclerosis in hemodialysis
patients. Kidney Int 2002;61(3):1143-52.
47. Yamagami H, Kitagawa K, Nagai Y, Hougaku H, Sakaguchi M, Kuwabara K,
Kondo K, Masuyama T, Matsumoto M, Hori M. Higher levels of interleukin-6 are
associated with lower echogenicity of carotid artery plaques. Stroke
2004;35(3):677-81.
48. Arici M, Walls J. End-stage renal disease, atherosclerosis, and cardiovascular
mortality: is C-reactive protein the missing link? Kidney Int 2001; 59:407.
49. Danesh J, Wheeler JG, Hirschfield GM, et al. C-reactive protein and other
circulating markers of inflammation in the prediction of coronary heart disease.
N Engl J Med 2004;350:1387-1397.
50. Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, Tracy RP, Hennekens ChH.
Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently
healthy men. N Engl J Med 1997; 336:973.
51. Willerson JT, Ridker PM. Inflammation as a cardiovascular risk factor.
Circulation 2004; 109:2
52. Zimmermann J, Herrlinger S, Pruy A, et al. Inflammation enhaces
cardiovascular risk and mortality in hemodialysis patients. Kidney Int
1999;55:648-658.
53. Yeun JY, Levine RA, Mantadilok V, et al. C-reactive protein predicts all-cause
and cardiovascular mortality in hemodialysis patients. Am J Kidney
2000;35:469-476.
54. Boisvert WA. Modulation of atherosclerosis by chemokines. Trends
Cardiovasc Med. 2004;14(4):161-165.
55. Kobashi C, Urakaze M, Kishida M, Kibayashi E, Kobayashi H, et al.
Adiponectin inhibits endothelial synthesis of interleukin-8. Circ Res
2005;97:1245-1252.
56. Apostolopoulos J, Davenport P, Tipping PG. Interleukin-8 production by
macrophages from atheromatous plaques. Arterioscl Thromb Vasc Biol
1996;16:1007-1012.
57. Simonini A, Moscucci M, Muller DWM et al. IL-8 is an angiogenic factor in
human coronary atherectomy tissue. Circulation 2000; 101:1519
58. Panichi V, Taccola D, Rizza GM et al. Interleukin-8 is a powerful prognostic
predictor of all-cause and cardiovascular mortality in dialytic patients. Nephron
Clin Pract 2006; 102:c51.
59. Halwachs G, Tiran A, Reisinger EC, Zach R, Sabin K, et al. Serum levels of the
soluble receptor for tumour necrosis factor in patients with renal disease. Clin
Investig 1994; 72(6):473-6.
60. Van Riemsdijk-van Overbeeke IC, Baan CC, Hesse CJ, Loonen EH, Niesters
HG, et al. TNF-alpha: mRNA, plasma protein levels and soluble receptor in
patients on chronic hemodialysis, on CAPD and with end-stage renal failure.
Clin Nephrol 2000;53(2):115-23.
61. Keil M, Peck MK, Schenn G, Grünberger T, Kramer G, Függer R, et al. Value
of serum soluble tumour necrosis factor concentrations in the diagnosis and
prognosis of renal graft rejection. Nephrol Dial Transpant 1994;9(7):815-9.
62. Zhang L, Peppel K, Sivashanmugam P, Orman ES, Brian L, Exum ST,
Freedman NJ. Expression of tumor necrosis factor receptor-1 in arterial wall
cells promotes atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007;27(5):1087-
94.
63. Elkind MS, Cheng J, Boden-Albala B, Rundek T, Thomas J, Chen H, Rabbani
LE, Sacco RL. Tumor necrosis factor receptor levels are associated with carotid
atherosclerosis. Stroke 2002;33(1):37-8.
64. Mehta R, Shah G, Adler W, Kittur D. Soluble interleukin 2 receptor (sIL-2R)
levels in renal transplant recipients. Clin Transplant 2004;18(S12):67-71.
65. Stuveling EM, Hillege HL, Bakker JLS, Gans OBR, de Jong PE, de Zeeuw D.
C-reactive protein is associated with renal function abnormailities in a nondiabetic
population. Kidney Int 2003;63:654-661.
[17]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
Incorporación de la técnica
de reacción en cadena de
la polimerasa a tiempo real
para el diagnóstico de la
tuberculosis
ESTHER CLAPéS SáNCHEZ
Laboratori de análisis clínicos,
Hospital Universitario Dr. Josep
Trueta, Gerona.
[18]

INTRODUCCIÓN
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa de distribución
mundial producida por Mycobacterium tuberculosis. Debe su
nombre a la formación de nódulos (tubérculos) en los tejidos
que afecta. Se estima que un 19-43% de la población ha sido
infectada por M. tuberculosis y que todos los años se
producen más de 8 millones de casos nuevos (1).
El género Mycobacterium consta de más de 100 especies de
bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) aerobios, no
esporulados, no capsulados. Clásicamente se han agrupado en
virtud de su velocidad de crecimiento (lento, mayor de una
semana, y rápido, menor de una semana) y de la producción o
no de pigmentos cuando son expuestos a la luz
(fotocromógenos, producen pigmento en presencia de luz;
escotocromógenos, producen pigmento en ausencia de luz; y
no cromógenos). El complejo Mycobacterium tuberculosis está
formado por M.tuberculosis, M. Boris, M. africanum y M.
microti y se incluye dentro del grupo de no cromógenos de
crecimiento lento (2). El desarrollo de estudios de genotipado
ha modificado algunos grupos y diferenciado nuevas especies
(3 y 4). Una clasificación sucinta de las micobacterias más
frecuentes en humanos se recoge en la tabla I.
Las micobacterias no pertenecientes al complejo M.
tuberculosis, productoras de procesos infecciosos
denominados globalmente micobacteriosis, han recibido
distintos nombres a lo largo del tiempo con mayor o menor
fortuna: micobacterias atípicas (con características diferentes
de la especie “típica”, M. tuberculosis), MOTT (Micobacteria
other than tubercule bacilli), micobaterias oportunistas,
micobacterias no tuberculosas, micobacterias ambientales,
etc. que se utilizan indistintamente (5).
En este trabajo me centraré exclusivamente en el diagnóstico
de la enfermedad infecciosa causada por M.tuberculosis.
a. Morfología, estructura y composición
M. tuberculosis suele tener una forma ligeramente curvada,
de 1-4 micras de largo. Se caracteriza por poseer una pared
gruesa formada por varias capas de glicopéptidos, polímeros
de arabinosa y galactosa, ácidos micólicos y lípidos. Esta
estructura le conferiría la capacidad de resistir la acción
decolorante de ácidos y alcoholes una vez teñida.
b. Patogenia y manifestaciones clínicas
El contagio se produce habitualmente por vía aérea a partir de
pacientes con lesiones pulmonares abiertas al exterior por un
bronquio de drenaje. Los bacilos expulsados con la tos pueden
ser aspirados por otras personas, llegando hasta los alvéolos y
desencadenando la primoinfección. La transmisión digestiva
de M.bovis procedente de vacas enfermas ha desaparecido
prácticamente gracias a la pasteurización sistemática de la
Tabla I. Clasificación de las micobacterias más frecuentemente aisladas
en muestras clínicas.
Crecimiento Producción de
pigmento
Lento
(mayor de
1 semana)
Rápido
(menor de
1 semana)
Foto-
cromógenas
Escoto-
cromógenas
No
cromógenas
No
cromógenas
Especie
M. asiaticum
M. kansasii
M. marinum
M. simiae
M. flavescens
M. gordonae
M. scrofulaceum
M. szulgai
M. xenopi
M. avium complex
(M. avium y M. intracellulare)
M. gastri
M. genavense
M. haemophilum
M. malmoense
M. nonchromogenicum
M. shimoidei
M. térrea
M. triviale
M. tuberculosis complex
(M. africanum, M. bovis,
M. tuberculosis y M. microti)
M. ulcerans
M. fortuitum complex
(M. fortuitum, M. mageritense,
M. mucogenicum, M. peregrinum
y M. septicum)
M. chelonae-abscessus complex
(M. chelonae, M.abscessus y
M. immunogenum)
M. smegmatis complex
(M. smegmatis, M. goodii y
M. wolinskyi)
leche (6).
En la mayoría de ocasiones, los escasos bacilos que llegan
hasta los alvéolos son fagocitados y destruidos por los
macrófagos; sólo un pequeño porcentaje de las personas
infectadas (aproximadamente el 10%) llegará a desarrollar la
enfermedad; la mitad de ellas a los pocos meses de la
infección, mientras que la otra mitad necesitará de un largo
periodo, a veces de años, para que se produzca la reactuación
de lesiones aparentemente curadas que albergan en su interior
[19]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
micobacterias.
La llegada de M. tuberculosis a los alvéolos desencadena una
serie de procesos de respuesta tisular e inmunológica. En las
2-10 semanas posteriores a la infección se produce una
respuesta inmunológica celular desencadenada por los
antígenos de la membrana y del citoplasma de las
micobacterias. Linfocitos, macrófagos, células epiteloides y
células gigantes de Langhans rodean a las micobacterias
creando el característico granuloma tuberculoso, que al cabo
de un tiempo se reblandece en su centro y deja un núcleo de
necrosis caseosa (6).
En la mayoría de los casos se controla completamente la
infección, reabsorbiéndose el granuloma y quedando una
pequeña cicatriz fibrosa que suele calcificarse. Si el proceso
no continúa, se habrá producido una infección sin
enfermedad, con una reacción positiva a la prueba de la
tuberculina. En un 5% de los casos se producirá una
enfermedad activa, con síntomas clínicos, signos radiológicos
y aislamiento de las micobacterias (6).
En otro 5% de los casos se producirá una tuberculosis
secundaria, habitualmente debida a una alteración
inmunitaria (malnutrición, administración de fármacos
immunosupresores, diabetes, infección por VIH…) que
permite la reactivación de micobacterias latentes (1).
Esporádicamente, sobre todo en países con alta endemicidad,
se puede producir una reinfección exógena (6).
La primoinfección, más frecuente en niños y jóvenes, puede
ser asintomática o con síntomas leves de infección
respiratoria, o presentar un cuadro más llamativo con
afectación del estado general, fiebre, hemoptisis, eritema
nodoso, alteraciones extrapulmonares, etc. En la mayor parte
de los casos cura espontáneamente, dejando evidencias
radiográficas y positividad de la prueba de Mantoux. Más
raramente puede seguir un curso progresivo, con aparición de
infiltrados pulmonares y cavitación, y diseminación
broncógena y/o hematógena (con localizaciones en pleura,
meninges, hígado, riñón, peritoneo, sistema osteoarticular).
La tuberculosis secundaria se suele localizar inicialmente en
el pulmón, en forma de infiltrado o nódulos que tienden a
caseificarse y drenarse a través de un bronquio produciéndose
una caverna. Con menos frecuencia la tuberculosis comienza
como una neumonía aguda. Las adenopatías mediastínicas
pueden comprimir a los bronquios ocasionando atelectasias.
Las formas extrapulmonares (más frecuentes en los infectados
por VIH) pueden afectar al riñón, sistema osteoarticular,
pericardio, sistema nervioso central, peritoneo, piel…,
variando los síntomas en función de la localización y de la
progresión de la enfermedad (1,6).
c. Diagnóstico de laboratorio
C.1. INFECCIÓN
La infección por M.tuberculosis se detecta estudiando la
[20]
respuesta de hipersensibilidad retardada frente a antígenos
específicos del bacilo. Actualmente, se utiliza un derivado
proteico purificado (PPD RT-23 en España). La técnica más
usada es la intradermorreacción de Mantoux, en la que se
inyectan 2 U de PPD RT-23 en la cara anterior del antebrazo,
por vía intradérmica. A las 48-72 horas se mide la zona de
induración, considerándose positivas todas las induraciones >
5 mm en personas no vacunadas.
La especificidad de la prueba esta condicionada por
exposición previa a otras micobacterias o a la vacuna con
Bacilo de Calmette-Guérin, ya que los antígenos presentes en
PPD son comunes con otras micobacterias. La sensibilidad de
la prueba esta condicionada por una buena técnica de
realización y lectura, y esta requiere que se vea al paciente
48-72 horas después de la administración.
Recientemente se han desarrollado métodos de
inmunodiagnóstico para cuantificar esta respuesta
inmunitaria, estimulando a los linfocitos con antígenos de las
micobacterias y determinando in vitro la liberación de
interferón-γ (7). La técnica alcanza un rendimiento mejor al
sustituir el PPD por antígenos más específicos de M.
tuberculosis, como el early secretory antigen target-6 (ESAT-
6) y la culture filtrate protein 10 (CFP-10), ausentes en la
vacuna antituberculosa y en micobacterias no tuberculosas
(8).
C.2. ENFERMEDAD
El diagnóstico de la tuberculosis se ha basado clásicamente en
la observación microscópica tras tinción de las muestras y su
cultivo (1). Desde hace una quincena de años se están
desarrollando métodos de biología molecular que permiten
una detección e identificación más rápida de las
micobacterias (1,9).
c.2.1. Tinciones
Las micobacterias se tiñen mal con los colorantes habituales
debido al elevado contenido de lípidos de su pared celular.
Para lograr que el colorante primario penetre en las
micobacterias se recurre al calor o a determinados
detergentes según el método utilizado. Una vez dentro, el
colorante no se altera tras la exposición a soluciones de
alcohol y ácido. Esta propiedad, llamada ácido-alcohol
resistencia, es útil para la visualización de este grupo
específico de bacterias. Además, las micobacterias son
capaces de formar complejos estables con ciertos colorantes
como la auramina. Los métodos más utilizados para la
tinción de la micobacterias son:
- Tinciones de Ziehl-Neelsen o Kinyoun, basadas en la
utilización de fucsina fenicada como colorante primario. La
primera requiere calentar la preparación para permitir la
entrada de colorante en las micobacterias, mientras que la de
Kinyoun utiliza cuerpos tensoactivos sin necesidad de
calentar el colorante; y
- Tinciones de auramina o auramina-rhodamina, en las que

las micobacterias muestran fluorescencia bajo una luz
ultravioleta.
La microscopia presenta una sensibilidad inferior al cultivo,
oscilando entre un 22% y un 80% (1). La sensibilidad es mayor
al procesar muestras respiratorias; al aumentar el volumen de
muestra procesada (10); al concentrar las muestras, ya que se
precisa una concentración > 10.000 bacilos/ml para que la
muestra sea positiva (9,11); o al utilizar tinciones de
auramina, de sensibilidad similar a la de Ziehl-Neelsen y más
cómodas para el observador, y más sensibles que la de
Kinyoun (12). Cuando existan dudas con las técnicas
fluorescentes se recomienda confirmar los resultados
mediante una tinción de Ziehl-Neelsen.
Los resultados falsos negativos suelen corresponder a
muestras inadecuadas (saliva, escaso volumen de orina, jugo
gástrico sin neutralizar, etc.), errores en la técnica (mala
extensión y fijación, alteraciones en los colorantes, exceso de
decoloración, etc., errores en la observación (pocos campos
examinados, falta de atención, falta de experiencia, cansancio,
etc.). Los falsos positivos se deben a precipitados de los
colorantes, contaminación cruzada de los portaobjetos,
contaminación del agua y reactivos utilizados y a la presencia
de microorganismos ácido-alcohol resistentes distintos de las
micobacterias (corinebacterias, nocardias, actinomyces,
Rhodococcus, Tsukamurella, etc.…). La presencia de bacilos
ácido-alcohol resistentes en muestras con cultivo negativo
también puede deberse a tratamientos previos con
antibióticos, descontaminación excesiva de las muestras o a
un escaso tiempo de cultivo (1).
Cuando la muestra se haya teñido con fucsina fenicada se
deben examinar 300 campos con el objetivo de inmersión (x
1.000). En las tinciones fluorescentes se puede trabajar con un
aumento menor (x 200) y bastará con examinar 30 campos.
Es conveniente informar de la cantidad de BAAR encontrados
(13).
c.2.2. Identificación directamente en muestras clínicas
Aunque no reemplacen al cultivo en el diagnóstico de la
tuberculosis activa, las técnicas basadas en amplificación y
reconocimiento de un fragmento de ARN o ADN han
mejorado notablemente aspectos como la rapidez en el
diagnóstico inicial de la tuberculosis (1). Se pueden dar
resultados falsamente positivos a detectar bacilos muertos,
por lo que no se deben usar en pacientes con tratamiento
antituberculoso, y por contaminaciones de las muestras. Los
falsos negativos se pueden deber a muestras muy
paucibacilares, a la presencia de inhibidores o a problemas de
extracción del ácido nucleico (14). A continuación se
describen brevemente las características de algunos métodos
comercializados.
- Amplicor MTB assay (Roche Molecular System,
Branchburg, NJ): El método se puede realizar de forma
manual o automatizada (excepto la preparación de la
muestra), y la automatizada dispone de un control interno
que se amplifica al mismo tiempo que la diana y permite
detectar la presencia de inhibidores. La sensibilidad (con
respecto al cultivo y datos clínicos) parece ser muy elevada en
las muestras en las que se han detectado BAAR, ya sean
pulmonares o extrapulmonares, mientras que no lo es tanto
en las muestras extrapulmonares (14). La sensibilidad del
método puede verse afectada por factores como la carga
bacteriana, la distribución de las micobacterias o la presencia
de inhibidores en las muestras. Algunos autores han
observado un aumento de la sensibilidad al estudiar tres
muestras secuenciales de cada paciente (15). La especificidad
es superior al 90% y los falsos positivos suelen deberse al uso
de antibióticos o a reacciones cruzadas con micobacterias no
tuberculosas (14).
- Amplified M. tuberculosis Direct (AMTD2) assay (Gen-
Probe, Inc., San diego, California): Es un método de
amplificación isotérmica (42ºC). La sensibilidad es también
elevada en muestras pulmonares y extrapulmonares en las
que se han detectado BAAR (14). La sensibilidad es mejor
cuando los pacientes se seleccionan según sospecha clínica de
tuberculosis (16). La especificidad es superior al 90% y
aumenta al elevar el punto de corte de la técnica sin que
disminuya significativamente la sensibilidad (17).
- LCx MTB assay, Abbott LCx probe system (Abbott
Laboratorios, Illinois): Es un método de amplificación que
utiliza la reacción en cadena de la ligasa. El método presenta
una buena sensibilidad en muestras pulmonares con
presencia de BAAR, pero mucho menor en muestras sin
BAAR y en muestras extrapulmonares (18,19). Algunos
autores han modificado el punto de corte, aumentando la
sensibilidad sin que disminuya prácticamente la especificidad
(18).
- BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex
Direct Detection Assay (DTB) (Becton Dickinson Biosciences,
Sparks, Md.): Es una amplificación isotérmica
semiautomatizada (una extracción manual y laboriosa y una
amplificación y detección completamente automatizadas)
basada en el desplazamiento de cadenas de ADN (SDA, strand
displacement amplification). Incluye un control interno para
la detección de inhibidores. Muestra muy buena sensibilidad
y especificidad tanto en muestras pulmonares como
extrapulmonares, siendo menor la sensibilidad en muestras
pulmonares en las que no se ha detectado BAAR (14,20).
- INNO LiPA Rif.TB (Innogenetics, Ghent, Belgium): Es un
método que combina una hibridación con una amplificación
para detectar al mismo tiempo M. tuberculosis y resistencia a
la rifampicina. En la detección directa, muestra una elevada
sensibilidad junto a una baja especificad (21). La especificidad
aumenta al estudiar sólo muestras con presencia de BAAR
(22).
- GenoType Mycobacteria Direct (GTMD) (Hain Lifescience
GMBH, Nehren, Germany): Es un método de amplificación
basado en NASBA que detecta en el mismo proceso M.
[21]

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tuberculosis y otras cuatro especies de micobacterias de
importancia clínica. La sensibilidad y especificidad son
elevadas (23).
d. Cultivos
El cultivo sigue siendo el estándar de oro para el diagnóstico
de la tuberculosis activa, pudiendo detectar una
concentración < 100 bacilos/ml. Además, el aislamiento
permite realizar estudios de sensibilidad frente a los fármacos
antituberculostáticos. La sensibilidad es del 80-85% con muy
elevada especificidad (1).
Ya que la tuberculosis se puede producir en casi cualquier
sitio del organismo, se utiliza una gran diversidad de
muestras para el estudio de micobacterias: esputo, jugo
gástrico, orina, líquido cefalorraquídeo, broncoaspirados,
lavados bronquioalveolares, biopsias, etc.…
Las muestras, correctamente identificadas, deben remitirse al
laboratorio lo antes posible. Es conveniente refrigerarlas si se
prevén retrasos. Estas muestras no se cultivan directamente,
la mayor parte procede de áreas contaminadas por otros
microorganismos, mientras que en otras la concentración de
bacilos es muy escasa. Es necesario un tratamiento adecuado
de las muestras, que comprende procesos de homogenización,
concentración y descontaminación, antes de cultivarlas (1).
Los métodos más utilizados para la licuefacción y
recontaminación incluyen combinaciones de N-acetil-Lcisteína
e hidróxido sódico (NaOH), laurilsulfato sódico y
NaOH y fosfato trisódico y cloruro de benzalconio. También
se pueden usar de forma aislada NaOH, ácido sulfúrico y
ácido oxálico (24).
El cultivo se realiza en medios selectivos tanto líquidos
(Proskauer-Beck, Sauton, Sula, Dubos, Middlebroock 7H9)
como sólidos, con huevo (Löwenstein-Jensen, Petragnani,
Coetsos, Stonebrink), los más utilizados, y con agar (Dubos,
Middlebroock 7H10, Middlebroock 7H11). Los medios sólidos
permiten una buena recuperación de las micobacterias y
reconocer sus características fenotípicas. Los medios líquidos
suelen estar muy enriquecidos, por lo que el cultivo es más
rápido que en los sólidos y se recupera un mayor número de
micobacterias. No permiten distinguir los cultivos mixtos ni
la morfología y pigmentación de las colonias (24).
Algunos se leen manualmente, como el MB redox, en el que el
crecimiento precipita partículas rosas-violetas; y el MGIT
(Mycobacterial growth indicador tube), un medio basado en
Middlebroock 7H9 con un indicador fluorescente; pero en los
últimos años se ha impuesto el medio líquido de
Middlebroock para el diagnóstico rápido automatizado,
existiendo diversos sistemas comerciales: BACTEC, MGIT,
MB/Bact y ESP (Extra Sensing Power) (1,9,24). Sus
características principales se describen a continuación.
- Sistema BACTEC 460TB: Es un sistema semiautomático que
utiliza 14C para detectar el crecimiento. Es más rápido y
[22]
sensible que los cultivos en medio sólido, tanto para M.
tuberculosis como para otras micobacterias, pero su principal
inconveniente es el uso de isótopos radioactivos (25).
- Sistema MB/Bact ALERT 3D: Es un sistema automatizado
colorimétrico de monitorización continua que detecta el
crecimiento bacteriano por la producción de CO2. El sistema
avisa de la positividad del cultivo o del fin del periodo de
incubación fijado si es negativo. La sensibilidad y rapidez son
mejores que con los medios sólidos (26). La rentabilidad es
similar a la del BACTEC (27), tanto en muestras pulmonares
como extrapulmonares (28), sin el inconveniente de
radioactividad.
- Sistema ESP Cultura System II: Es un sistema automático no
radiométrico de monitorización continua que detecta el
crecimiento mediante el consumo de oxígeno. El sistema es
más rápido y sensible que los medios sólidos, pero la
sensibilidad es algo menor que con BACTEC 460 (29) y
similar a la del BACTEC MGIT, aunque el tiempo de
detección es más largo (30). No presenta el inconveniente de
la radiactividad.
- Sistema BACTEC MGIT 960: Es un sistema automatizado
que utiliza el medio MGIT y detecta el consumo de O2
mediante fluorimetría. No puede utilizarse con muestras de
sangre. La sensibilidad es algo menor que la del BACTEC 460,
pero el crecimiento es un poco más rápido (31), tanto en
muestras con baciloscopia positiva como negativa (32). No
presenta el inconveniente de la radioactividad.
- Sistema BACTEC serie 9000: Es un sistema automatizado de
hemocultivos adaptado al cultivo de micobacterias mediante
una modificación del programa informático y el uso de un
medio de cultivo y de un sensor de oxígeno específicos. El
rendimiento es similar al del BACTEC 460 (33), detectando
peor las muestras con baciloscopias negativas (34). Tampoco
presenta el inconveniente de la reactividad.
e. Pruebas bioquímicas
Se ha utilizado un amplio número de pruebas para la
identificación de las micobacterias. Se recomienda usar un
conjunto de pruebas seleccionadas en función de un
agrupamiento previo por características de crecimiento,
pigmentación y morfología de las colonias. Las básicas para la
identificación de M. tuberculosis son la prueba de la niacina,
la de reducción de nitratos y las de la catalasa (13).
- Prueba de la niacina: Se basa en la liberación de niacina al
medio de cultivo por M. tuberculosis y algunos aislados de M.
africanum, M. simiae y M. chelonae.
- Prueba de reducción de nitratos: Las micobacterias difieren
en su capacidad para reducir los nitratos a nitritos mediante
la presencia de la enzima nitratorreductasa. Es muy útil para
diferenciar las especies de micobacterias de crecimiento
rápido, así como algunas de crecimiento lento (M.
tuberculosis, M. Kansasii, M. flavescens y M. szulgai son

positivas).
- Prueba de la catalasa: Todas las micobacterias, excepto
algunos aislados de M. tuberculosis y de M. bovis resistentes a
la isoniacida producen catalasa. Las especies se pueden
diferenciar estudiando la cantidad de catalasa producida y su
termoestabilidad.
f. Métodos de identificación cromatográfica
Permiten identificar especies mediante la determinación
cualitativa de la composición lipídica de la pared de las
micobacterias. Las de mejor rendimiento son la cromatografía
de gases y la cromatografía líquida de alta resolución. Su coste
y complejidad han hecho que se vean relegadas frente a los
métodos de detección genética (24).
g. Métodos de amplificación de ácidos nucleicos
Utilizan la hibridación con sondas de ácidos nucleicos, la
amplificación de secuencias de ADN, la secuenciación de la
unidad 16S, la amplificación a tiempo real y el uso de arrays.
- Hibridación: Permiten detectar el ARN ribosómico de las
micobacterias a partir de medios sólidos y líquidos (35,36). La
técnica es rápida y específica, pero sólo permite identificar
una especie cada vez, por lo que se debería hacer un
diagnóstico presuntivo antes de comenzar la técnica, y sólo
están comercializadas sondas para un pequeño número de
micobacterias (9).
- Amplificación de secuencias específicas: Las dianas más
usadas corresponden al gen hsp65 y a la subunidad ribosomal
16S. El análisis posterior se puede realizar mediante
polimorfismo de los fragmentos de restricción, hibridación y
secuenciación (37-39).
- Amplificación a tiempo real: Se basan en la realización de
forma simultánea de la amplificación de una diana y su
reconocimiento mediante hibridación. Los sistemas
comercializados se basan en el desplazamiento de cadenas de
ADN (SDA, strand displacement amplification) y la detección
por fluorescencia (40). El método presenta muy buenas
sensibilidad y especificidad (41).
- Arrays de ADN: Son conjuntos de sondas de ADN colocadas
en un soporte sólido con una disposición prefijada, lo que
permite detectar simultáneamente diferentes secuencias de
ácidos nucleicos (42). Este método, precedido de una
amplificación, se ha aplicado a la identificación de
micobacterias, permitiendo la identificación de varias
especies a la vez (43,44).
OBJETIVOS
El Hospital Universitario de Gerona Doctor Josep Trueta es
un centro clasificado como de nivel II. Tiene una capacidad
de unas 400 camas con todas las especialidades propias de
segundo nivel y algunas típicas de un hospital terciario, como
por ejemplo Neurocirugía, Curas Intensivas, Pediatría y
Ontología Médica.
Este centro sirve de forma directa a 153.151 usuarios y actúa
como centro de referencia para una población de 709.520
habitantes, recibiendo pacientes de los centros hospitalarios
comarcales.
Hasta finales del año 2007 el diagnóstico microbiológico de la
tuberculosis se basaba en la tinción de Ziehl-Neelsen y el
cultivo para micobacterias de las muestras aportadas. Los
cultivos positivos eran identificados en el propio laboratorio
como Mycobacterium tuberculosis complex o no mediante
sondas de DNA y posteriormente se enviaban al Hospital Vall
Hebrón de Barcelona para la identificación de especie y
resistencias a los antituberculostáticos.
A finales del año 2007 se incorpora en el área de
microbiología clínica la detección de Mycobacterium
tuberculosis complex por reacción en cadena de la polimerasa
a tiempo real (RT-PCR). Los equipos instalados son el
extractor de DNA EZ1 de Qiagen y el termociclador para la
amplificación y detección Smartcycler de Cepheid, ambos a
cargo de IZASA.
El objetivo de este trabajo es evaluar los resultados obtenidos
con la técnica nueva des de su incorporación hasta finales del
2009 (2 años).
MATERIAL Y MÉTODOS
Estudio retrospectivo de todas las solicitudes de RT-PCR a
micobacterias des de la instauración de la técnica en el
laboratorio hasta finales del año 2009. Conseguido mediante
el sistema informático del laboratorio OMEGA3000.
Junto con el resultado de la RT-PCR, en las muestras
aportadas, se ha recopilado el resto de pruebas diagnósticas
para micobacterias (tinción Ziehl-Neelsen y cultivo)
Las muestras a estudiar se manipulan en el área de
micobacterias, zona aislada del resto del área de
microbiología con campana de flujo laminar tipo II. El
personal manipulador se equipará de guantes, bata y
mascarilla de un solo uso.
a. Tinción Ziehl-Neelsen
Si las muestras son muy líquidas concentrarlas mediante
centrifugación a 1.500 r.p.m. durante aproximadamente 5
minutos y aprovechar el sedimento.
1. Identificar un portaobjectos de cristal con el número de
laboratorio de la muestra
2. Extender y secar la preparación sobre el portaobjectos.
3. Fijarla con calor.
4. Cubrir la preparación con solución de fucsina tensioactiva
[23]

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durante 6 minutos.
5. Lavar con agua del grifo.
6. Decolorar con el descolorante (950ml etanol o metanol
puro + 50ml ácido clorhídrico al 35%) hasta que no se
desprenda más colorante.
7. Lavar con agua del grifo.
8. Cubrir la preparación con azul de metileno durante 2
minutos.
9. Lavar con agua del grifo.
10. Secar y observar al microscopio con el objetivo de
inmersión.
b. Cultivo de micobacterias
B.1. HOMOGENIZACIÓN Y DESCONTAMINACIÓN DE LA MUESTRA
(TéCNICA DE TACQUET I TISSON)
La finalidad de esta operación es eliminar la flora que puede
acompañar a las micobacterias en una muestra.
1. Traspasar la muestra o una alícuota según volumen en un
tubo de 50 ml. de tapón de rosca, considerando que:
- Orina: centrifugar previamente y cultivar el sedimento
- Otras muestras líquidas, también centrifugar si cal.
- Muestras sólidas (biopsia, ganglio, muestras óseas, etc.):
triturarlas previamente con el masticador o mortero.
2. Añadir un volumen aproximadamente igual de lauril
sulfato sódico. Si la muestra es espesa añadiremos más
cantidad.
3. Agitar cada tubo hasta que la muestra quede
homogenizada.
4. Mantener la muestra en agitación durante 27 - 30 minutos
B.2. NEUTRALIZACIÓN
1. Añadir ácido ortofosfórico lentamente hasta su
neutralización.
La neutralización se produce con el viraje de color de morado
a amarillo paja. Esto se produce por el indicador que lleva
incorporado el reactivo (púrpura de bromocresol) que vira de
color a pH 6,8.
*Si el color final queda demasiado amarillo, añadir unas gotas
de Lauril sulfato sódico.
2. Centrifugar 30 min a 5-6 de velocidad (entre 2500 y 3000
r.p.m.)
B.3. PREPARACIÓN Y SIEMBRA EN MEDIO SÓLIDO (LOWESTEIN
CON PIRUVATO)
1. Sacar los viales de medio sólido de la nevera, etiquetarlos i
dejarlos bajo la campana.
*Si hubiera agua en el fondo del tubo tirarla antes de sembrar
2. Decantar el sobrenadante de la muestra, hasta que el
volumen residual sea aproximadamente de 2 – 3 ml. en un
contenedor en el que previamente habremos añadido solución
de limoseptol al 1%. (2,5 ml de limoseptol + 250 ml de agua).
3. Homogenizar y aspirar aproximadamente 1 ml con pipeta
[24]
Pasteur.
4. Depositar la cantidad aspirada al tubo de Lowenstein
5. Colocar los tubos inclinados y con el tapón de rosca flojo
en los soportes correspondientes e incubarlos en la estufa
entre 35±2º C durante 2-3 días para favorecer la evaporación
del líquido del inóculo.
*Recordar que cuando se trate de muestras cutáneas en las
que se quiera investigar M. marinum habrá que incubar
temperatura ambiente
6. Roscar los tubos y colocarlos en posición vertical en la
gradilla correspondiente dentro de la estufa a 35±2º C
7. Lectura semanal (durante 6 semanas) con el fin de observar
el crecimiento de colonias de micobacterias
B.4. PREPARACIÓN DEL MEDIO LÍQUIDO
1. Desinfectar los tapones de goma del tubo ESP MYCO con
alcohol 70º.
2. Añadir 1ml de GROWTH SUPPLEMENT (contiene OADC
para facilitar el crecimiento de las micobacterias)
3. Añadir 0,5 ml de PVNA (Polimixina B, Vancomicina, ácido
Nalidíxico y amfotericina B) previa rehidratación con 25 ml
de agua destilada estéril
B.5. SIEMBRA EN MEDIO LÍQUIDO (ESP)
1. Añadir 10 ml de agua destilada estéril al tubo de muestra
decontaminada
2. Centrifugar 10 minutos entre 2500 y 3.000 r.p.m.
3. Decantar el sobrenadante hasta que queden 2 – 3 ml.
4. Agitar
5. Desinfectar el tapón de goma del vial ESP con una gasa
impregnada de alcohol 70º.
6. Introducir 1 ml. de muestra tratada al vial ESP
7. Desinfectar otra vez el tapón de goma del vial ESP con una
gasa impregnada de alcohol de 70º.
8. Invertir los viales de ESP
9. Colocar el conector ESP a los viales ESP
10. Esperar 10-15 minutos antes de introducir los viales al
incubador
11. No mover los viales una vez colocado el conector
*Una vez sembradas las muestras se guardará el tubo
decontaminado durante 1 semana juntamente con las
etiquetas identificadoras del número interno.
c. Identificación de Mycobacterium tuberculosis complex
por sondas de DNA
Siempre que sea posible la identificación se hará a partir de
las colonias de micobacterias aisladas en medio sólido.
Si se positiviza un vial ESP de medio líquido y no hay
crecimiento en el medio sólido, se hará una resiembra en
medio sólido (tubos de Lowenstein con y sin piruvato) y la
identificación se hará posteriormente a partir de esta
resiembra sólida.

C.1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
- Reconstituir los tubos liofilizados (“lysing tubes”):
Un tubo para cada muestra a identificar:
- 100 λ de REACTIVO 1 (reactivo de lisis)
- 100 λ de REACTIVO 2 (reactivo de hibridación)
previamente incubado en la estufa a 35-37ºC
- Dentro de la campana de flujo laminar tipo II, añadir con
una nansa la colonia de la micobacteria a identificar.
- Tapar bien los tubos y agitar.
C.2. SONICACIÓN
- Llenar el aparato de sonicación con agua destilada
- Dejar que el agua se desgasifique (15 minutos)
- Colocar los tubos con el soporte
- Sonicar durante 15 minutos
C.3. INACTIVACIÓN
- Sacar los tubos del sonicador y colocarlos 10 minutos a 95ºC
en el baño calefactor
C.4. HIBRIDACIÓN
- Transferir 100 landas de la muestra a un tubo MTB Probe
Reagent
- Agitar
- Dejarlo 15 minutos a 60ºC
- Añadir 300 landas de Reactivo de Selección (reactivo 3)
- Agitar
- Dejarlo 5 minutos a 60ºC y posteriormente 5 minutos a
temperatura ambiente.
C.5. LECTURA CON EL APARATO GEN PROBE
d. Identificación de Mycobacterium tuberculosis complex
por RT-PCR
* Sangre total EDTA pasar al punto 5
* El resto de muestras, excepto BAS i BAL, pasar al punto 2
D.1. DESCONTAMINACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA
(BAS Y BAL)
- En el tubo decontaminado de muestra para sembrar añadir
10ml de agua destilada estéril
- Agitar
- Centrifugar 10 minutos entre 2500 y 3.000 r.p.m.
- Decantar el sobrenadante hasta que queden 2 – 3 ml.
- Añadir 10ml de agua destilada estéril
- Agitar
- Centrifugar 10 minutos entre 2500 y 3.000 r.p.m.
- Decantar el sobrenadante hasta que queden 2 – 3 ml.
- Añadir 1ml de agua destilada estéril
- Agitar
D.2. INACTIVACIÓN POR CALOR
- En un tubo de muestras (sample tub) 2ml añadir 180 μl de
buffer G2 i 200 μl de muestra.
- Mezclar suavemente con la pipeta para evitar aerosoles
- Incubar 15 minutos a 95ºC
- Hacer un spin para eliminar las gotas de la pared interna del
tubo.
D.3. TRATAMIENTO CON PROTEINASA K
- Añadir 20μl de proteinasa K (1g/ml) a la mezcla
- Mezclar suavemente con la pipeta
- Incubar 30 minutos a 60ºC
- Hacer un spin para eliminar las gotas de la pared interna del
tubo.
D.4. PREPARACIÓN DEL CARRIER RNA
Reconstitución del Carrier RNA al recibir el reactivo
- Disolver el Carrier RNA liofilizado con 310 μl de buffer
AVE
- Alicuotar volúmenes de 16 μl (solución stock) y congelar a
–20ºC
• Para 1 muestra:
En un “sample tub” 2 ml: 56,4 μl buffer AVE + 3,6 μl de
solución stock (irá en la posición 3 del Biorobot EZ1* cuando
se haga la extracción).
D.5. EXTRACCIÓN
D.5.1. Muestra de sangre total
- Introducir la tarjeta “DNA blood card” en el Biorobot EZ1
- Abrir el Biorobot EZ1
- En la pantalla Protocolos clicar START
- Seleccionar la cantidad de muestra :
- Opción 1. 200 μl
- Seleccionar la cantidad de eluido:
- Opción 1. 50 μl
- Seleccionar NO lavado con etanol, opción 1
- Clicar cualquier tecla y seguir las instrucciones que
aparecen en pantalla:
• Para 1 muestra:
- Colocar cartucho
- Colocar un tubo de elución (Elution tub) vacío, abierto e
identificado en la posición 1
- Colocar la punta dentro de la funda en la posición 2
- Colocar “Sample tub” 2ml con la cantidad de muestra
seleccionada
- Clicar start
- Un vez finalizado:
- Recuperar y tapar el elution tub de la posición 1 y hacerle un
spin (esperar a 1500 rpm y parar)
- Tirar lo restante
- Lavar con alcohol el Biorobot EZ1
[25]

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- Cerrar el Biorobot EZ1
d.5.2. OTRAS MUESTRAS (43 min)
- Introducir la tarjeta “v irus card v2.0” en el Biorobot EZ1
- Abrir el Biorobot EZ1
- En la pantalla Protocolos clicar START
- Seleccionar cantidad de muestra :
- Opción 3. 400 μl si hay suficiente muestra o sino opción 2.
200 μl
- Seleccionar cantidad de eluido:
- Opción 1. 60 μl
- Clicar cualquier tecla y seguir las instrucciones que
aparecen en pantalla:
• Para 1 muestra:
- Colocar cartucho
- Colocar un “Sample tub” de 2ml vacío y abierto en el
“heating block” (posición 6)
- Colocar un “Elution tub” vacío y abierto en la posición 1
- Colocar la punta dentro de la funda en la posición 2
- Colocar el “Sample tub” de 2ml abierto con el carrier RNA
preparado en la posición 3*
- Colocar un “Sample tub” de 2ml con la cantidad de muestra
seleccionada
- Clicar start
- Una vez finalizado
- Recuperar y tapar el elution tub de la posición 1 y hacerle un
spin (esperar a 1500 rpm y parar)
- Tirar lo restante
- Lavar con alcohol el Biorobot EZ1
- Cerrar el Biorobot EZ1
D.6. PREPARACIÓN DEL SMARTCYCLER
• Para 1 muestra:
- En smartcycler MTBC-01 descongelado añadir 10 μl del
eluido
- Centrifugar
- Comprobar que la ventana
óptica esté llena y sin burbujas
- Mantenerlo en el criobloque
mientras se configura el protocolo
D.7. RT-PCR (1:38H)
- Abrir el termociclador y el
ordenador
- Abrir programa Smartcycler
clicando sobre el incono “Smart
Cycler Dx diagnostic”
- Clicar “Create run”
- En “Run name” poner el
proceso, ejemplo : MTBC + data
- En “notes” se puede poner el
número de la petición, el nombre
del paciente, el tipo de muestra...
[26]
- Seleccionar el “assay ”: MTBC
- En “Number of specimens” poner el número de muestras y
clicar “apply”
- Clicar “Add/Remove Sites”:
- Seleccionar la posición deseada→ clicar la flecha → aceptar
- Introducir el smartcycler en la posición seleccionada
- Iniciar el proceso clicando “Star Run”
D.8. SELECCIÓN DE FLUOROCROMOS PARA LA GRáFICA
- Clicar en “select graphs”
- De la columna de la derecha (select graphs) seleccionar todo
los fluorocromos y combinaciones excepto FAM, TET,
FAM+TET y la temperatura
- Clicar la flecha dirigida hacia la izquierda
- Clicar “OK”
D.9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
FAM TET
(control interno)
RESULTADO
+ +/- MTBC +
- + MTBC -
- - invalido
RESULTADOS
• Año 2007 (tabla II):
Año 2007 (tabla II):
Tabla II: Resultados correspondientes al año 2007.
Tabla II: Resultados correspondientes al año 2007. La siglas están descritas en los
Siglas descritas en anexos.
anexos.
Biología molecular
DEMOGRÁFICOS Trueta Vall Hebrón MICROBIOLOGÍA
Caso Sexo Edad Inmig Servicio Muestra PCR PCR Cultivo ZN Cultivo Iden
t.
1 1 45 MIR LCR N N N . .
2 1 57 MIR LCR MI . .
3 2 24 DIAL BIO N N N N N
4 1 84 MIR LCR NP N N
5 1 49 X ENDO LP N N N . .
6 1 62 X NEURO LCR N N N . N
7 1 48 NEURO LCR N N N . .
8 2 78 NEURO LCR N N N . .
9 2 49 NEURO LCR MI . .
10 2 16 NEURO LCR N N N N .
11 2 45 X MIR LCR N N N . .
12 1 1 X UPE LCR N N N N N
13 2 41 MIR LPERI N N N N N
14* 1 2 PED LCR N N N N N
15* 1 2 UPE LCR N N MT N MTC MT
16 1 58 MIR LP N N N N N
17 1 50 ENDO BAS N N N N N
18 1 88 NEURO LCR N N N . .
Los equipos de extracción y amplificación se instalaron en el laboratorio a principios
del 2007 pero no fue hasta Noviembre que se entregaron los resultados obtenidos en el
área (a partir de la muestra 15, marcadas en azul). Durante ese periodo de tiempo se
estuvieron realizando las RT-PCR a micobacterias paralelamente con el hospital Vall de

Los equipos de extracción y
amplificación se instalaron en el
laboratorio a principios del 2007 pero
no fue hasta Noviembre que se
entregaron los resultados obtenidos en
el área (a partir de la muestra 15,
marcadas en azul). Durante ese periodo
de tiempo se estuvieron realizando las
RT-PCR a micobacterias paralelamente
con el hospital Vall de Hebrón y en el
total de las 15 determinaciones se
obtuvo un 100% de coincidencia.
* Los casos 14 y 15 corresponden al
mismo paciente. En la primera muestra
de líquido cefalorraquídeo tanto la
tinción de Ziehl-Neelsen como la RT-
PCR y el cultivo de micobacterias
resultaron negativos, pero en la segunda
muestra la tinción y la RT-PCR fueron
negativas pero en el cultivo se obtuvo
crecimiento y se identificó como
Mycobacterium tuberculosis.
De las 18 solicitudes de RT-PCR para
micobacterias solo se pudieron realizar
15 ya que dos fueron muestras
insuficientes y una no precedía por
previo diagnóstico con microbiología
básica de infección por Listeria.
Año 2008 (tabla III):
Del total de 77 solicitudes de RT-PCR
solo se realizaron 70 ya que una fue
muestra insuficiente, otra no se pudo
realizar con la muestra aportada
(médula ósea) y 5 se rechazaron por no
proceder (4 por haberse realizado
anteriormente en otra muestra y una
por la positividad de la tinción de Ziehl-
Neelsen).
Hubo una RT-PCR en la cual no se
amplificó el control interno y no se
pudo dar resultado por inhibición del
proceso (caso 67).
Tabla III: Resultados correspondientes al año 2008. La siglas están descritas en los anexos.
Cas
o Sexo
DEMOGRÁFICOS
Edad Inmig Servicio Muestra PCR ZN
MICROBIOLOGÍA
Cultivo Identificación
1 1 79 MIP BAS N N N
2 1 69 MIR LCR N N N
3
4 1 16 ENDO
BIO
BAS
N
P
N
N
N
N
5 1 65 MIR LP P MI
6 1 88 MIR ORI N . N
7 1 6 X PED ADE P N MTC M.bovis
8 2 5 PED ASPG N . .
9 1 35 X UCI LCR N . .
10 1 24 X SCAT ADE N P No M.Intracellulare
11
12
1
2
66 X
45
MIR
URG
LCR
LAS
N
N
N
N
MTC N
N
13 2 40 ENDO BAS N N N
14 2 17 X URG PUS P P MTC M.tuberculosis
15 1 77 UCI LCR N . .
16 1 41 CT EXU N N N
17 1 37 X MIR BIO P N N
18 2 24 URG LCR N . N
19 1 19 URG LP N . .
20
21 2 12d X UNE
SANG
BAS
P
P
.
P
.
MTC M.Tuberculosis
22
23 2 1 UPE
LCR
LCR
N
NP
.
N
.
N
24 2 12d X UNE SANG NP . .
25 2 1 UPE LCR N N N
26
27 1 79 MID
ORI
SANG
P
N
.
.
.
.
28 1 25 X ENDO BAS NP P MTC M.tuberculosis
29 2 40 ENDO BAS N N .
30 2 85 URG LCR N N .
31 1 79 UCI MO NP N N
32
33
1 82
42 X
MIR
ENDO
LP
BAS
MA N
N
N
N
N
N
34
35 2 30d X NEO
LCR
SANG
N
N
.
.
.
.
36 LCR N N N
37 ASPG N N N
38 ASPG N N N
39
40 2 PED
ASPG
LCR
N
N
N
.
N
.
41 LCR N . .
42
43 2 30d X NEO
SANG
ASPG
MI
N
.
N
.
N
44 2 21 ENDO BAS P P MTC M.Tuberculosis
45 2 75 MIR Camp BAR N N N
46 2 20 URG LCR P N MTC M.Tuberculosis
47 1 79 ENDO BAS N N N
48 1 51 URG LCR N . N
49 1 29 X CT BAS N N N
50 2 75 URG Camp LAS N . .
51 2 65 X MIR BIO N . N
52 1 12 X PED SANG N . .
53 1 42 URG LP N N N
54 1 12 X PED MO N N N
55 1 62 X MIR LP N N N
56 1 22 X MIR LP N N N
57 1 79 ENDO BAS N N N
58 2 81 MIR LPER N . N
59 1 28 X UCI BAR N N N
60 2 81 MIR LP N N N
61 2 83 CG Camp LAS N N N
62 2 30 ENDO BAS P P MTC M.Tuberculosis
63 1 50 X MIR LAS N N N
64 1 20 UCI LCR N N N
65 1 72 URG LCR N N N
66 1 38 X MIP BAS N N N
67 1 58 X MIP SANG I . .
68 1 21 X NCR LCR N N N
69
70 2 37 MIR
LCR
LAS
N
N
.
.
N
.
71 1 30 X MID LPER P N N
72 1 55 NEF LAS N . .
73 ORI P N N
74
75 1 70 URO
ORI
ORI
NP
NP
N
MI
N
N
76 2 58 MIR LCR N . .
77 1 31 X MIR LIQ P N MTC M.Tuberculosis
[27]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
Año 2009 (tabla IV):
Del total de 120 solicitudes
de RT-PCR solo se realizaron
106 ya que 9 se rechazaron
por no proceder (7 por
haberse realizado
anteriormente en otra
muestra y dos por previo
diagnóstico microbiológico:
una de infección por
Enterovirus (RT-PCR, caso
57) y otra por Streptococcus
pneumoniae (detección de
antígeno; caso 105). Otras 5
solicitudes no se pudieron
realizar con la muestra
aportada (cuatro eran
botellas de hemocultivos
cuyas resinas inhiben el
proceso y otra era un esputo
que presenta baja
sensibilidad en la
amplificación).
[28]
Tabla IV: Resultados correspondientes al año 2009. La siglas están descritas en los anexos.
DEMOGRÁFICOS MICROBIOLOGÍA
Caso Sexo Edad Immig Servicio Muestra PCR ZN Cultivo Identificación
1 2 64 ENDO BAS P N N
2 2 71 MIR LAS N . .
3 2 50 MIR LAS N . .
4 1 35 X MIR PUS P P MTC M.tuberculosis
5 1 84 MIR LP N N N
6 2 77 MIR LCR N N N
7 1 6 X PED ADE P N N
8 1 48 ENDO BAS N N N
9 1 18 X MIP BAS N N N
10 1 37 X MIR LIQ P N N
11 2 77 MIR LCR N N N
12 1 30 X MIR ESP N N N
13 2 60 MIR PUNC N NPMA N
14 1 24 X MIR LIQ P N MTC M.tuberculosis
15 1 30 X MIR ADE P N MTC M.tuberculosis
16 1 25 MIR LAR N . .
17 1 29 X MIR ESP NPMA P MTC M.tuberculosis
18 1 28 X ENDO BAS N N MTC M.tuberculosis
19 2 26 X MIP BAS N N N
20 2 27 X UCI LCR N N N
21 1 71 MIP BAR N N N
22 1 30 X URG LP P N N
23 SANG N N N
24 2 73 URO ORI N N N
25 1 39 ENDO BAS N N N
26 1 24 ENDO BAR N N N
27 ESP N N N
28 ESP N N N
29 1 64 MIR ESP N N N
30 LP P N N
31 1 12 X PED ASPG NP N N
32 ASPG N N N
33 2 1 PED ASPG NP N MTC M.tuberculosis
34 ASPG N N N
35 1 4 PED ASPG N N N
36 1 65 MIP BAS N N N
37 2 27 X MIP BAS N N MTC M.tuberculosis
38 1 145d X PED PUS N N N
39 1 72 MIP PUNC N N N
40 2 67 URG LCR N . .
41 1 77 ENDO BAS N N N
42 1 78 SCAT LAS N . N
43 2 38 X URG LP N N N
44 1 42 X MIR PUS N N N
45 EXU N N N
46 2 60 CT FRO N N N
47 1 80 NEF ORI N N N
48 BAR NP N N
49 1 63 ENDO BAS N N N
50 1 28 X ENDO BAR N N N
51 1 48 MIP BAR N N N
52 1 27 X URG LCR N N N
53 1 31 X MIR LIQ N . N
54 1 64 SCAT LP N . N
55 1 52 ENDO BAR N N N
56 2 44 ENDO BAS N N N
57 1 37 URG LCR NP . .
58 1 42 X MIR LAS N N N
18

59 ABS P N MTC M.tuberculosis
60 ABS NP N MTC M.tuberculosis
61 1 31 X URG ABS NP N MTC M.tuberculosis
62 2 44 X SCAT LP N . N
63 2 25 X CAR LCR N . .
64 LCR N N N
65 SANG NP . N
66 1 47 URG SANG N . N
67 1 46 X MID LAS N . .
68 SANG NPMA . N
69 LCR N . .
70 2 15 X URG LCR N N N
71 2 94 MIR LP N . .
72 1 44 URG ESP N N N
73 LAS N . N
74 1 58 MID LAS N N N
75 1 37 SCAT LP N . .
76 2 93 URG LP N N N
77 1 62 MIR LP N . .
78 1 27 X URG LCR N N N
79 2 93 URG LP N N N
80 1 85 MIR LP N . .
81 1 25 MIR LCR N N N
82 1 96 SCAT LP N . N
83 2 73 MIP BAS N N N
84 2 27 X SCAT LP P . .
85 1 47 MIR LP N . .
86 2 29 X MID LAS N N N
87 2 55 X URG LAS N . .
88 1 48 X URG LCR N N N
89 1 87 SCAT LP N . MI
90 2 43 URG SANG NPMA . N
91 2 29 URG LCR N N N
92 1 14 PED ESP N N N
93 1 42 X MIR LCR N N N
94 ASPG N N MTC M.tuberculosis
95 1 281d PED ASPG NP N MTC M.tuberculosis
96 BAS N N N
97 1 44 X MIP BAR N N N
98 1 281d PED ASPG N N MTC M.tuberculosis
99 1 42 X MIR BAS N N N
100 1 59 MIP BAS N N N
101 1 13 PED ESP N N N
102 MO N . .
103 1 74 MIR SANG N . .
104 1 31 X URG SANG N . N
105 1 15 X URG LCR NP N MI
106 1 17 X URG SANG NPMA . N
107 1 32 X MIR ABS P N MTC M.tuberculosis
108 1 17 X MIR ABS N N N
109 2 73 URG LCR N . .
110 1 41 X SCAT BAS N . .
111 2 29 NEURO LCR N N N
112 1 68 X URG LP N N N
113 1 43 SCAT ADE N . .
114 2 50 MIP SANG NPMA . N
115 2 47 X NEURO LCR N N N
116 2 85 SCAT LP N . N
117 URG LP N N N
118 1 63 MIR SANG N . .
119 1 88 SCAT LP N . .
19
[29]

Roche Diagnostics informa Especial 6as 15
Jornadas para Residentes | Octubre 2010
10
Tipo de muestra (tabla V y figura 1)
Tabla V: Distribución de los tipos de muestra recibidos
Número total
Tipo muestra Nº total %
1 ABS 3 1,57
2 ADE 5 2,62
3 ASPG 10 5,24
4 BAR 8 4,19
5 BAS 29 15,18
6 BIO 4 2,09
7 ESP 7 3,66
8 EXU 2 1,05
9 FRO 1 0,52
10 LAR 1 0,52
11 LAS 15 7,85
12 LCR 47 24,61
13 LIQ 4 2,09
14 LP 29 15,18
15 LPER 2 1,05
16 LPERI 1 0,52
17 MO 2 1,05
18 ORI 5 2,62
18 PUNC 2 1,05
20 PUS 4 2,09
21 SANG 10 5,24
Total 191 100
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Figura 1: Grafica de los tipos de muestra recibidos basada en la tabla V.
60
[30]
50
Tipo de muestra
Núm
Servicio demandante (figura 2)
Número total
25
20
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
60
50
40
30
20
10
0
Figura 2 Distribución de peticiones en función del servicio demandante.
Datos demográficos del paciente (figura 3)
35%
Figura 3: Distribución por sexos (3a) y por procedencia (3b)
DISCUSIÓN
CAR CT DIAL ... MID MIP MIR NCR NEF ... PED UCI URG URO SCAT ...
65% Hombre
Mujer
Repeticiones (tabla VI)
Tipo de muestra
Servicio demandante
39%
61% Hombre
Mujer
De las 191 determinaciones de RT-PCR a Mycobacterium
tuberculosis complex a 169 pacientes diferentes se realizaron
10 repeticiones (5,23%), es decir, mismo paciente y igual tipo
de muestra pero de diferente extracción.
Las repeticiones realizadas han sido a demanda del médico,
sobretodo por pediatras debido a una alta sospecha clínica de
tuberculosis y por tanto, poca confianza a la técnica si su
resultado es negativo.
Según el tipo de muestra: cuatro repeticiones son de líquido
cefalorraquídeo, tres de aspirado gástrico, una de esputo, otra
de líquido pleural y otra de líquido ascítico.
Según el servicio solicitante: cinco son pediátricas, dos de
urgencias y tres de medicina interna (2 de infecciosas y una
de digestivo).
La repetitividad de la técnica ha sido del 100%, por ello los
facultativos responsables del área de microbiología rechazan
las solicitudes repetidas de un mismo paciente con el mismo
tipo de muestras entregando de resultado un comentario de
no procede.

Tabla VI: Resultados de las repeticiones. Las siglas están descritas en los anexos.
DEMOGRÁFICOS MICROBIOLOGÍA
Año Repetición Caso Sexo Edad Inmig Servicio Muestra PCR ZN Cultivo Identif.
14 1 2 PED LCR N N N
2007 1 15 1 2 UPE LCR N N MTC MT
36 LCR N N N
2 40 LCR N . .
37 ASPG N N N
38 ASPG N N N
2008 3 39 2 2 PED ASPG N N N
6 2 77 MIR LCR N N N
4 11 2 77 MIR LCR N N N
27 ESP N N N
28 ESP N N N
5 29 1 64 MIR ESP N N N
34 ASPG N N N
6 35 1 4 PED ASPG N N N
69 LCR N . .
7 70 2 15 X URG LCR N N N
73 LAS N . N
8 74 1 58 MID LAS N N N
76 2 93 URG LP N N N
9 79 2 93 URG LP N N N
94 1 281d PED ASPG N N MTC MT
2009 10 98 1 281d PED ASPG N N MTC MT
De las 191 determinaciones de RT-PCR a Mycobacterium tuberculosis complex
El número a 169 pacientes de solicitudes diferentes rechazadas se realizaron por ese motivo 10 repeticiones ha sido (5,23%), es decir, mismo
de 12, paciente que sobre y igual el total tipo de de solicitudes muestra pero demandadas de diferente extracción.
corresponde Las repeticiones a un 5,58%. realizadas han sido a demanda del médico, sobretodo por
pediatras debido a una alta sospecha clínica de tuberculosis y por tanto, poca
Discordancias confianza a RT-PCR/Ziehl-Neelsen/Cultivo la técnica si su resultado es negativo. (tabla VII)
Según el tipo de muestra: cuatro repeticiones son de líquido cefalorraquídeo, tres
de aspirado gástrico, una de esputo, otra de líquido pleural y otra de líquido ascítico.
Según el servicio solicitante: cinco son pediátricas, dos de urgencias y tres de
Tabla VII: Resultados discordantes entre la RT-PCR, la tinción Ziehl-
Nielsen y el cultivo. Las siglas están descritas en los anexos.
sexo Edad inmig servicio
2007 medicina 1 C interna 15 (2 de 1 infecciosas 2 y una UPE de digestivo). LCR N
ZN Cultivo
N MTC
Identificación
M.tuberculosis
2 B 4 1 16 ENDO BAS P N N
La 3 repetitividad A 7 de 1 la 6 técnica X PED ha sido ADE del 100%, P N por MTC ello los M.bovis facultativos
responsables 4 D del 10 área 1 de microbiología 24 X SCAT rechazan ADE las N solicitudes P No MTC repetidas M.Intracellulare de un
mismo 5 B paciente 17 con 1 el mismo 37 X tipo MIR de muestras BIO P entregando N N de resultado un
comentario 6 A de no 46 procede. 2 20 URG LCR P N MTC M.Tuberculosis
7 B 71 1 30 X MID LPER P N N
El número de solicitudes rechazadas por ese motivo ha sido de 12, que sobre el
8 B 73 1 70 URO ORI P N N
2008 total de 9 solicitudes A 77 demandadas 1 31 X corresponde MIR LIQ a un 5,58%. P N MTC M.Tuberculosis
10 B 1 2 64 ENDO BAS P N N
• 11 Discordancias B 7 1 RT-PCR/Ziehl-Neelsen/Cultivo 6 X PED ADE P N N (tabla VII)
12 B 10 1 37 X MIR LIQ P N N
13 A 14 1 24 X MIR LIQ P N MTC M.tuberculosis
Tabla VII: Resultados discordantes entre la RT-PCR, la tinción Ziehl-Nielsen y el
14 C 18 1 28 X ENDO BAS N N MTC M.tuberculosis
cultivo. Las siglas están descritas en los anexos.
15 B 22 1 30 X URG LP P N N
Año Disc. 16 B Tipo Caso 30 1 DEMOGRÁFICOS 12 X PED LP Muestra P PCR N N MICROBIOLOGÍA
17 C 37 2 27 X MIP BAS N N MTC M.tuberculosis
18 A 59 1 31 X URG ABS P N MTC M.tuberculosis
19 C 94 1 281d PED ASPG N N MTC M.tuberculosis 22
20 C 98 1 281d PED ASPG N N MTC M.tuberculosis
2009 21 A 107 1 32 X MIR ABS P N MTC M.tuberculosis
El número de discordancias encontradas es de 21, que sobre el total de 191
determinaciones realizadas representan el 11%.
El tipo de discordancias encontradas se pueden clasificar en:
A. RT-PCR positiva con cultivo positivo pero Ziehl-Neelsen negativo.
[31]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
El número de discordancias encontradas es de 21, que sobre el
total de 191 determinaciones realizadas representan el 11%.
El tipo de discordancias encontradas se pueden clasificar en:
A. RT-PCR positiva con cultivo positivo pero Ziehl-Neelsen
negativo.
B. RT-PCR positiva con cultivo y Ziehl-Neelsen negativos.
C. RT-PCR negativa, Ziehl-Neelsen negativo y cultivo positivo
D. RT-PCR negativa y Ziehl-Neelsen y cultivo positivo.
La discordancia tipo A, que corresponde al 28,6% del total
encontrado, es simplemente la demostración de la baja
sensibilidad de la tinción Ziehl-Neelsen en comparación con
el gold-standard del cultivo y la nueva técnica de
amplificación instaurada en el laboratorio.
Como ya se ha dicho en la introducción, se precisa una
concentración > 10.000 bacilos/ml para que la tinción sea
positiva y los resultados falsos negativos suelen corresponder
a muestras inadecuadas (saliva, escaso volumen de orina, jugo
gástrico sin neutralizar, etc.…), errores en la técnica (mala
extensión y fijación, alteraciones en los colorantes, exceso de
decoloración, etc.…), errores en la observación (pocos campos
examinados, falta de atención, falta de experiencia, cansancio,
etc.…).
La discordancia tipo B, representando el 42,8%, se podría
explicar como un falso positivo de la RT-PCR a
Mycobacterium tuberculosis complex debido a detectar
bacilos muertos, por ejemplo en pacientes con tratamiento
antituberculoso, y por contaminaciones de las muestras.
Aunque debido al bajo número de muestras estudiadas y casi
siempre de una a una, la opción de deberse a una
contaminación es poco probable.
La discordancia tipo C corresponde al 23,8% del total
encontrado. Delante de un cultivo positivo solo se puede
pensar en que la negatividad de las otras dos pruebas
diagnósticas es falsa. El resultado falso negativo de la tinción
ya se ha explicado en la discordancia A y el de la RT-PCR se
puede deber a muestras muy paucibacilares o a problemas de
extracción del ácido nucleico.
Otra explicación de un falso negativo de la técnica RT-PCR
seria la presencia de inhibidores en la muestra pero la técnica
instaurada tiene incorporado un control interno para
detectarlos. De manera que si este control interno no se
amplifica el resultado se invalida debido a la presencia de
inhibidores. Aunque quizá existan inhibidores que no afecten
al control interno pero si a la secuencia de DNA a detectar de
Mycobacterium tuberculosis complex.
La discordancia tipo D, encontrada en un solo caso (4,8% de
total) no se debe considerar errónea ya que la negatividad de
la RT-PCR a Mycobacterium tuberculosis complex delante de
una micobacteria atípica (Mycobacterium intracellulare), es
decir, no clasificada dentro de Mycobacterium tuberculosis
complex, es normal.
[32]
CONCLUSIÓN
Después de estudiar los resultados obtenidos durante 2 años
por la técnica de RT-PCR a Mycobacterium Tubeculosis
Complex (215 solicitudes, 169 pacientes, 191 determinaciones
realizadas) se valida como prueba diagnóstica para la
tuberculosis en el área de microbiología del Hospital
Universitario Dr. Josep Trueta de Gerona.
Su repetitividad es del 100%, por lo que rechazar aquellas
solicitudes repetidas (mismo paciente, mismo tipo de muestra
pero diferente extracción) es correcto.
Su sensibilidad se demuestra superior a la de la tinción Ziehl-
Neelsen ya que en un 28,6% de las determinaciones realizadas
(discordancia A) la técnica de amplificación ha sido positiva y
la tinción negativa.
Es importante tener presente que con la RT-PCR a
Mycobacterium tuberculosis complex detectamos material
genético y por ello podemos detectar micobacterias no viables
en pacientes previamente tratados (discordancia B encontrada
en un 42,8%).
La amplificación del control interno incorporado en la
técnica permite informar con seguridad de un resultado
negativo, descartando que se deba a un falso negativo por la
presencia de inhibidores en la muestra. Aunque la
problemática en la extracción de DNA queda plausible con la
frecuencia de un 23,8% de la discordancia C (RT-PCR
negativo pero cultivo positivo)
El binomio RT-PCR negativa y cultivo/tinción positivos
permite hacer la orientación diagnóstica de micobacteria
atípica (discordancia D encontrada en un 4,8%).
La RT-PCR a Mycobacterium Tuberculosis Complex no
sustituye las técnicas convencionales, pero es de gran ayuda
en situaciones en las que se requiere un diagnóstico rápido.

BIBLIOGRAFIA
1. American Thoracic Society. Diagnostic Standards and Classification of
Tuberculosis in Adults and Children. Am J Respir Crit Care Med 2000;
161:1376-1395.
2. Casal Román M. Mycobacterium tuberculosis. En: Perea Pérez EJ, Ed.
Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clínica, Ed. Doyma, Barcelona,
1992: pág. 752-766.
3. Tortoli E. Impact of Genotypic Studies on Mycobacterial Taxonomy: the
New Mycobacteria of the 1990s. Clin Microbiol Rev 2003; 16: 319-354.
4. Brown-Elliott BA, Wallace RJ, Jr. Clinical and Taxonomic Status of
Pathogenic Nonpigmented or Late-Pigmented Rapidly Growing
Mycobacteria. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 716-746.
5. Casal M. Cómo denominar a las micobacterias difentes a Mycobacterium
tuberculosis y a M. leprae. Enferm Infecc Microbiol Clin 2003; 21:296-298.
6. Sauret Valet . Tuberculosis. En: Rodés Teixidor J, Guardia Massó J, Eds.
Medicina Interna. Ed. Electrónica. Barcelona: Masson, S.A.; 1997: pág.1141-
1152.
7. Domínguez J, Ruiz-Manzano J. Prueba de la tuberculina: ¿es la hora del
cambio? Arch Bonconeumol 2006; 42: 47-48
8. Mori T, Sakatani M, Yamagishi F, Takashima T, Kawake Y, Nagao K, et al.
Specific Detection of Truberculosis Infection. An Interferon- γ-based Assay
Using New Antigens. Am J Respir Crit Car Med 2004; 170: 59-64.
9. Palomino JC. Nonconventional and new methods in the diagnosis of
tuberculosis: feasibility and applicability in the field. Eur Respir J 2005; 26:
339-350.
10. Warren JR, Bhattacharua M, De Almeida KNF, Trakas K, Peterson LR. A
minimum 5.0 ml of sputum improves the sensitivity of acid-fast smear for
Mycobacterium tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 1559-
1562.
11. Murray SJ, Barret A, Magee JG, Freeman R. Optimisation of acid fast
smears for the direct detection of mycobacteria in clinical samples. J Clin
Pathol 2003; 56: 613-615.
12. Somoskövi A, Hotaling JE, Fitzgerald M, O’Donnell D, Parsons LM,
Salfinger M. Lessons From a Proficiency Testing Event for Acid-Fast
Microscopy. Chest 2001; 129: 250-257.
13. Nolte FS y Metchoock B. Mycobacterium. En, Murray PR, Baron EJ,
Pfaller MA, Tenover Fc, Yolken RH, edit; Manual of Clinical Microbiology.
6th ed, Washington CD: ASM PRESS; 1995; pág 400-437.
14. Piersimoni C, Scarparo C, Relevance of Commercial Amplification
Methods for Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex in
Clinical Samples. J Clin Microbiol 2003; 41: 5355-5365.
15. Rajalahti I, Vuorinen P, Nienminen MM, Miettinen A. Detection of
Mycobacterium tuberculosis Complex in Sputum Specimens by the
Automated Roche Cobas Amplicor Mycobacterium Tuberculosis Test. J Clin
Microbiol 1998; 36: 975-978.
16. Catanzaro A, Perry S, Clarridge JE, Dunbar S, Goodnight-White S,
LoBue PhA, et al. The Role of Clinical Suspicion in Evaluating a New
Diagnostic Test for Active Tuberculosis. Results of a Multicenter Prospective
Trial. JAMA 2000; 283: 639-645.
17. Alcalá L, Ruiz-Serrano MJ, Hernangómez S, Marín M, García de
Viedman D, San Juan R, et al. Evaluation of the upgraded amplified
Mycobacterium tuberculosis direct test (gen-probe) for detection of
Mycobacterium tuberculosis in respiratory and non-respiratory specimens.
Diagn Microbiol Infect Dis 2001; 41: 51-56.
18. Lumb R, Davies K, Dawson D, Gibb R, Gottlieb T, Kershaw C, et al.
Multicenter Evaluation of the Abbott LCx Mycobacterium tuberculosis
Ligase Chain Reaction Assay. J Clin Microbiol 1999; 37: 3102-3107.
19. Tortoli E, Tronci M, Trosi CP, Galli C, Lavinia F, Natili S, et al.
Multicenter evaluation of two comercial amplification kits (Amplicor,
Roche andLCx, Abbott) for direct detection of Mycobacterium tuberculosis
in pulmonary and extrapulmonary specimens. Diagn Microbiol Infect Dis
1999; 33: 173-179.
20. Piersimoni C, Scarparo C, Piccoli P, Rigon A, Ruggiero G, Nista D, et al.
Performnce Assessment of Two Comercial Amplification Assays for Direct
Detection of Mycobacterium tuberculosis complex from Respiratory and
Extrarespiratory Specimens. J Clin Microbiol 2002; 40: 4138-4142.
21. Viveiros M, Leandro C, Rodrigues L, Almeida J, Bettencourt R, Couto I,
et al. Direct Application of the INNO-LiPA Rif.TB Line-Probe Assay for
Rapid Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex Strains and
Detection of Rifampin Resistance in 360 Smear-Positive Respiratory
Specimens from an Area of High Incidence of Multidrg-Resistant
Tuberculosis. J Clin Microbool 2005; 43: 4880-4884.
22. Tortoli E, Marcelli F. Use of the INNO LiPA Rif.TB for detection of
Mycobacterium tuberculosis DNA directly in clinical specimens and for
simultaneuos determination of rifampin susceptibility. Eur J Clin Microbiol
Infect Dis 2007; 26: 51-55.
23. Franco-álvarez de Luna F, Ruiz P, Gutiérrez J, casal M. Evaluation of the
Genotype Mycobacteria Direct Assay for Detection of Mycobacterium
tuberculosis Complex and Four Atypical Mycobacterial Species in Clinical
Samples. J Clin Microbiol 2006; 44: 3025-3027.
24. Alcalde Fernández de Vega F, Esteban Moreno J, González Martín J,
Palacios Gutiérrez JJ. 9ª. Micobacterias. En: Cercenado E, Cantón R, eds.
Procedimientos en Microbiología Clínica. Madrid: Sociedad Española de
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clinica, 20005.
25. Anargyros P, Astill DS, Lim IS. Compaison of improved BACTEC and
Löwenstein-Jensen media for culture of mycobacteria from clinical
specimens. J Clin Microbiol 1990 June; 28(6): 1288-1291.
26. Palacios JJ, Ferro J, Ruiz Palma N, García JM, Villar H, Rodríguez J, et
al. Fully utomated Lquid Cultura System Compared with Löwenstein-Jensen
Solid Médium for Rapad Recovery of Mycobacteria from Clinical Samples.
Eur J clin Microbiol Infect Dis 1999; 18: 265-273.
27. Harris G, Rayner A, Blair J, Watt B. Comparison of three isolated
systems for the culture of mycobacteria from respiratory and nonrespiratory
samples. J Clin Pathol 2000; 53: 615-618.
28. Brunello F, Favari F, Fontana R. Comparison of the MB/BacT nd
BACTEC 460 TB Systems for Recovery of mycobacteria from Various
Cinical Specimens. J Clin Microbiol 1999; 37: 1206-1209.
29. Tortoli E, Cichero P, Chirillo MG, Gismondo MR, Bono L, Gesu G, et al.
Multicenter Comparison of ESP Cultura System II with ACTEC 460 TB and
with Löwenstein-Jensen Medium for Recovery of Mycobacteria from
Different Clinical Specimens, Including Blood. J Clin Microbiol 1998; 36:
1378-1381.
30. Williams-Bouyer N, Yorke R, Lee HI, Woods GL. Comparison of the
BACTEC MGIT 960 and ESP Culture System II for Growth and Detection of
Mycobacteria. J Clin Microbiol 2000; 38: 4167-4170.
31. Tortoli E, Cichero P, Piersimoni C, Simonetti MT, Ges G, Nista D. Use of
BACTEC MGIT 960 for Recovery of Mycobacteria from Clinical Specimens:
Multicenter Study. J Clin Microbiol 1999; 37: 3578-3582.
32. Somoskövi A, Ködmön C, Lantos A, Bártali Z, Tamási L, Füzy J, et al.
Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the
Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460TB System, and
Löwenstein-Jensen Medium. J Clin Microbiol 2000; 38: 2395-2397.
33. Zanetti S, ArditoF, sechi L, Sanguinetti M, Molicotti P, Delogu G, et al.
Evaluation of a Nonradiometric System (BACTEC 9000 MB) for Detection
of Mycobactria in Human Clinical Samples. J Clin Microbiol 1997; 35: 2072-
2075.
34. Pfyffer GE, Cieslak C, Welscher HM, Kissling P, Rüsch-Gerdes S. Rapid
Detection of Mycobacteria in Clinical Specimens by Using the Automated
BACTEC 9000 MB System and Comparison with Radiometric and solid-
Culture Systems. J Clin Microbiol 1997; 35:2229-2234.
35. Musial CE, Tice LS, Stockman L, Roberts GD. Identification of
mycobacteria from culture by using he Gen-Probe Diagnostic System for
Mycobacterium avium complex and Micobacterium tuberculosis complex. J
Clin Microbiol. 1988; 26: 2120-2123.
36. Badak FZ, Goksel S, Sertoz R, Nafile B, Ermertcan S, Cavusoglu C, et al.
Use of Nucleic Acid Probe for Identification of Mycobacterium tuberculosis
Directly from MB/BacT Bottles. J Clin Microbiol 1999 May; 37(5): 1602-
1605.
37. Plikaytis BB, Plikaytis BD, Yarkus MA, Butler WR,Woodley CL, Silcox
VA, et al. Differentiation of slowly growing Mycobacterium species,
including Mycobacterium tuberculosis, by gene amplification and
restriction fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol 1992;
30: 1815-1822.
38. Kirschner P, Springer B, Vogel U, Meir A, Wrede A, Kiekenbeck M, et al.
Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence
determination: report of a 2-year experience in a clinical laboratory. J Clin
Microbiol 1993; 31:2882-2889.
39. Suffys PN, Da Silva Rocha A, de Oliveira M, Dias Campos CE, Werneck
[33]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
Barreto AM, Portaels F, et al. Rapid Identification of Mycobacteria to the
Species Level Using INNO-LiPA Mycobacteria, a Reverse Hybridization
Assay. J lin Microbiol 2001; 39: 4477-4482.
40. Little MC, Andrews J, moore R, Bustos S, Jones L, Embres C, et al.
Strand Displacement Amplification and Homogeneous Real-Time Detection
Incorporated in a Second-Generation DNA Probe System, BDPobeTecET.
Clin Chem 1999; 45: 777-784.
41. Wang SX, Sng LH, Tay L. Preliminary study on rapid identification of
Mycobacterium tuberculosis complex isolates by the BD ProbeTec ET
system. J Med Microbiol 2004; 53: 57-59.
42. Doménech-Sánchez A, Vila J. Fundamento, tipos y aplicaciones de los
arrays de AND en la micrbiología médica. Enferm Infecc Microbiol Clin
2004; 22: 46-54.
43. Park H, Jang H, Song E, Chang CL, Lee M, Jeong S, et al. Detection and
Genotyping of Mycobacterium Species from Clinical Isolates and Specimens
by Oligonucleotide Array. J clin Microbiol 200; 43: 1782-1788.
44. Sanguinetti M, Novarese L, Posteraro B, Ranno S, De Carolas E,
Pecorini G, et al. Use of Microlectronic Array Technology for Rapad
Identification of clinically Relevant Mycobacteria. J Clin Microbiol 2005;
43(12): 6189-6193.
[34]

ANEXOS
a. Leyenda de códigos y abreviaciones en los resultados
a.1. Sexo : hombre 1; mujer 2
a.2. Servicios :
CAR Cardiología
CT Cirugía torácica
DIAL Diálisis
ENDO Endoscopias
MID Medicina interna digestiva
MIP Medicina interna neumología
MIR Medicina interna
NCR Neurocirugía
NEF Nefrología
NEO Neonatología
NEURO Neurología
PED Pediatría
UCI Unidad curas intensivas
UNE UCI neonatal
UPE UCI pediátrica
URG Urgencias
URO Urología
SCAT Hospital Santa Caterina
MIR Camp Medicina interna Hospital
Campdevanol
URG Camp Urgencias Hospital
Campdevanol
CG Camp Cirugía general Campdevanol
a.3.Muestras:
ABS Absceso
ADE Adenopatía
ASPG Aspirado gástrico
BAR Lavado bronco alveolar
BAS Aspirado bronco alveolar
BIO Biopsia
ESP Esputo
EXU Exudado
FRO Frotis
LAR Líquido articular
LAS Líquido ascítico
LCR Líquido cefalorraquídeo
LIQ Líquido
LP Líquido pleural
LPER Líquido pericárdico
LPERI Líquido peritoneal
MO Medula ósea
ORI Orina
PUNC Punción
PUS Pus
SANG Sangre
a.4. PCR, Ziehl-Nielsen y cultivo
N Negativo
P Positivo
NP No procede
NPMA No posible con la muestra
aportada
I Inhibición
MTC Mycobacterium tuberculosis
complex
. No solicitado
b. Leyenda de los colores en los resultados
Resultado de Ziehl-Nielsen
que no coincide con el
obtenido en la PCR
Resultado de cultivo que no
coincide con el obtenido en la
PCR
Resultado de la identificación
que no coincide con el
obtenido en la PCR
Prueba no realizada por el
motivo indicado
Nº caso Mismo paciente
[35]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
Mecanismo de acción
de kaliocina-1, un nuevo
péptido antimicrobiano
derivado de la lactoferrina
humana
MÓNICA VIEJO DIAZ
Servicio de Análisis Clínicos.
Hospital General Yagüe.
Complejo asistencial de Burgos.
[36]

1. INTRODUCCIÓN
Un estudio previo llevado a cabo por nuestro grupo de
investigación llevó al descubrimiento de una de las acciones
que desarrollan tres proteínas pertenecientes a la familia de
las transferrinas, mostrando la capacidad que tienen algunas
de estas proteínas para permear específicamente el ión
monovalente K+, uno de los iones más importantes en el
mantenimiento y funcionalidad de las células tanto
procariotas como eucariotas (1; 2) .
Esta capacidad de permeabilización específica es distinta a la
observada para el péptido denominado lactoferricina
(secuencia 1 a 47 de la lactoferrina humana) cuya secuencia
homóloga es considerada la región antimicrobiana de esta
proteína y que se comporta en cuanto a su modo de acción
como un péptido catiónico.
La diferencia de acción entre la proteína nativa, lactoferrina, y
su péptido activo, lactoferricina, nos llevo a la búsqueda de
una secuencia común que pudiese justificar una actividad
antimicrobiana común. El péptido sintético homólogo a esa
secuencia fue denominado Kaliocina-1, el cual está presente
en las transferrinas, (3;4) y su actividad antimicrobiana y
efectos celulares fueron estudiados comparándolos con los de
la proteína nativa, lactoferrina humana, y con el péptido
catiónico derivado de ella, Lfpep.
En este estudio los datos obtenidos con el péptido Lfpep y
lactoferrina fueron utilizados como control con el fin de
comparar los efectos de Kaliocina-1 con los de esta moléculas
(5).
1.1. PROTEÍNAS ANTIMICROBIANAS: TRANSFERRINAS
Las transferrinas son una importante familia de
glicoproteínas formadas todas ellas por un único polipéptido,
su masa molecular esta comprendida entre 76000-81000 Da.
Característica común a todas las proteínas de este grupo es su
gran afinidad por iones de hierro, al que captan en su forma
ferrica (6).
Están distribuidas en todos los fluidos biológicos de
vertebrados (7) e invertebrados (8), aunque algunas de ellas
no son proteínas solubles sino que se encuentran fijadas a la
superficie celular (ej.: melanotransferrina).
Se consideran representantes de la familia de las transferrinas a:
• transferrina del suero o serotransferrina (9) o siderofilina (10).
• lactoferrina o lactotrasferrina (11; 12;13).
• ovotransferrina o conalbúmina (14;15).
• melanotransferrina (16)
La molécula de las transferrinas está subdividida en dos
lóbulos, cada uno de ellos presenta un sitio de unión para el
ión férrico (17; 18), de manera que cada molécula puede
captar dos iones de hierro en presencia de bicarbonato.
La similitud de la secuencia de aminoácidos (residuos
idénticos en las mismas posiciones) entre transferrina del
suero y ovotransferrina con respecto lactoferrina es de un
29% y 49% respectivamente. La identidad entre la
ovotransferrina y transferrina del suero es de un 51%, y entre
la transferrina del suero y la melanotransferrina es de un 39%
(19). En el extremo C-terminal es donde se encuentra una
mayor homología entre ambas proteínas.
El punto isoeléctrico de estas proteínas permite clasificar a las
transferrinas en dos grupos: uno formado por la transferrina
del suero y la ovotransferrina, que posee un carácter aniónico
(pI ~ 5,5) a pH fisiológico (20). El segundo tipo estaría
representado por lactoferrina, una proteína muy catiónica (pI
~ 8,5) (21).
La transferrina más estudiada a nivel estructural y funcional
es la lactoferrina, una glicoproteína con una masa molecular
aproximada de 80.000 Da (22), la cual tiene dos glicanos
unidos por un enlace N-glicosídico (23). Esta proteína se
encuentra presente en la leche, lágrimas, secreciones
vaginales, fluido broncoalveolar, gránulos de
polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) y en sangre. Las
concentraciones en que se encuentran en los fluidos citados
se recogen en la tabla I, siendo más abundantes en las
Tabla I. Concentración de la lactoferrina en los distintos fluidos
biológicos humanos.
Fluidos biológicos Concentración Referencias
Calostro 150 μmol/L (13;24)
Lágrimas 20 μmol/L (25)(26)
Secreciones pulmonares 9-14 μmol/L (27;28)
Fluído crevicular 2,5-11 μmol/L (29)
Saliva humana 0,6-1,2 μmol/L (30)
Sangre 0,001 μmol/L (31)
secreciones mucosas donde probablemente ejerce su principal
función fisiológica, puesto que en caso de infección suele
aumentar su concentración. Por ejemplo, en infecciones de la
glándula parotídea pueden alcanzar concentraciones de 14
g/L en el fluido parotídeo.
Debido a la facilidad con que lactoferrina capta hierro se
considera que su principal función fisiológica es transportar
este ión hasta los epitelios absortivos intestinales, siendo una
de las principales fuentes de hierro para el recién nacido. Por
otra parte, la captura de hierro por esta molécula, ha sido
considerada la causa de su poder bacteriostático/bactericida y
fungicida, el cual ejerce sobre una gran variedad de
microorganismos (32; 33; 34; 35; 36) incluyendo Candida spp.
(37; 38). Esta acción ha sido explicada en base a que
lactoferrina retira de los fluidos biológicos un ión que es
esencial para la supervivencia y multiplicación bacteriana.
[37]

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También ha sido propuesto un segundo mecanismo, que
consistiría en una acción desintegradora de la membrana
celular, de manera que lactoferrina causaría la liberación de
lipopolisacáridos (39) alterando la estructura de la membrana
externa de las bacterias Gram negativas y que se traduce
además en un aumento de la susceptibilidad a antibióticos
hidrófobicos y a la lisozima humana (40). Este mecanismo de
acción estaría justificado por el carácter altamente catiónico
de la proteína, de manera que su comportamiento sería
similar al de otros agentes policatiónicos entre los que se
incluyen polilisina, protamina, polymixina B, polimixina B
nonapéptido y algunas proteínas catiónicas aisladas de los
polimorfonucleares neutrófilos. Esta acción podría ser
mediada por los primeros 47 aminoácidos (lactoferricina) del
extremo aminoterminal de lactoferrina, puesto que se ha
observado que esa región, obtenida por digestión enzimática
o sintetizada, es capaz de causar la muerte de bacterias y
hongos (41; 42).
Más recientemente, se ha descrito una interacción de
lactoferrina con las porinas OmpF y OmpC de la membrana
externa de Escherichia coli y se ha propuesto que esta
interacción podría causar alteraciones en la permeabilidad de
la membrana externa (43).
Últimamente, nuestro grupo ha demostrado la existencia de
nuevas propiedades de las transferrinas que podrían explicar
el mecanismo de la acción antimicrobiana de la lactoferrina.
Los datos obtenidos mostraron que lactoferrina es capaz de
permear selectivamente iones potasio a través de la
membrana citoplasmática de E. coli. Esta acción selectiva
causa una pérdida del potencial eléctrico de la membrana
celular sin afectar al gradiente de protones, de manera que la
célula ve reducida la fuerza protón motriz, pudiendo explicar
el efecto bacteriostático mostrado por esta proteína sobre esa
especie bacteriana.
De la digestión enzimática de lactoferrina y ovotransferrina
se obtienen péptidos con actividad antimicrobiana mayor que
la presentada por las proteínas nativas. Producto de esas
digestiones enzimáticas son dos péptidos diferentes
denominados lactoferricina (44; 45) y OTAP-92 (46), que han
sido obtenidos de lactoferrina y ovotrasferrina
respectivamente. Estos péptidos tienen algunos puntos en
común:
• Se encuentran ambos en el extremo N-terminal.
• Tienen puentes de disulfuro, en el caso de lactoferricina
tiene uno y OTAP-92 tienen tres.
• Poseen un gran número de aminoácidos básicos que les
confiere su carácter catiónico, al que deben su gran afinidad
por membranas de carácter aniónico.
• Son moléculas anfipáticas.
También se han obtenido péptidos sintéticos derivados del
dominio N-terminal donde se localiza la lactoferricina,
incluyen el dominio α-hélice tanto de lactoferrina humana
como de la bovina, aunque todos ellos podrían ser
[38]
considerados como derivados a su vez de la lactoferricina (47;
48).
La estructura del péptido sintético derivado de la
lactoferricina humana del aminoácido denominado Lfpep ,
incluye la región comprendida ente los aminoácidos 17 y 39,
donde se incluye el puente de disulfuro no fundamental para
su acción.
Se ha llevado a cabo diferentes revisiones (49) sobre los
distintos péptidos derivados de la lactoferrina que presentan
actividad antifungica, antiviral y antitumoral.
1.2. La defensa inespecífica en los organismos
pluricelulares: péptidos catiónicos antimicrobianos.
La colonización de nuestras superficies epiteliales y mucosas
por los microorganismos ambientales es un hecho natural
ineludible puesto que nuestro hábitat se desenvuelve en un
mundo donde los seres vivos más numerosos, con mayor
diversidad biológica y mayor capacidad de adaptación al
medio son los microorganismos. La mayoría de los seres
multicelulares han resuelto el problema de la colonización
permitiendo el establecimiento de un número determinado de
especies microbianas (microbiota normal), las cuales han
formado sus propios ecosistemas adaptados al nuevo hábitat.
Esta simbiosis beneficia al hospedador, ya que la microbiota
normal al defenderse de otros microorganismos que intentan
colonizar ese ambiente (microbiota transitoria) también
defiende al hospedador. Las interacciones que se establece
entre los simbiontes se denominan relaciones hospedadorparásito.
Esta relación se mantiene en equilibrio mientras el
hospedador conserve su capacidad de respuesta frente a un
estímulo antigénico que, en el caso de la microbiota normal,
es permanente.
Los animales vertebrados han desarrollado los mecanismos
defensivos más complejos, puesto que son hospedadores de
un gran número de microorganismos altamente
especializados en colonizar superficies. Estos mecanismos
están organizados básicamente en dos bloques: inmunidad
inespecífica (innata) e inmunidad específica (adquirida). Las
superficies mucosas son protegidas mayoritariamente por la
acción de la inmunidad inespecífica, cuyos componentes son
más abundantes en los fluidos que recubren las mucosas,
siendo secretados en saliva, lágrimas, secreciones intestinales,
secreciones genitales y otras secreciones mucosas. En la
especie humana, los principales elementos que constituyen
esta primera barrera defensiva son péptidos catiónicos tales
como las defensinas, histatinas o “bactericidal permeability
increasing protein” o proteínas como lisozima,
lactoperoxidasa y lactoferrina, entre otros.
La inmunidad específica participa en la defensa de las
mucosas, mediante elementos celulares y fundamentalmente
mediante la secreción de la inmunoglobulina A (IgA), la cual
posee una alta capacidad para neutralizar específicamente

antígenos insolubles, impidiendo la adhesión bacteriana a la
superficie de las células epiteliales de las mucosas.
En los últimos años la bibliografía internacional viene
prestando un interés creciente en las defensas inespecíficas de
los seres vivos. Particularmente, muchos de los estudios
realizados y publicados centran su atención en los
denominados péptidos catiónicos (50). Estos péptidos
naturales, podrían ser definidos como péptidos
antimicrobianos, sintetizados por los ribosomas, constituídos
por secuencias entre 15 y 50 aminoácidos, de los cuales el 50%
de los residuos son hidrofóbicos y al menos dos de ellos
poseen carga positiva (Lys o Arg) (51). La existencia de estos
péptidos antimicrobianos ha sido constatada en todas las
especies estudiadas, incluyendo animales y vegetales. La
amplia distribución en la naturaleza de este modelo de
defensa sugiere que los péptidos antimicrobianos desempeñan
una importante función antiinfecciosa, al menos suficiente
para mantener libre de infección a la mayoría de los seres
pluricelulares. Este argumento se ve reforzado por el hecho de
que la inmunidad específica, que reúne unos mecanismos
más eficientes en la lucha contra los microorganismos,
aparece tardíamente en la escala evolutiva al constituirse
como un sistema (sistema inmune) exclusivo de los animales
vertebrados.
Independientemente del interés intelectual que posee el
conocimiento del modo de acción de los péptidos catiónicos
como agentes antimicrobianos, su estudio reúne además un
interés adicional para el investigador, haciéndonos reflexionar
sobre las distintas estrategias defensivas que han ido
desarrollando los seres vivos a lo largo de su camino
evolutivo. Una simple observación al tipo de armamentarium
defensivo que utilizan los microorganismos y los organismos
multicelulares, nos muestra la diferente opción estratégica
que han desarrollado para mantener su individualidad. Los
microorganismos, y principalmente las especies bacterianas y
hongos, han desarrollado moléculas químicas con actividad
antimicrobiana (antibióticos), no sintetizadas en los
ribosomas, con las cuales eliminan a sus competidores para
conseguir los nutrientes necesarios. Esta forma de defensa ha
sido en parte contrarrestada por sus competidores, en quienes
la selección natural ha ido perfeccionando sofisticados
mecanismos de resistencia a la acción de los antibióticos,
apareciendo así cepas resistentes. De una manera
especulativa, podríamos sugerir, que la capacidad de resistir a
la acción de los antibióticos ha contribuido quizás, junto a
otros mecanismos, a la asociación de microorganismos que
logran así defender su nicho ecológico frente a especies no
deseadas, permitiendo la formación de ecosistemas
microbianos con simbiontes menos competitivos.
Desafortunadamente, esta habilidad de escapar a la acción de
los antibióticos ha tenido un grave inconveniente para su uso
médico: la selección progresiva de cepas resistentes en
ambientes hospitalarios, con la consiguiente pérdida de su
aplicación terapéutica.
Probablemente debido a la facilidad por la cual algunas
especies microbianas pueden adquirir y transferir resistencia
a un antibiótico, los seres pluricelulares organizaron sus
primitivos mecanismos de defensa en base a la acción de
algunos péptidos, que por su naturaleza catiónica e
hidrofóbica, eran capaces de permeabilizar la membrana
citoplasmática causando daños irreversibles a la célula. Este
tipo de estrategia defensiva, frente a la que parece ser más
difícil desarrollar resistencias (52) , ha tenido un gran éxito
evolutivo, reflejado en el hecho de que tanto plantas como
animales no sintetizan antibióticos (moléculas químicas) sino
que secretan péptidos catiónicos y proteínas, con actividad
antimicrobiana. La estrategia de “dañar a la membrana
plasmática” parece tan eficaz que incluso se ha organizado en
sistemas de alta complejidad, tales como el sistema del
complemento de los vertebrados, el cual a través del llamado
“complejo de ataque a la membrana” constituye el mecanismo
efector humoral más poderoso de nuestras defensas. Por otra
parte, la gran importancia que tiene el mantenimiento de la
integridad de la membrana plasmática para todos los procesos
bioenergéticos de la célula podría explicar el motivo de que
esta estructura sea la diana de los péptidos catiónicos.
El éxito evolutivo de los péptidos antibióticos sobre las
moléculas químicas antibióticas podría ser debido a la
dificultad, que parece experimentar la célula procariota o
eucariota, para desarrollar un mecanismo de resistencia
frente a agentes que alteren la permeabilidad de su membrana
(53).
Si admitimos que la estrategia defensiva desarrollada por los
organismos pluricelulares, basada en péptidos/proteínas, es
más eficaz que la aún conservada por los microorganismos,
consistente en moléculas químicas (antibióticos), tenemos que
concluir que todo esfuerzo encaminado a la investigación y
desarrollo de péptidos y proteínas con propiedades
antimicrobianas, encierra un gran potencial terapéutico. Esta
potencial aplicación médica de péptidos y proteínas
antimicrobianas basa su interés en su escasa capacidad para
seleccionar cepas de microorganismos resistentes.
1.3. Clasificación de los péptidos catiónicos
antimicrobianos
En la actualidad se han descrito alrededor de 500 péptidos
catiónicos antimicrobianos, procedentes de diferentes
especies de plantas, insectos, crustáceos, anfibios, aves, peces
y animales mamíferos, incluyendo al hombre (54). La
clasificación de los péptidos antimicrobianos es arbitraria
debido a la variedad de estructuras que incluyen y a la
existencia de análogos estructurales y funcionales que pueden
ser incluidos en categorías diferentes (55). A pesar de estas
dificultades se ha intentado agruparlos según la semejanza de
su estructura, de manera que actualmente se clasifican en seis
[39]

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grupos diferentes (56):
1- Péptidos lineales, con hélices anfipáticas e hidrofóbicas.
2- Péptidos cíclicos, con estructuras de lámina β.
3- Péptidos con aminoácidos inusuales.
4- Péptidos cíclicos con grupos tioéster en el anillo
5- Lipopéptidos
6- Péptidos macrocíclicos
1.4. Mecanismo de acción de péptidos catiónicos
1.4.1. MECANISMO DE ACCIÓN EN BACTERIAS
Algunos péptidos son capaces de unirse a los
lipopolisacáridos, (LPS), permeabilizando la membrana
externa de los Gram negativos (57).
Esta acción es debida a que los LPS poseen una afinidad por
estos péptidos que es tres veces superior a la que poseen por
los cationes Ca+ y Mg+, de manera que el péptido desplaza
competitivamente a los cationes divalentes estabilizadores de
la membrana causando la disrupción de la misma. En otros
casos, en los que el péptido tiene una baja afinidad por los
LPS, se ha propuesto la existencia de fracturas (cracks)
espontáneas en la membrana a través de las cuales podrían
pasar distintas moléculas incluyendo al propio péptido. Las
bacterias Gram positivas carecen de membrana externa y no
poseen LPS, en su lugar presentan una gruesa capa de
peptidoglucano rica en ácidos teicoicos. Se ha observado que
cepas mutantes con un aumento de su carga negativa
superficial son más sensibles a la acción de los péptidos
catiónicos antimicrobianos, mostrando la importancia que
tienen para el mecanismo de acción las interacciones
electrostáticas.
Los eventos que ocurren una vez superada la barrera que
representa la membrana externa son menos conocidos (56).
Muchos péptidos se insertan en la membrana citoplasmática
haciéndola permeable a distintos iones y moléculas. Algunos
péptidos interaccionan con los fosfolípidos, cargados
negativamente de la membrana citoplasmática (membrana
interna). Se han sugerido distintas hipótesis para describir
esta interacción: a) tapizado: las moléculas de péptido saturan
la superficie de la membrana citoplasmática después causan
una disrupción de la membrana permeabilizándola (58); b)
duelas de barril: se unen monómeros en la membrana y se
insertan en la membrana formando un poro, el tamaño del
poro aumenta al agregarse más monómeros (59) c) formación
de poros: la agregación de péptidos en la membrana causa una
rotura y el paso de iones.
Otros péptidos (ej.: indolicidina, bactenecina) no
interaccionan con la membrana plasmática y ha sido
propuesto que su acción es debida a su capacidad para
atravesar la membrana plasmática, actuando posteriormente
sobre los ácidos nucleicos o desencadenando un proceso de
autolisis celular (54). En la tabla II se muestran una relación
de péptidos antimicrobianos y algunas de sus características.
[40]
Tabla II. Características de algunos péptidos antimicrobianos.
PéPTIDO (a) (b) ORIGEN REF.
ANDROCTONINA +8 2 Androctonus australis
(hemolinfa del escorpión)
(60)
DEFENSINA A +3 3 Phormia terranovae
(hemolinfa de larva de
mosca)
(61;62)
MAGAININA 1 +3 0 Xenopus laevis
(piel de la rana)
(63;64)
DEFENSINA DE
RATA
+7 3 Neutrófilos de ratas (65)
MELITINA +5 0 Apis mellifera
(veneno de abeja de miel)
(66)
BOMBOLITINA III +2 0 Megabonbus
pennsylvanicus
(veneno del abejorro)
(67)
CARDIOTOXINA I +10 4 Noja mo, mossambiaca
(veneno de la cobra)
(68)
NISINA Z +3 5 Lactococcus lactis (69;70)
LISINA δ +1 0 Staphylococcus aureus (71)
GRAMICIDINA A
(a) carga neta a pH 7,0
0 0 Bacillus brevis (72;73)
(b) número de puentes de disulfuro
1.4.2. MECANISMO DE ACCIÓN EN HONGOS
El mecanismo de acción de péptidos que poseen actividad
antifúngica no es bien conocido y no siempre existen estudios
completos que demuestren cual es su diana celular. Por esta
razón podríamos clasificarlos según su modo de acción en
tres grandes grupos: a) Péptidos que actúan sobre la
membrana citoplasmática. b) Péptidos que actúan sobre
elementos intracelulares. c) Péptidos que actúan sobre rutas
biosintéticas.
Reseñando los ejemplos mejor conocidos de cada grupo,
podemos incluir como representantes del primero de ellos a
los péptidos de la familia de las dermaseptinas. Estos péptidos
han sido aislados a partir de extractos cutáneos de la rana
Philomedusa sauvagii (74). Las dermaseptinas inhiben el
crecimiento de diversas especies de hongos y ha sido sugerido
que esta acción es debida a una disrupción de la membrana
citoplasmática y posterior lisis celular, hipótesis
exclusivamente derivada de estudios realizados con liposomas
(75; 76). Otros péptidos que actúan sobre la misma diana
molecular son: defensinas, protegrinas, tripticina,
lactoferricina, cecropinas, drosomicina, magainina, iturina,
bacilomicina F, siringomicina, siringostatina y siringotoxina
(77).
Entre los péptidos que actuan sobre elementos intracelulares,
el más estudiado es histatina-5, uno de los doce péptidos
pertenecientes a la familia de péptidos ricos en histidinas y
bajo peso molecular presentes en la saliva humana (78; 79).

Este péptido alcanza el citoplasma de C. albicans, se une
posteriormente a las mitocondrias y causa la pérdida del
potencial transmembrana mitocondrial causando la muerte
celular (80; 81).
Los péptidos que inhiben rutas biosintéticas actúan
generalmente sobre la biosíntesis de la quitina (nikkomicinas,
polioxinas, FR-900403) o la síntesis del glucano
(equinocandinas y sus análogos, neumocandinas y sus
análogos, aculeacinas, mulundocandinas y aureobasidinas).
La tabla III reúne un grupo de péptidos con actividad
antifúngica, clasificados según su origen, y la tabla IV los
clasifica según su modo de acción (77).
Tabla III. Clasificación de los péptidos antifúngicos según su origen.
Péptidos aislados de mamíferos
Defensinas
Protegrinas y gallinacinas
Tripticina y lactoferricina
BPI proteína análoga al dominio III
Péptidos antifúngicos aislados de insectos
Cecropinas
Drosomicina
Holotricina 3, thanatina
Péptidos aislados anfibios
Magainina y dermaseptina
Péptidos antifúngicos sintetizados por bacterias y hongos
Iturinas
Siringomicinas y péptidos relacionados
Otros péptidos antifúngicos derivados de bacterias y hongos
Péptidos aislados bacillus licheniformis CB-1, M-4,
Schizotrina A
Cepacidinas
Péptidos 1907-II y 1907-VIII
Grupo de leucinostatina-tricopolina
Helioferinas
Péptidos antifúngicos de plantas
Defensinas de plantas
Proteínas de transferencia de lípidos
Zeamatina
Ciclopeptides
Péptidos sintéticos
D4e1
Tabla IV. Clasificación de los péptidos catiónicos según su modo de
acción.
Péptidos inhibidores de la síntesis de quitina
Nikkomicina
Polioxina
Péptido fr-9000403
Péptidos que afectan a la síntesis de glucano
Echinocandinas y análogos
Neumocandinas y análogos
Aculeacinas
Mulundocandinas
Grupo wf11899
Aureobasidinas
OBJETIVOS DEL TRABAJO
El trabajo ha tenido como objetivo final la identificación y
determinación del mecanismo de acción antimicrobiano de
un péptido sintético derivado de lactoferrina humana,
denominado Kaliocina-1. Para ello se fijaron los siguientes
objetivos:
1- Determinación de la concentración mínima inhibitoria del
Kaliocina-1 para una serie de cepas bacterianas.
2- Determinación de los cambios en la permeabilidad de
membrana tanto de la membrana externa como la interna.
3- Determinación del flujo de iones a través de la membrana
citoplasmática.
4- Evaluación de cambios en el potencial eléctrico y gradiente
de protones.
5- Determinación de la actividad hemolítica de Kaliocina-1.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Materiales
2.1.1. MICROORGANISMOS
Para la realización de este estudio se utilizaron las cepas tipo
de la American Type Culture Collection (ATCC) y aislados
clínicos procedentes del Servicio de Microbiologia del
Hospital Central de Asturias que se relacionan a
continuación:
Bacterias Gram-negativas: Echerichia coli ML-35, Morganella
morganii, Pseudomona eruroginosa, Salmonella typhimurium.
Bacterias Gram-positivas: Kocuria rosea ATCC 2340
(Micrococcus roseus), Staphylococcus aureus, Staphylococcus
hemolyticus, Streptococcus mitis.
E. coli ML-35 se caracteriza por ser una cepa deficiente en
una permeasa de lactosa, pero conservando en su citoplasma
la actividad β-galactosidasa (mutaciones lac I y lac Y, lac Z+).
2.1.2. PRODUCTOS, TAMPONES Y MEDIOS
Las proteínas utilizadas lactoferrina, ovotransferrina y
transferrina en sus formas no saturadas de hierro fueron
obtenidas de Sigma Chemicals, Co. (St. Louis, MO). La pureza
de la proteína fue comprobada como describió de Lillo et al.
(1997) (82). Las sondas fluorescentes DiSC3(5), BCECF fueron
compradas a Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR).
Gramicidina S, NPN, ONPG fueron adquiridos a Sigma.
2.1.3. OBTENCIÓN DE LOS PéPTIDOS
2.1.3.1. Obtención del péptido kaliocina-1
El péptido Kaliocina-1 corresponde a los residuos 153 a 183
del extremo amino de la lactoferrina humana e incluye el
Cys-motif (Cys 158 -Cys 174 , Cys 171 -Cys 182 ). La estructura Cysmotif
de la familia de las transferrinas es definida por la
posición de dos pares de puentes de disulfuro que se
[41]

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encuentran conservadas (tres en el lóbulo amino terminal de
la transferrina). Un Cys-motif similar está presente en el
extremo carboxilo terminal de la familia de las transferrinas.
Kaliocina-1 fue sintetizado por Chiron Mimotopes Pty.
(Chiron, Australia) con la secuencia siguiente:
NH2-FFSASCVPGADKGQFPNELCRLCAGTGENKCA-COOH
La purificación del péptido fue llevada a cabo mediante
cromatografía de fase líquida de alta resolución (HPLC) por
Chiron Mimotopes Pty.
2.1.3.2. Obtención del péptido sintético lfpep.
La secuencia de aminoácidos del péptido Lfpep utilizado se
corresponde con una región homóloga presente en la
molécula de la lactoferrina humana. Este péptido forma parte
de la secuencia denominada lactoferricina, considerada la
región que conserva la actividad antimicrobiana de
lactoferrina. Además, el péptido posee una región rica en
cargas positivas que se corresponde con la región por la cual
lactoferrina se une a los lipopolisacáridos bacterianos.
El péptido incluye la región comprendida ente los
aminoácidos 17 y 39 inclusive, del extremo N-terminal de
lactoferrina humana (83) y fue sintetizado por Chiron
Mimotopes Pty. (Chayron, Australia) con la secuencia
siguiente:
NH2-TKCFQWRNMRVVRGPPVSCIK-COOH
La purificación del péptido fue llevada a cabo mediante
cromatografía de fase líquida de alta resolución (HPLC) por
Chiron Mimotopes Pty.
2.2. Métodos
2.2.1. ENSAYOS ANTIMICROBIANOS
La determinación de la concentración mínima inhibitoria
(C.M.I.) fue realizada en placas estériles de 96 pocillos
usando por el método de diluciones dobles (88). Se utilizaron
placas de polipropileno para evitar la captura inespecífica del
péptido por el soporte, siguiendo las recomendaciones
descritas por Hancock y Chapple (1999) (51) y Giacometti et
al. (2000) (84). Cada pocillo contenía una suspensión de
bacterias (1× 105 u.f.c./ml) en 1% y 0,3% de bacto-peptona, los
intervalos de concentración de péptidos y proteínas ensayadas
fueron: Kaliocina-1 (0,016 a 200 μM), Lfpep (0,016 a 100 μM),
lactoferrina humana (0,2 a 50 μmol/L), transferrina humana
(0,2 a 150 μmol/L) y ovotransferrina (0,2 a 100 μmol/L) en un
volumen final de 100 μl. Las placas fueron incubadas a 37°C
durante 24 horas. Se consideró como C.M.I. a la
concentración más baja tanto de péptidos como de proteínas
que inhibieron completamente el crecimiento bacteriano
visible a las 24 horas.
Para determinar la actividad bactericida del péptido se
utilizaron una concentración de Kaliocina-1 o de lactoferrina
humana inhibitorias del crecimiento, el cual fue
monitorizado para un Gram-negativo (E. coli) y para un
Gram-positivo (K. rosea), llevado a cabo en un tampón 5 mM
[42]
de PPB (pH 7,0).
2.2.2. ENSAYOS DE PERMEABILIDAD
2.2.2.1. Permeabilidad de la membrana externa
La membrana externa de Gram-negativos representa una
fuerte barrera compuesta por agentes lipídicos. La actividad
permeabilizadora de los péptidos y lactoferrina sobre la
membrana externa fue determinada en E. coli ML-35
utilizando el ensayo del NPN (1-N-phenylnapthylamine) (85).
El NPN es un compuesto hidrofóbico que fluoresce
débilmente en un ambiente acuoso y fuertemente cuando
entra en un ambiente hidrofóbico, como el interior de la
membrana, pero que es excluido de las bacterias Gramnegativaas,
de manera que un aumento de la fluorescencia de
estas bacterias es indicativo de la permeabilización de la
membrana (figura 1).
Figura 1. Evaluación de la integridad de la membrana externa mediante
el ensayo de 1-N-phenylnapthylamine (NPN). A. La membrana externa
se encuentra intacta no pudiendo atravesarla el NPN. B. Cuando
la membrana está dañada es atravesada por el NPN, al estar en un
ambiente hidrofóbico aumenta su fluorescencia.
(a) lipopolisacárido, (b) membrana externa, (c) proteínas de anclaje,
(d) peptidoglucano, (e) membrana interna.
A partir de un cultivo bacteriano en fase logarítmica de
crecimiento se obtuvo una suspensión celular en el tampón (5
mM Hepes, pH 7,2) y se ajustó a 1×106 u.f.c./ml. Los
intervalos de concentraciones de péptidos y proteína
ensayados fueron Kaliocina-1 de 75 a 175 μM, Lfpep de 6 a 35
μmol/L y de lactoferrina fueron de 0,2 a 50 μmol/L. En los
ensayos de permeabilidad se añadió NPN (10 μM) a la
suspensión bacteriana. Los cambios en la intensidad de
fluorescencia fueron medidos en un espectrofluorímetro LS-
50 (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT) a una longitud de
onda de excitación y emisión de 350 nm y 420 nm,
respectivamente.
2.2.2.2. Permeabilidad de la membrana interna
La permeabilidad de la membrana interna de E. coli ML-35
fue determinada por la medida de la actividad
β-galactosidasa. El mutante utilizado se caracteriza por ser
impermeable al ONPG (o-Nitrophenyl beta-Dgalactopyranoside),
un sustrato para la actividad
β-galactosidasa (figura 2). La rotura de la molécula ONPG es
un indicador de permeabilidad de la membrana interna.

Figura 2. Evaluación de la permeabilidad de la membrana interna
utilizando la sonda –Nitrophenil beta-D-Glactopyranosido (ONPG).
A. La membrana interna se encuentra intacta no pudiendo penetrar la
molécula de ONPG, E. coli ML-35 es deficiente en una permeasa. B.
Cuando la membrana interna está dañada puede ser atravesada por
el ONPG poniéndose en contacto con el enzima citoplasmático que la
degrada dando un producto fluorescente.
(a) lipopolisacárido, (b) membrana externa, (c) proteínas de anclaje,
(d) peptidoglucano, (e) membrana interna, (f) citoplasma.
Las células cultivadas hasta su fase logarítmica de crecimiento
fueron lavadas en 5 mM de PPB (pH 7,4) y ajustadas a 1×106
u.f.c./ml en el mismo tampón que contenía 1,5 mmol/L de
ONPG. Se ensayaron concentraciones de kaliocina-1 (75-175
μmol/L), lactoferrina humana (6-35 μmol/L) y Lfpep (13
μmol/L). La hidrólisis de ONPG produce σ-nitrophenol que
puede ser detectado mediante una monitorización de la
muestra a 420 nm en un espectrofotómetro (UVIKON, mod.
930 KONTRON INSTRUMENTS). La actividad total de
β-galactosidasa se determinó lisando las células por
ultrasonicación (Soniprep 150, MSE, West Sussex, U. K.).
2.2.3. MEDIDA DE IONES EXTRACELULARES
Se cultivó E. coli ML-35 hasta alcanzar la fase logarítmica de
crecimiento en ese momento las células fueron recogidas
mediante centrifugación (5000 X g) y resuspendidas en un
volumen similar de agua MilliQ. Esta operación fue repetida
cuatro veces para eliminar restos de cultivo y disminuir la
presencia de los iones que se pretendía determinar.
Finalmente, las células fueron resuspendidas en agua MilliQ
nuevamente.
El ensayo fue realizado utilizando 200 μl de la suspensión
celular (A620 = 2) a la que fue añadido Kaliocina-1 (170
μmol/L), lactoferrina humana (25 μmol/L) y Lfpep (50
μmol/L), todas ellas concentraciones inhibidoras del
crecimiento. Se incubaron durante diferentes tiempos y se
centrifugó la suspensión celular (5000 x g), posteriormente en
el sobrenadante se determinó la concentración de los iones
Na+ y K+. El sobrenadante fue extraído, evitando el
desplazamiento del sedimento celular, y trasvasado a un tubo
estéril. La concentración de Na+ y K+ fue determinada
utilizando un espectrofotómetro de llama UNICAM 929
(Unicam Limited, Cambridge, U.K). Células no tratadas
fueron utilizadas como control.
Se determinó simultáneamente la presencia de cationes en el
agua desionizada utilizada para preparar la suspensión
celular o para disolver los péptidos y las proteína. Para ello a
un volumen igual al ensayado de agua MilliQ se añadió el
mismo volumen de la disolución de los péptidos y las
proteínas, con el fin de determinar la concentración de
cationes aportados por ellos en la muestra de células tratadas.
Se utilizaron también cinco patrones para cada recta patrón,
es decir, una para el Na+ y otra para el K+, estos patrones se
realizaron utilizando soluciones stock de NaCl y KCl,
respectivamente.
2.2.4. MEDIDA DEL POTENCIAL ELéCTRICO BACTERIANO
Los cambios en el potencial eléctrico (ΔΨ) de E. coli fueron
determinados con la sonda fluorescente DiSC3(5)
(3,3´-dipropylthiadicarbocyanine iodide) como describió
Schuldiner y Kaback (1975) (86). Células crecidas hasta la fase
logarítmica fueron lavadas y ajustadas a una absorbancia de
0,05 a 600 nm, en el tampón 100 mM de fosfato potásico, 20
mM de glucosa y 5 mM de Hepes (pH 7,0). La sonda DiSC3(5)
(1 mM) fue añadida posteriormente a la suspensión. Se
ensayo un intervalo de concentraciones de Kaliocina-1 (10 -
150 μmol/L), Lfpep (10 - 25 μmol/L) y de lactoferrina (3 - 25
μmol/L).
Los cambios en la fluorescencia de DiSC3(5) fueron
monitorizados usando un espectrofluorímetro a una
excitación de 643 nm y una emisión de 666 nm. Cuando las
células lo requirieron fueron permeabilizadas con 1mM
EDTA para facilitar la actuación de la valinomicina.
2.2.5. CAMBIOS EN EL pH INTRACELULAR
Los cambios en el pH celular fueron determinados utilizando
la sonda fluorescente BCECF (2´,7´´-bis-(2-cargoxyethyl)-5-
(y-6-)-carboxyfluorescein), que se caracteriza por cambiar su
fluorescencia según el pH de medio como describió Molenaar
et al. (1991) (87). Las células fueron recogidas cuando
alcanzaron la fase logarítmica de crecimiento, y fueron
lavadas y resuspendidas en 5 mM de PPB (pH 7,0). La
suspensión celular fue ajustada a 1 × 106 celulas/ml y
posteriormente fue sometida a un shock ácido (50 mM de HCl
durante 6 minutos) para facilitar la penetración de la sonda.
En los ensayos, los cambios en la intensidad de fluorescencia
fueron monitorizados a 502 nm de excitación y 525 nm de
emisión, mediante un espectrofluorímetro. Se utilizó como
control gramicidina S (40 μmol/L) un agente permeabilizante
de la membrana celular.
2.2.6. ENSAYOS HEMOLÍTICOS
Los ensayos hemolíticos fueron llevados a cabo en placas de
“microtiter” de 96 pocillos utilizando eritrocitos humanos, de
ratón y de conejo. Las células fueron lavadas tres veces con el
tampón (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 mM Hepes, pH
7,4), y entonces a la suspensión de eritrocitos (100 μl) se le
añadieron 10 μl de diluciones seriadas de Kaliocin-1 (6 a 150
[43]

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μmol/L). Como control positivo, es decir, 100% de lisis, se
utilizó una disolución al 0,5% de Triton X-100.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Análisis de similitud de la estructura primaria
En la estructura primaria de las proteínas de las transferrinas
se encuentra una región que incluye dos enlaces de disulfuro
(tres en la transferrina) que pueden ser alineadas con
secuencias homólogas de otras transferrinas (4). Puesto que
algunos péptidos naturales muestran actividad
antimicrobiana y sobre la base de que la región
correspondiente a lactoferricina no esta presente en otras
transferrinas decidimos determinar la actividad
antimicrobiana de la región de lactoferrina que incluía los dos
puentes de disulfuro. Para ello se utilizó un péptido sintético
que incluía la secuencia comprendida entre el residuo 153-183
de la superficie de la molécula de lactoferrina humana (figura
3).
Figura 3. Localización de Kaliocina-1 en la proteína
nativa, lactoferrina humana.
3.2. Actividad antimicrobiana
La concentración inhibitoria mínima de Kaliocina-1
comparada a la de lactoferrina humana, transferrina,
ovotransferrina y Lfpep sobre diferentes bacterias Gram-
positivas y negativas, se resume en la tabla V. Tanto con
Kaliocina-1 como las proteínas no causaron la muerte
bacteriana en los ensayos llevados a cabo en 1% de Bactopeptona
pero sí en los realizados en 0,3% de Bacto-peptona.
Este efecto dependiente del medio de cultivo no tuvo lugar
cuando se utilizó el péptido Lfpep, el cual se mostró activo en
ambos medios. La especie más sensible a Kaliocina-1 fue P.
aeruginosa (C.M.I. de 75 μM), por el contrario S.
typhimurium y M. morganii fueron resistentes a todas las
concentraciones de Kaliocina-1 ensayada aunque también
fueron resistentes al resto de las proteínas ensayadas y a
Lfpep. Tanto lactoferrina humana como transferrina
presentaron un intervalo de acción comprendido entre 1 a 150
[44]
Tabla V. Influencia de la composición del medio en la actividad
antimicrobiana de los péptidos derivados de la lactoferrina y las
transferrinas.
C.I.M
Microorganismos Bacto-peptona (1%) Bacto-peptona (0.3 %)
Kalio- Lfpep hLf hTf Of Kalio- Lfpep hLf hTf Of
cina-1cina-1
Bacterias Gram-negativas
E. coli ML-35 >200 23 >50 >150 >100 100 23 25 9 50
M. morganii >200 >90 >50 >150 >100 200 >90 >50 19 -
P. aeruginosa >200 45 >50 >150 >100 75 45 25 19 -
S. typhimurium >200 23 >50 >150 >100 200 23 >50 75 >100
Bacterias Gram-positivas
K. rosea (M. roseus) >200 - >50 >150 >100 75 6 1 9 25
S. aureus >200 11 >50 >150 >100 75 11 25 19 >100
S. haemolyticus >200 - >50 >150 >100 75 45 50 19 -
S. mitis
(-) no determinado
>200 >90 >50 >150 >100 150 >90 50 - -
μmol/L según la especie, siendo la ovotransferrina la proteína
que presento una menor actividad antimicrobiana.
Por el contrario Lfpep fue capaz de causar la muerte
bacteriana independientemente del medio utilizado y de
actuar sobre todos los microorganismos excepto S.
typhimurium y M. morganii. La actividad antimicrobiana de
lactoferrina humana, ovotransferrina y transferrina fue
observada en todas las cepas ensayadas en el tampón 5 mM
de PPB (pH 7,0), siendo en esa condición siempre bactericida.
La actividad antimicrobiana de lactoferrina humana y
Kaliocina-1 fue inhibida cuando la concentración de sodio y
potasio en el tampón excedió de 40 mmol/L y 20 mmol/L
respectivamente (figura 4).
La cinética de la actividad bactericida de Kaliocina-1 y
lactoferrina humana fue ensayada sobre E. coli y sobre la
especie resistente a lactoferrina K. rosea (de Lillo et al., 1997),
Figura 4. Influencia de la
concentración de cationes
en la actividad bacteriana de
Kaliocina-1 y lactoferrina. La
suspensión de células de E. coli
(1×10 5 u.f.c./ml) fueron incubada
con 150 μmol/L de Kaliocina-1
(arriba) y 25 μmol/L de
lactoferrina humana (abajo) en 5
mM de PPB (pH 7,0) conteniendo
diferentes concentraciones de
K + (azul) y Na + (rosa), durante
24 horas a 37º C. El ensayo
control no contenía Kaliocina-1
ni lactoferrina (blanco). Las
células fueron plaqueadas en
placas conteniendo BHI. Los
resultados fueron la media de
tres experimentos.

a concentraciones dos veces superiores a su C.M.I.,
mostrando una reducción de los viables (>103 u.f.c/ml)
después de 6 horas de incubación (figura 5). La reducción de
la viabilidad de ambas especies se inició a las 2 horas de
incubación. No se observaron viables de E. coli ni de K. rosea
después de 24 horas de tratamiento tanto con Kaliocina-1
como de lactoferrina humana.
Estos ensayos también mostraron la diferente actividad
antimicrobiana de Kaliocina-1 y Lfpep, y la semejanza en el
modo de acción de Kaliocina-1 y lactoferrina humana. Es de
reseñar la lenta acción de Kaliocina-1 respecto a la del péptido
Lfpep, esto hecho parecía indicar una diferencia en el modo
de acción de ambos péptidos.
3.3. Ensayos de permeabilidad
Figura 5. Cinética de muerte de
E. coli y K. rosea por Kaliocina-1
y lactoferrina humana. La
suspensión 1 × 105 u.f.c./ml de
E. coli (líneas continuas) fue
incubada con 200 μmol/L de
Kaliocina-1 (• ) o 25 μmol/L de
lactoferrina humana ( ) en 5 mM
PPB (pH 7,0). La suspension de
K. rosea (líneas intermitentes)
fue ensayada con 150 μmol/L
Kaliocina-1 o 0.6 μmol/L de
lactoferrina humana. Suspensión
celular no tratada y utilizada
como control ( ). A tiempos
distintos se extrajeron alícuotas
y se determinó el número de
unidades formadoras de colonias
(u.f.c.) en BHI agar después de
24 ó 48 horas de incubación a
35º C. Los resultados fueron
la media de tres experimentos
independientes.
3.3.1. PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA EXTERNA
Los cambios en la permeabilidad de la membrana externa
fueron monitorizados utilizando la sonda fluorescente NPN.
En estos ensayos, cuando la membrana externa está dañada se
produce una entrada de NPN que no tiene lugar en
condiciones habituales debido a su naturaleza hidrofóbica.
Después de añadir el compuesto fluorescente, las células se
trataron con Kaliocina-1 (175 μmol/L). En este caso no se
produjo un aumento de fluorescencia indicando que
Kaliocina-1 no fue capaz de permeabilizar la membrana
externa. Al tratar las células con lactoferrina (≥ 6μmol/L) se
observó una pequeña permeabilización de la membrana
externa, la cual no experimentó un incremento cuando se
probaron concentraciones crecientes de dicha proteína. Por el
contrario, el péptido Lfpep (16 μM) provocó una rápida
permeabilización de la membrana externa, tal como se
muestra en la figura 6.
Figura 6. Permeabilización de la
membrana externa de E. coli.
Las células de E. coli (1×105 UFC/ml)
incubadas con NPN fueron tratadas
con 175 μmol/L de Kaliocina-1 (• ),
6 μmol/L lactoferrina humana ( ),
50 μmol/L de Lfpep ( ) o células no
tratadas ( ).
3.3.2. PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA INTERNA
La actividad β-galactosidasa sólo se pone de manifiesto en el
mutante E. coli ML-35 cuando la membrana interna es
permeabilizada debido a que solo así el sustrato ONPG puede
alcanzar el citoplasma, de manera que su transformación da
como resultado un producto fluorescente. Una vez puesto en
contacto el mutante con el sustrato, se trató con Kaliocina-1
(175 μmol/L) no se produjo un aumento de la fluorescencia
indicando que Kaliocina-1 no es capaz de provocar una
permeabilidad de la membrana interna, este mismo resultado
fue obtenido cuando se añadió la proteína lactoferrina (35
μmol/L). Sin embargo, al añadir Lfpep (16 μmol/L) se puso de
manifiesto la actividad β-galactosidasa indicando una
permeabilización de la membrana interna. La máxima
actividad β-galactosidasa fue obtenida al tratar las células con
un sonicador dando el máximo de permeabilidad. Estos
resultados quedan reflejados en la figura 7. Los ensayos de
permeabilidad de las membranas de E. coli muestran la nula
acción de Kaliocina-1 sobre la membrana interna y similar a
la de lactoferrina mientras que el péptido Lfpep permea
rápidamente ambas membranas mostrando un diferente
efecto al péptido Kaliocina-1.
Figura 7. Permeabilidad de
la membrana interna de E.
coli ML-35. La hidrólisis
del sustrato hidrofóbico
ONPG causada por la
actividad β-galactosidasa
del citoplasma incrementó
la fluorescencia. Se trataron
las células con 175 μmol/L
Kaliocina-1 (• ), 35 μmol/L
lactoferrina humana ( ), 50
μmol/L Lfpep ( ) y el control
( ) que consistió en células
sonicadas para obtener la
máxima fluorescencia.
[45]

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3.4. Inducción de salida de potasio por kaliocina-1 sobre
bacterias
La observación del eflujo de potasio y de sodio en células
bacterianas, se realizó con la técnica de espectrofotometría de
emisión atómica en llama. Se utilizó como representante
bacteriano E. coli determinando la concentración de cationes
monovalentes, Na+ y K+, en el fluido extracelular de las
muestras tratadas o no con los péptidos, Kaliocina-1 y Lfpep,
y la proteína lactoferrina.
Ensayos realizados con ambas especies mostraron un
incremento de la concentración extracelular de sodio y
potasio en suspensiones celulares tratadas con el péptido
Lfpep (256 μg/ml) inhibidora del crecimiento celular y
durante un período de incubación de 30 minutos. Por el
contrario las suspensiones celulares tratadas tanto con el
péptido Kaliocina-1 como con lactoferrina humana
presentaron una salida selectiva de potasio. En la figura 8 se
indican los valores obtenidos y expresados en micromolar.
Controles realizados para determinar la concentración de
Na+ y K+ en el agua MilliQ o en la solución stock de Lfpep,
Kaliocina-1 y lactoferrina, y que podían ser aportados a la
mezcla del ensayo, fueron analizados descontándose en su
caso de los valores de las muestras. No se detectó flujo de
cationes en las suspensiones celulares no tratadas.
Los datos obtenidos fueron la media de cuatro
determinaciones diferentes.
En las condiciones ensayadas el incremento de cationes
monovalente en el fluido extracelular sólo pudo ser debido a
un eflujo de cationes intracelulares por la acción de los
péptidos y la proteína ensayados. Estos resultados indican que
el Lfpep causa una permeabilidad inespecífica con eflujo de
ambos cationes monovalentes, por el contrario el péptido
Kaliocina-1 causó una permeabilidad especifica del catión
potasio correspondiéndose con un resultado observado
previamente para lactoferrina y corroborado en este estudio.
Estos ensayos demuestran las diferencias en el modo de
acción de kaliocina-1 respecto a Lfpep y su similitud con la
acción de lactoferrina.
[46]
Figura 8. Cinética de la
salida de potasio en E.
coli. El eflujo de iones
potasio de E. coli durante
la incubación con 175
μmol/L Kaliocina-1 (• ),
25 μmol/L de lactoferrina
humana ( ) y 50 μmol/L de
Lfpep ( ). Los resultados
mostrados fueron la media
de cuatro determinaciones
independientes.
Tanto Kaliocina-1 como lactoferrina permearón solo el ión
potasio, por el contrario Lfpep provocó una salida tanto de
sodio como de potasio. Los datos apoyan además los
resultados obtenidos en los ensayos de permeabilidad de la
membrana de E. coli.
3.5. Medida de cambios en el potencial eléctrico
La presencia de kaliocina-1(≥13 μmol/L) y lactoferrina (≥ 3 μ
mol/L) provocan una lenta disipación del ΔΨ del E. coli como
se muestra en la figura 9. En el ensayo representado en la
gráfica se muestran los cambios en el potencial eléctrico
Figura 9. Efecto de Kaliocina-1, lactoferrina humana y Lfpep sobre el
potencial eléctrico de E. coli. El potencial eléctrico (?) fue medido
usando el indicador fluorescente DiSC3(5) (0.4 μ mol/L ) con
excitación y emisión de 643 nm y 666 nm, respectivamente. Las células
(A600=0.05) fueron resuspendidas en el tampón (100 mM fosfato
potásico, 20 mM de glucosa, 5mM hepes, pH 7.0). Los cambios en el
? fueron monitorizados después de añadir?(flechas inclinadas): 25 μ
mol/L Kaliocina-1 (Kal-1), 6 μ mol/L lactoferrina humana (hLf), 18 μ
mol/L Lfpep y 1 μ mol/L valinomicina (Val). Valinomicina (1 μ mol/L )
fue añadida al finalizar el proceso para alcanzar el máximo grado de
desporalización (flechas verticales).
monitorizados con la sonda DiSC3(5). En este ensayo,
Kaliocina-1 (25 μ mol/L) y lactoferrina (6 μ mol/L) causaron
la máxima disipación después de 37 minutos y 28 minutos,
respectivamente. Por el contrario, al añadir Lfpep (≥ 18 μ
mol/L) se produjo una rápida perdida del ΔΨ de E. coli, y de
una manera similar a la observada en el ensayo control que
incluía células tratadas con valinomicina, un ionóforo
especifico de iones potasio.
3.6. Cambios en el pH intracelular
Las células de E. coli fueron tratadas con la sonda BCECF que
modifica su fluorescencia en función del pH, es decir, al
cambiar el pH del interior de las células provoca un aumento
o disminución de la fluorescencia de la sonda. La adición de
Kaliocina-1 (100 μ mol/L) y lactoferrina (25 μ mol/L) no
produjeron ningún cambio en la intensidad de la
fluorescencia de la sonda, revelando que no tuvieron efectos

sobre el pH intracelular de las células (figura 10). Sin
embargo, Lfpep (≥ 18 μ mol/L) fue capaz de provocar un
Figura 10. Efecto de Kaliocina-1, lactoferrina humana y Lfpep sobre
el pH intracelular de E. coli. Las células fueron cargadas con BCECF
y ajustadas 1 × 106 u.f.c/ml en 50 mM PPB (pH 7,0). Se añadió 100 μ
mol/L Kaliocina-1 (Kal-1), 25 μ mol/L lactoferrina humana (hLf), 50 μ
mol/L Lfpep y gramicidina S (GS), utilizada como control. La gráfica es
una muestra representativa de este tipo de ensayo. La intensidad de
fluorescencia es expresada en unidades arbitrarias (u.a.) respecto al
tiempo expresado en segundos (s).
rápido aumento de la fluorescencia de BCECF siendo similar
al que produjo gramicidina S, utilizado como control.
La perdida selectiva del potencial eléctrico pero no del
gradiente de pH causado por Kaliocina-1 es similar a la
observada para lactoferrina. Este peculiar modo de acción
difiere claramente del observado para el péptido Lfpep, el
cual permea iones inespecíficamente, y difiere claramente del
observado para el péptido Lfpep, el cual permea iones
inespecíficamente, y difiere además del modo de acción
descrito para otros péptidos catiónicos (59). Por otra parte
esta similitud en el modo de acción de Kaliocina-1 y
lactoferrina sugiere que esta región de lactoferrina podría
estar implicada en la acción antimicrobiana de lactoferrina.
3.7. Actividad hemolítica
El péptido sintético Kaliocina-1 no mostró actividad
hemolítica sobre eritrocitos humanos, murinos o de conejo, al
menos hasta la máxima concentración evaluada (150 μmol/L).
Los controles realizados utilizando Tritón X-100 como agente
hemolítico fueron positivos.
4. CONCLUSIONES
1. Se ha definido un nuevo péptido antimicrobiano,
denominado Kaliocina-1, cuya secuencia de aminoácidos se
corresponde con una región homóloga presente en la
superficie de la molécula de la lactoferrina humana.
Secuencias homólogas se encuentran en otras moléculas de la
familia de las transferrinas.
2. La actividad antimicrobiana de Kaliocina-1 fue
dependiente de la concentración de cationes monovalentes
presentes en los ensayos. Es de reseñar que esta dependencia
es exhibida también por la molécula completa de lactoferrina,
así como por transferrina y ovotransferrina, siendo esta la
primera vez que se comunica esta observación.
3. Kaliocina-1 no alteró la permeabilidad de las membranas
externa e interna de E. coli, aunque causó un eflujo selectivo
de iones potasio. Siendo la primera vez que se describe una
acción permeabilizante selectiva para un ión mediada por un
péptido sintético.
4. Kaliocina-1 causó una perdida selectiva del potencial
eléctrico de la membrana citoplasmática de E. coli sin
modificar el gradiente de pH. Este modo de acción, inducido
por la perdida selectiva del potasio intracelular, es similar al
observado previamente por nuestro grupo para la molécula
completa de lactoferrina humana.
5. El péptido Kaliocina-1 no es hemolítico, luego la ausencia
de citoxicidad sumada a su capacidad para mimetizar la
acción antimicrobiana de lactoferrina muestran el potencial
de este péptido y de sus análogos estructurales para su
aplicación terapéutica e industrial.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. Aguilera, O., Quirós, L. M., and Fierro, J.F. “Tranferrins selectively cause
ion efflux through bacterial and artificial membranes” FEBS Lett. 2003;
548: 5-10.
2. Andres, M.T., Viejo-Diaz, M., and Fierro, J.F. “ Human lactoferrin
induces apoptosis-like cell death in Candida albicans: critical role of K+channel-mediated
K+ efflux” Antimicrob Agents Chemotherapy 2008; 52:
4081-4088.
3. Viejo-Diaz, M., Andres, M. T., and Fierro, J.F. “Different anti-Candida
activities of two human lactoferrin-derived peptides, Lfpep and kaliocin-1.”
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2005; 49: 2583-2588.
4. Yount, N.Y., Andres, M. T., Fierro, J. F., and Yeaman M. R. “ The gammacore
motif correlates with antimicrobial activity in cysteine-containing
kaliocin-1 originating from transferrins “ Biochim Biophys Acta 2007;
1768(11):2862-2872.
5. Aguilera, O., Ostolaza, H., Quirós, L. M., and Fierro, J.F. “Permeabilizing
action of an antimicrobial lactoferricin-derived peptide on bacterial and
artificial membranes” 1999; FEBS Lett. 462: 273-277.
6. Flether, J., and Huehns, E. R. “Function of transferrin” Nature 1968;214 :
1211- 1214.
7. Aisen, P., and Listowsky, I. “Iron transport and storage proteins” Ann.
Rev. Biochem. 1980; 49: 357-393.
8. Martin, A. W., Huberts, E., and Webb, J. M. “Structure and funtion of
iron storage and transport proteins” Elsevier Biomedical. London 1983;
259-260.
9. MacGillivray, R. T. A., Méndez, E., and Brew,K. “Proteins of iron
metabolism” Grune and Stratton. Amsterdam. 1977; 133-141.
10. Jeltsch, J. M., and Chambon, P. “ The complete nucleotide sequence of
the chicken ovotransferrin mRNA” Eur. J. Biochem. 1982; 122: 291-295.
11. Sørensen, M., and Sørensen, S. P. L. “The protein in whey” C. R. Lab.
(Carlsberg) (Ser. Chim.) 1939; 23: 55-59.
12. Groves, G., “The isolation of red protein from milk” J. Am. Chem. Soc.
1960; 82: 3345-3349.
13. McClelland, D. B. L., McGrath, J., and Samson, R. R. “Antimicrobial
factors in human milk” Acta Paediatr. 1978; 271: 1-2.
[47]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
14. Williams, S. C., and Woodworth, R. C. “The interaction of ironconalbumin
(anion) complexes with chick embryo red blood cells” J. Biol.
Chem. 1973; 248:5848- 5843.
15. Williams, J. “Iron- binding fragments from the carboxyl-terminal region
of hen ovotransferrin “ Biochem. J. 1975; 149: 237- 244.
16. Rose, T. M., Plowman, G. D., Teplow, D. B., Dreyer, W. J., Hellstrom, K.
E., and Brown, J. P. “Primary structure of the human malanoma-associated
antigen p97 (melanotransferrin) deduced from the mRNA sequence”
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1986;85: 1261-1265.
17. Williams, J., Evans, R. W., and Moreton, K. “The iron-binding properties
of hen ovotransferrin” Biochem. J. 1978; 173: 533-539.
18. Abernethy, J. L., De Preter, J., and Prieels, J. P. “Evidence for an internal
homology in human lactoferrin structure” Arch. Int. Physiol. Biochim.
1980; 88: B12-B13.
19. Metz–Boutigue, M. H., Jollès, J., Mazurier, J., Schoentgen, F., Legrand, D.
Spik, G., et al. “Human lactotransferrin: amino acid sequence and structural
comparisons with other transferrins” Eur. J. Biochem. 1984; 145: 659-676.
20. Keung, W. M., and Azari, P. “Structure and funcion of ovotransferrin” J.
Biol. Chem. 1982; 257: 1184-1188.
21. Moguileusky, N., Retegui, L. A., and Masson, P. L. “Comparision of
human lactoferrins from milk and neutrophilic leucocytes” Biochem. J.
1985; 229: 353-359.
22. Spik, G., and Montreuil, J. “ Comparative studies of the structure of
human transferrin and lactotransferrin. “Fingerprinting” of the protease
hydrolysates of both glycoproteins” C. R. Seances Soc. Biol. Fil. 1966; 160:
94- 98.
23. Querinjean, P., Masson, P .L., and Heremans, J. F. “Molecular weight,
single-chain structure and amino acid composition of human lactoferrin”
Eur. J. Biochem. 1971; 20: 420-425.
24. Baier, G., Wollensak, G., Mur, E., Redl, B., Staffler, G., and Gottinger, W.
“Analysis of human tear proteins by different high-performance liquid
chromatography techniques” J. Chromatogr. 1990; 525: 319-328.
25. Boonstra, A., and Kiljstra, A. “Separation of human tears by high
performans liquid chomatography” Curr. Eye. Res. 1984; 3: 1461-1469.
26. Fullard, R. J. “Identification of proteins in small tear volumes with and
without size exclusion HPLC fraction” Curr. Eye Res. 1988; 7:163-169.
27. Masson, P. L., Heremans, J. F., and Dive, C. “An iron binding protein
common to external secretions” Clin. Chim. Acta 1966;14: 735-739.
28. Tenovuo, J., Lehtonen, O. P., Aaltonen, A. S., Vilja, P., and Tuohimaa, P.
“Antimicrobial factors in whole saliva in human infants” Infect. Immun.
1986; 57: 49-53.
29. Rudney, J. D., and Smith, Q. T. “Relationship between levels of lysozyme,
lactoferrin, salivary peroxidase and secretory immunoglobulin A in
stimulated parotid saliva” Infect. Immun. 1985; 49: 469-475.
30. Cole, M. F., Hsu, S. D., Baum, B. J., Bowen, W. H., Sierra, L. I., Aguirre,
M., et al. “Specific and non-specific immune factors in dental plaque fluid
and saliva from young and old populations” Infect. Immun. 1981; 31: 998-
1003.
31. Cohen, M. S., Britigan, B. E., French, M., and Bean, K. “Preliminary
observations on lactoferrin secretion in human vaginal mucus: variation
during the menstrual cycle, evidence of hormonal regulation, and
implications for infection with Neisseria gonorrhoeae” Am. J. Obstet.
Gynecol 1987; 157: 1122-1125.
32. Arnold, R. R., Cole, M. F., and McGhee, J. R. “A bactericidal effect for
human lactoferrin” Science 1977;197: 263-265.
33. Bullen, J. J., Rogers, H., and Griffiths, E. “Role of iron in bacterial
infection “ Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1978; 80: 1-35.
34. Arnold, R. R., Brewer, M., and Gauther, J. J. “Bactericidal activity of
human lactoferrin: sensitivity of a variety of microorganisms” Infect.
Immun. 1980; 28: 893-898.
35. Bullen, J. J. “The significance of iron in infection “ Rev. Infect. Dis. 1981;
3 : 1127- 138.
36. Nikawa, H., Samaranayake, L. P., Tenovuo, J., Pang, K. M., and Hamada,
T. “The fungicidal effect of human lactoferrin on Candida albicans and
Candida krusei” Arch. Oral Biol. 1993; 38:1057-1063.
37. Valenti, P., Visca, P., Antonnini, G., and Orsi, N. “Interaction between
lactoferrin and ovotransferrin and Candida cells” FEMS Microbiol. Lett.
[48]
1986;33: 271-275.
38. Soukka, T., Tenovuo, J., and Lenander-Lumikari, M. “Fungicidal effect
of human lactoferrin against Candida albicans” FEMS Microbiol. Lett.
1992;90: 223-228.
39. Ellison, R. T., Giehl, T. J., and Laforce, M. “Damage of the outer
membrane of enteric gram-negative bacteria by lactoferrin and transferrin”
Infect. Immun. 1988; 56 : 2774-2781.
40. Nikaido, H., and Vaara, M. “Molecular basis of bacterial outer
membrane permeability” Microbiol. Rev. 1985; 49: 1-32.
41. Bellamy, W., Takase, M., Wakabayashi, H., Kawase, K., and Tomita, M.
“Antibacterial spectrum of lactoferrin B, a potent bactericidal peptide
derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin” J. App. Bacteriol.
1992; 73: 472-479.
42. Odell, E. W., Sarra, R., Foxworthy, M., Chapple, D. S.,and Evans, R. W.
“Antibacterial activity of peptides homologous to a loop region in human
lactoferrin” FEBS Lett. 1996; 382: 175-178.
43. Sallmann, F. R., Baveye-Descamps, S., Pattus, F., Salmon, V., Branza, N.,
Spik, G., et al. “Porins OmpC and PhoE of Escherichia coli as specific cellsurface
of human lactoferrin. Binding characteristics and biological effects”
J. Biol. Chem. 1999; 274: 16107- 16114.
44. Bellamy, W., Takase, M., Yamauchi, K., Wakabayashi, H., Kawase, K.,
and Tomita, M. “Identification of the bactericidal domain of lactoferrin”
Biochim. Biophys. Acta 1992; 1121: 130-136.
45. Yamauchi, K., Tomita, M., Giehl, T. J., and Ellison, R. “Antibacterial
activity of lactoferrin and a pepsin-derived lactoferrin peptide fragment “
Infect. Immun. 1993; 61: 719-728.
46. Ibrahim, H. R., Iwamori, E., Sugimoto, Y., and Aoki T. “Identification of
a distinct antibacterial domain within the N-lobe of ovotransferrin”
Biochim. Biophys. Acta 1988;1401: 289-303.
47. Groenink, J., Walgreen-Weterings, E., van´t Hof, W., Veerman, E. C., and
Nieuw, A. A. V. “Cationic amphipathic peptides, derived from bovine and
human lactoferrins, with antimicrobial activity against oral pathogens”
FEMS Microbiol Lett. 1999; 179: 217- 222.
48. Wakabayashi, H., Matsumoto, H., Hashimoto, K., Teraguchi, S., Takase,
M., and Hayasawa, H. “N-acylated and D eneatiomer derivates of a
nonamer core peptide of lactoferricin B showing improved
antimicrobial activity” Antimicrob. Agents Chemother. 1999; 43 : 1267-
1269.
49. Lizzi, A. R., Carnicelli, V., Clarkson, M. M., and Oratore, A. “Lactoferrin
derived peptides: mechanisms of action and their perspectives as
antimicrobial and antitumoral” Mini Rev Med Chem. 2009; 9: 687-695.
50. Rogan, M., Geraghty, P., Greene, C., J O’Neill, S., Taggart, C., and
McElvaney, N., “Antimicrobial proteins and polypeptides in pulmonary
innate defence” Respiratory Research, 2006; 7:29.
51. Hancock, R. E. W, and Chapple, D. S. “Peptide antibiotics” Antimicrob.
Agents Chemother. 1999; 43: 1317-1323.
52. Martínez, T. G., Pizarro-Cerda, J., Moreno, E., and Moriyon, I. “The
outer membranes of Brucella spp. are resistant to bactericidal cationic
peptides” Infect. Immun. 1995; 63: 3054-61.
53. Steinberg, D. A., Hurst, M. A., Fujii, C. A., Kung, A. H., Ho, J. F., Cheng,
F. C., et al. “Protegrin-1: a broad-spectrum, rapidly microbicidal peptide
with in vivo activity” Antimicrob. Agents Chemother. 1997; 41: 1738-1742.
54. Hancock, R. E. W “Peptide Antimicrobial” Lancet 1997; 418-422.
55. Jenssen, H., Hamill, P., and Hancock, R. “Peptide Antimicrobial”
Clinical Microbiology Reviews, 2006 ; July 491–511.
56. Epand, R. M., and Vogel, H. J. “Diversity of antimicrobial peptides and
their mechanisms of action” Biochim. Biophys. Acta 1999; 1462: 11-28.
57. Hancock, R. E., and Scott, M. G. “The role of antimicrobial peptides in
animal defenses” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000; 97: 8856-8861.
58. Shai, Y. “Molecular recognition between membrane-spanning
polypeptides” Trends Biochem. Sci. 1995; 20: 460-464.
59. Hancock, R. E. W., Falla, T., and Brown, M. H. “Cationic bactericidal
peptides” Adv. Microb. Physiol. 1995; 37: 135-175.
60. Ehret-Sebatier, L., Loew, D., Goyffon, M., Hoffmann, J. A., van
Dorsselaer, A., and Bulet, P. “Characterization of novel cysteine-rich
antimicrobial peptides from scorpion blood” J. Biol. Chem. 1996;271: 29537-
29544.
61. Lambert, J., Keppi, E., Dimarcq, J. L., Wicker, C., Reichhart, J. M.,

Dumbar, B., et al. “Insect immunity: isolation from immune blood of the
dipteran Phormia terranovae of two insect antibacterial peptides with
sequence homology to rabbit lung macrophage bactericidal peptides” Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989; 86: 262-266.
62. Cornet, B., Bonmatin, J. M., Hetru, C., Hoffmann, J. A., Ptak, M., and
Vovelle, F. “Refined three-dimensional solution structure of insect defensin
A” Structure 1995;3: 435-448.
63. Zasloff, M., and Martin, B. “Antimicrobial activity of synthetic magainin
peptides and several analogues” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988; 85: 910-
913.
64. Matsuzaki, K. “Magainins as paradigm for the mode of action of pore
forming polypeptides” Biochim. Biophys. Acta 1998; 1376: 391-400.
65. Eisenhauer, P. B., Harwig, S. S., and Lehrer, R. I. “Cryptdins:
antimicrobial defensins of the murine small intestine” Infect. Immun. 1992;
60: 3556-3565.
66. Habermann, E., and Jentsch, J. “Sequence analysis of melittin from
tryptic and peptic degradation products” Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem.
1967;348: 37-50.
67. Argiolas, A., and Pisano, J. J. “Bombolitins, a new class of mast cell
degranulating peptides from the venom of the bumblebee
Megabombus pennsylvanicus” J. Biol. Chem. 1985; 260: 1437- 1444.
68. Louw, A. I. “Snake venom toxins. The complete amino acid sequence of
cytotoxin VII4 from the venom of Naja mossambica mossambica” Biochem.
Biophys. Res. Commun. 1974; 58: 1022-1029.
69. Gross, E., and Morell, J. L. “The structure of nisin” J. Am. Chem. Soc.
1971; 93: 4634-4635.
70. Buchman, G. W., Banerjee, S., and Hansen, J. N. “Structure, expression,
and evolution of a gene encoding the precursor of nisin, a small protein
antibiotic” J. Biol. Chem. 1988; 263: 16260-16266.
71. Fitton, J. E., Dell, A., and Shaw, W. V. “The amino acid sequence of the
delta haemolysin Straphylococcus aureus” FEBS Lett. 1980; 115: 209-212.
72. Veath, W. R., Fossell, E. T., and Blout, E. R. “The conformation of
gramicidin A” Biochemistry 1974;13: 5249-5256.
73. Katz, E., and Demain, A. L. “The peptide antibiotics of Bacillus:
chemistry, biogenesis, and possible functions” Bacteriol. Rev. 1977; 41: 449-
474.
74. Mor, A., Nguyen, V. H., Delfour, A., Migliore-Samour, D., and Nicolas, P.
“Isolation, amino acid sequence of dermaseptin, a novel antimicrobial
peptide of amphibian skin” Biochemistry 1991; 30: 8824-8830.
75. Strahilevitz, J., Mor, A., Nicolas, P., and Shai, Y. “Spectrum of
antimicrobial activity and assembly of dermaseptin-b and its precursor
form in phospholipid membranes” Biochemistry 1994;33 : 10951-10960.
76. Coote, P. J., Holyoak, C. D., Bracey, D., Ferdinando, D. P., and Pearce, J.
A. “Inhibitory action of a truncated derivative of the amphibian skin
peptide dermaseptin s3 on Saccharomyces cerevisiae” Antimicrob. Agents
Chemother. 1998; 42: 60-70.
77. De Lucca, A. J., and Walsh,T. J. “Antifungal peptides: novel therapeutic
compounds against emerging pathogens” Antimicrob. Agents Chemother.
1999; 43: 1-11.
78. Pollock, J. J., Denepitiya, L., Mackay, B. J., and Iacono, V. “Fungistactic
and fungicidal activity of human parotid salivary histidine-rich
polypeptides on Candida albicans” Infect. Immun. 1984; 44: 702-707.
79. Oppenheim, F. G, Xu, T., McMillian, F. M., Levitz, S. M., Diamond, R.
D., Offner, G. D., et al. “Histatins, a novel family of histidine-rich proteins
in human parotid secretion. Isolation, characterization, primary structure,
and fungistatic effects on Candida albicans” J. Biol. Chem. 1988; 263 : 7472-
7477.
80. Xu, Y. Y., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P., and Nikawa, H.
“In vitro susceptibility of Candida species to lactoferrin” Med. Mycol. 1998;
37: 35- 41.
81. Helmerhorst, E. J., Breeuwer, P., van ‘t Hof, W., Walgreen-Weterings, E.,
Oomen, L. C. J. M., Veernan, E. C. I., et al. “The celular target of histatin 5
on Candida albicans is the energized mitochondrion” J. Biol. Chem. 1999;
274: 7286-7291.
82. de Lillo A., Quiros L. M., and Fierro J. F. “Relationship between
antibacterial activity and cell surface binding of lactoferrin in species of
genus Micrococcus” FEMS Microbiol. Lett. 1997; 150: 89-94.
83. Turchany, J. M., Aley, S. B.,and Gillin, F. D. “Giardicidal activity of
lactoferrin and N-terminal peptides” Infect. Immun. 1995; 63: 4550-4552.
84. Giacometti, A., Cirioni, O., Barchiesi, F., Del Prete, M. S., Fortuna, M.,
Caselli, F., et al. “In vitro susceptibility test for cationic peptides:
comparison of broth microdilution methods for bacteria that grow
aerobically “ Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44: 1694-1696.
85. Loh, B., Grant, C., and Hancock, R. E. “Use of the fluorescent probe
1-N-phenylnaphthylamine to study the interactions of aminoglycoside
antibiotics with the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa”
Antimicrob. Agents Chemother. 1984; 26: 546-551.
86. Schuldiner, S., and Kaback, H. R. “Membrane potential and active
transport in membrane vesicles from Escherichia coli “ Biochemistry
1975;14:5451-5461.
87. Molenaar, D., Abee, T., and Konings, W. N. “Continuous measurement of
the cytoplasmic pH in Lactococcus lactis with a fluorescent pH indicator”
Biochim. Biophys. Acta 1991; 1115: 75-83.
88. Wu, M., and Hancock, R. E. “Interaction of the cyclic antimicrobial
cationic peptide bactenecin with the outer and cytoplasmic membrane” J.
Biol. Chem. 1999; 274(1): 29-35.
[49]

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Abstracts
[50]

Cuantificación de antígeno
leucocitario humano G
soluble en sobrenadante del
cultivo de embriones como
indicador de su capacidad
de implantación en un
programa de reproducción
asistida
MªJOSé ARTACHO REINOSO
Hospital General Universitario de Alicante
Introducción
El antígeno leucocitario humano G (HLA-G) desempeña un
papel tolerogénico en la interfase materno-fetal. En
programas de reproducción asistida, en los que se cultivan
embriones in vitro, ha cobrado interés la detección de las
isoformas solubles de esta molécula (sHLA-G) en el medio en
el que han crecido los embriones. Aunque la determinación es
compleja, tiene interés por su aparente relación con la
idoneidad de dichos embriones.
Objetivos
1.Determinar la presencia de la molécula de s-HLA-G
(isoformas HLA-G1 y HLA-G5) en los sobrenadantes de
embriones implantados
2.Relacionar la presencia de sHLA-G, con las características
morfológicas de los embriones
3.Relacionar la presencia de sHLA-G1 en los sobrenadantes de
los embriones con las tasas de implantación y embarazo
posteriores
Método
Puesto a punto de un método de ELISA amplificado para
medir sHLA-G a las concentraciones esperables en dichos
sobrenadantes. Como medio comparativo se ha utilizado una
dilución al límite de la línea del coreocarcinoma JEG-3.
Con el ELISA desarrollado se han analizado
retrospectivamente 97 sobrenadantes recogidos a las 44-48
horas efectuada la fecundación,mediante inyección
intracitoplasmática del espermatozoide y los datos se han
correlacionado con los resultados retrospectivos de dichos
embriones.
Resultados
En 33 (34%) de los 97 sobrenadantes se ha detectado HLA-G.
Las mujeres donadoras de embriones de edad 26± 2 años
presentan un mayor número de embriones sHLA-G positivos
frente a las propias (35±5 años) con un 50,9 % frente a un
11,9% respectivamente.
Los resultados reproductivos de los embriones que fueron
transferidos al útero fueron los siguientes: una mujer que
recibió únicamente HLA-G negativo no consigue quedarse
embarazada mientras que otra a la que sólo se implanta un
embrión sHLA-G positivo consigue implantación. En
conjunto, el grupo que recibió al menos un embrión HLA-G
positivo, las tasas de embarazo e implantación fueron de
83%y 28,6% respectivamente.
Conclusión
Es posible cuantificar niveles de sHLA-G en sobrenadante de
embriones y los resultados obtenidos sugieren asociación con
Tabla I. Concentraciones de HLA-G detectados en el medio de cultivo de embriones transferidos.
Paciente nº Total sobrenadantes Valores HLA-G transferidos Sacos uterinos
1 3 0,0 Ninguno
2 24 0,0 | 1,4 | 5,1 | 0,0 Doble
3 8 0,0 | 0,0 | 1,8 | 0,0 Único
4 18 0,5 | 0,0 | 0,0 | 0,0 Único
5 21 0,0 | 0,0 | 0,3 | 0,0 | 0,0 | 0,0 Único
6 18 3,4 | 0,7 Ninguno
7 5 1 | 4 Único
Total 97
Valores de cero indican que pertenece a un límite de sensibilidad de 0,1 U/mL.
[51]

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la probabilidad de embarazo. La detección de sHLA-G, por
tanto, podría ser un buen complemento de la selección
morfológica de embriones útil para incrementar la tasa de
implantación y reducir la de los embarazos múltiples.
BIBLIOGRAFIA
1.Hunt JS, Petroff MG, McIntire RH, Ober C. HLA-G and immune tolerance
in pregnancy. The FASEB Journal.2005 681-693
2.Hviid TV. HLA-G in human reproduction: aspects of genetics, function
and pregnancy complications.Hum Reprod .2006;12(3):209-32.
3.Desai N, Filipovits J, Goldfarb J.Secretion of soluble HLA-G by day 3
human embryos associated with higher pregnancy and implantation rates:
assay of culture media using a new ELISA kit.
Reprod Biomed Online. 2006;13(2):272-7.
4.Sargent I, Swales A, Ledee N, Kozma N, Tabiasco J, Le Bouteiller P.
sHLA-G production by human IVF embryos: Can it be measured reliably? J
Reprod Immunol. 2007 ;75(2):128-32.
5.Sher G, Keskintepe L, Fisch JD, Acacio BA, Ahlering P, Batzofin J,
Ginsburg M. Soluble human leukocyte antigen G expression in phase I
culture media at 46 hours after fertilization predicts pregnancy and
implantation from day 3 embryo transfer.Fertil Steril. 2005;83(5):1410-3.
6.Fuzzi B, Rizzo R,Criscuoli L,Noci I,Melchiorri L,Scarselli B,Bencini
E,Menicucci A,Baricordi OR. HLA-G expression in early embryos is a
fundamental prerequisite for the obtainment of pregnancy. Eur J Immunol.
2002;32(2):311-5.
7.Yie SM,Balakier H,Motamedi G,Librach CL.Secretion of human leukocyte
antigen-G by human embryos is associated with a higher in vitro
fertilization pregnancy rate.Fertil Steril.2005;83(1)30-6
8.Rebmann V,Switala M,Eue I,Schwahn E,Merzenich M,Grosse-Wilde H.
Rapid evaluation of soluble HLA-G levels in supernatants of in vitro
fertilized embryos.Hum Immunol. 2007;68(4):251-8.
9.Rizzo R,Melchiorri L,Stignani M, Baricordi OR.HLA-G expression is a
fundamental prerequisite to pregnancy.Hum Immunol. 2007;68(4):244-50
10.Sageshima N,Shobu T,Awai K,Hashimoto H,Yamashita M,Takeda
N,Odawara Y,Nakanishi M, Hatake K,Ishitani A.Soluble HLA-G is absent
from human embryo cultures: A reassessment of sHLA-G detection
methods.J Reprod Immunol. 2007;75(1):11-22.
[52]

Prevalencia del Síndrome
Metabólico tras infarto agudo
de miocardio, marcadores
pro-inflamatorios asociados
LINA BENALI
Laboratorio de Análisis Clínicos, Hospital Universitario
Virgen de la Arrixaca, Murcia.
Introducción y objetivos
La prevalencia del síndrome metabólico (SM) en España
oscila según el tipo de población evaluada. Su impacto en las
enfermedades cardiovasculares, a pesar de su sencillo
diagnóstico, no se ha descrito con tanta claridad . En
pacientes con antecedente de infarto de miocardio ha sido
analizada en pocos estudios, y existen evidencias de que la
existencia de SM incrementa el riesgo posterior de
recurrencias vasculares independientemente de los factores de
riesgo clásicos. En poblaciones de alto riesgo, la prevalencia
aumenta considerablemente hasta casi el 50 %, llega a más del
80 % en personas diabéticas y al 40 % en personas con
intolerancia a la glucosa.
En grandes estudios prospectivos, la proteína C reactiva
ultrasensible (hs-CRP) añade información pronostica sobre el
riesgo cardiovascular más allá de la prevista por el síndrome
cardiometabólico. Estos hallazgos han llevado a la discusión
sobre la incorporación de la medición hs-CRP a la definición
actual del síndrome cardiometabólico para mejorar la
detección de riesgo para la diabetes y episodios
cardiovasculares .
El presente estudio tiene como objetivo analizar la
prevalencia del SM en la región de Murcia en pacientes con
antecedente de infarto agudo de miocardio y valorar si los
marcadores inflamatorios se comportan como marcadores de
información predictiva o pronostica de un futuro infarto en
la población de estudio.
Métodos
Estudio longitudinal observacional prospectivo, que incluyó
pacientes que han tenido infarto agudo de miocardio. Se han
excluido los fallecidos durante la hospitalización motivo del
ingreso referido, aquellos con el diagnóstico previo de
diabetes mellitus (DM) y a los que se les realizó este
diagnóstico “de novo” durante su ingreso. Los pacientes
fueron citados para una entrevista personal, la medición de
las magnitudes antropométricas habituales y diferentes
determinaciones analíticas (concentración de triglicéridos,
colesterol de HDL, proteína C reactiva (CRP), CRP
ultrasensible fibrinógeno, insulina…). Para el correcto
diagnóstico de la diabetes y en el caso de la glucemia basal sea
inferior a 7 mmol/l, se practicó una prueba de sobrecarga oral
de glucosa (POSG). Cada paciente fue informado por escrito y
oralmente de la finalidad del estudio y firmó su
consentimiento informado por escrito. Los criterios de
definición del síndrome metabólico son los del Adult
Treatment Panel III modificados 2005 . El análisis estadístico
se realizó mediante el paquete SPSS 15.0. Las variables
cuantitativas se analizaron mediante el test de Student para la
comparación de muestras independientes. Las variables
cualitativas se compararon mediante el test de chi cuadrado
χ2.
Resultados
En el estudio se analizaron 134 pacientes; el 19,4% son
mujeres y su edad media es de 60±12 años. La mitad
cumplieron tres o más criterios de síndrome metabólico,
siendo el aumento del perímetro abdominal el criterio más
prevalente seguido por la concentración de glucosa basal y la
tensión arterial respectivamente (figura 1).
Porcentaje
35
30
25
20
15
10
5
0
35-45 46-55 56-65
Edad (años)
66-75 76-85
Figura 1. Prevalencia del síndrome metabólico en función de la edad.
En el conjunto de 67 pacientes con SM, el número absoluto y
porcentaje de pacientes con 3 criterios de SM fue de 36
(53,7%); 25 (37,3%) presentaron 4 criterios y 6 (9%) cumplían
los 5 criterios.
La distribución de la incidencia del SM en los diferentes
grupos de edad se muestra en la figura 2.
Porcentaje
100
80
60
40
20
0
Perímetro
abdominal
TAG
TAG: Triglicéridos, HDLc: Colesterol.
Figura 2. Prevalencia de los criterios Criterio de SM SM en el grupo No con criterio SM. SM
HDLc
Tensión
arterial
Glucosa
basal
[53]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
Comparando el grupo de pacientes con SM y sin SM no
hemos encontrado asociación con los parámetros de carácter
proinflamatorio. Sin embargo, los pacientes con SM
mostraron concentraciones mayores de insulina (p=0,009) y
alanina aminotransferasa (GPT) (p=0,032), triglicéridos
(p=0,000) y glucosa basal (p=0,001).
Más de la mitad de los pacientes con SM presentan una
alteración significativa del metabolismo hidrocarbonado y de
ellos un 24% con criterio de DM (tabla I).
Tabla I: Alteración del metabolismo hidrocarbonato en el grupo de
pacientes que cumplen los criterios del SM y los que no lo cumplen.
SM No SM p
Normal N 10 (15 %) N 24 (36 %)
Intolerancia a la
glucosa en ayunas y/o
tras sobrecarga
41 (61 %) 34 (51%) 0,01
DM 16 (24 %) 9(13 %)
Conclusión
Prácticamente la mitad de los pacientes tras IAM seguidos un
periodo de promedio de 20 meses tienen al menos 3 criterios
de SM. Los pacientes con SM tienen mayor prevalencia de
alteraciones del metabolismo hidrocarbonado. Asociación de
la hiperinsulinemia al SM.
BIBLIOGRAFÍA.
Alegría E, Cordero A, Laclaustra M, Grima A, et al. «Prevalencia del
síndrome metabólico en población laboral española: registro MESYAS», Rev
Esp Cardiol. 2005;58:797-806.
Ford ES, Giles WH, Dietz WH. «Prevalence of the metabolic syndrome
among US adults: findings from the third National Health and Nutrition
Examination Survey». Diabetes Care.2001; 4: 683–689.
Ndumele CE, Pradhan AD, Ridker PM.” Interrelationships between
inflammation, C-reactive protein, and insulin resistance”. J Cardiometab
Syndr. 2006;1:190-6
Grundy SM, Cleeman JI, Daniels SR, Donato KA, Eckel RH, Franklin BA, et
al. Diagnosis and management of the metabolic syndrome. An American
Heart Association/National Heart, Lung, and Blood Institute Scientific
Statement. Executive Summary. Circulation. 2005;112:285-90.
[54]

Estado actual de los
pragramas de cribado del
cáncer de pulmón. Papel de
los biomarcadores en el
cribado
IGNACIO CONSTANSO CONDE
Redisente de Bioquímica ClínicaComplejo Hospitalario
Universitario A Coruña (CHUAC)
Introducción
El cáncer de pulmón (CaP) es el problema sanitario más
importante en España y en el mundo occidental. El único
tratamiento eficaz, la detección temprana (y pronta resección
quirúrgica), depende del desarrollo de programas de cribado
efectivos.
Objetivo
evaluar los programas actuales de cribado de CaP y el papel
que en éstos juegan los biomarcadores, describiendo los más
novedosos y con mayor potencial.
Material y métodos
revisión bibliográfica en Internet (PubMed, Google…)
Resultados
El CaP en España: el cáncer es la principal causa de muerte en
España y el CaP es el más mortal (el 1º en hombres y 6º en
mujeres). Tiene una supervivencia muy baja debido a una
evolución muy rápida y un diagnóstico tardío (en la mayoría
con metástasis). El tabaco es el principal agente etiológico del
CaP y a pesar de una progresiva reducción de la prevalencia
del tabaquismo en España, aún se tratan de valores elevados y
preocupantes, sobre todo en los jóvenes y las mujeres.
ASPeCToS BáSiCoS De un PRoGRAMA De CRiBADo:
una enfermedad es susceptible de ser cribada si cumple las
premisas definidas por Wilson y Jungner en 1968. Luego es
necesario un estudio piloto que demuestre que los beneficios
del cribado (disminución de la mortalidad, mejora de la
calidad de vida…) superan los efectos adversos para poder
aplicarlo a la población general. Los efectos adversos más
importantes son provocados por los falsos negativos (falsa
tranquilidad y pérdida del diagnóstico) y los falsos positivos
(sobrediagnóstico, exámenes innecesarios y
sobretratamiento). Los falsos positivos son provocados por la
baja prevalencia de la enfermedad, disminuyendo el valor
predictivo positivo (VPP) a pesar de contar con una prueba
de diagnóstica de especificidad (E) alta. Estudios matemáticos
sobre programas de cribado ideales prueban la alta
probabilidad de sobrediagnóstico (1) en todos los cánceres,
especialmente en el de próstata.
PRoGRAMAS De CRiBADo De CAP:
la tomografía computerizada de baja dosis (LDCT) es la mejor
herramienta diagnóstica para cribar CaP en población de
riesgo (según hábito tabáquico y edad). Algunos de los
programas de cribado con LDCT ya han ofrecido resultados.
“The International Early Lung Cancer Action Program
Investigators (I-ELCAP)” (1993-2005), probó un gran
aumento de la supervivencia en los pacientes detectados con
un buen ratio de detección y coste-efectividad. Los resultados
de otro grupo, el New York-ELCAP (2007), obtuvo resultados
similiares.
Ese mismo año (2007) se publicó un trabajo que cuestionó
duramente la validez de los resultados del ELCAP debido a:
ausencia de grupo control, utilizar la supervivencia en lugar
de la mortalidad para evaluar los beneficios de su cribado ( ya
que la primera puede aumentar sin que mejore la segunda por
el efecto de un diagnóstico precoz) y el sobrediagnóstico,
siendo éste el principal problema en otros estudios similares.
La gran cantidad de falsos positivos en estos estudios hacen
que la American Cancer Society y el National Cancer
Institute de Estados Unidos desaconsejen el cribado
poblacional de CaP, a la espera de los resultados de dos
estudios a gran escala: el National Lung Screening Trial
(NLST) (2002-2010) y el Nederlands-Leuvens Longkanker
Screenings Onderzoek (NELSON) (2003-2015).
uTiLiDAD De LoS BioMARCADoReS en eL CRiBADo CAP:
intentando disminuir el número de falsos positivos. ¿Cómo?,
fundamentalmente de dos maneras:
1.) Clasificando mejor la población de riesgo a estudio:
utilizando los biomarcadores junto al resto de factores (edad,
tabaco, exposición ocupacional, predisposición familiar…)
para asignar un riesgo individual, en función del cual se
continuaría o no con la siguiente etapa del cribado, la LDCT.
Al realizar cribados en poblaciones con mayor riesgo (mayor
prevalencia), el VPP aumenta disminuyendo el número de
falsos positivos. Para este cometido no es necesario que un
biomarcador posea una gran S y E, ya que, a menudo, esto no
se correlaciona con su función a la hora de clasificar riesgos,
aunque se pueden combinar en una curva de predectividad
(preditiveness curve) (1). Varios estudios demuestran la
utilidad de los biomarcadores para establecer grupos de
riesgo en varios tipos de cáncer (2) y en CaP (3).
2.) Ayudando en el manejo de los nódulos pequeños de
significado incierto:
son necesarios biomarcadores con la máxima E posible que
nos haga aumentar el VPP.
ESTADO DEL ARTE DE LOS BIOMARCADORES EN EL CAP:
[55]

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en la actualidad, los biomarcadores están lejos de las
prestaciones que ofrecen las técnicas de imagen (LDCT o
PET). Los más prometedores son:
1.) Estudio del DNA:
• cuantificación del DNA circulante: demostró ser un buen
biomarcador para detectar cáncer pero no para cribarlo (4).
• inestabilidad genómica: pérdida de heterozigosidad (LOH),
mediante arrays CGH.
• estudio de mutaciones en genes candidatos ( EGFR, SASH1,
LATS1, IGF2R, PARK2, TCF21, CHRNA3,…), mendiante
arrays, PCR, RT-PCR, secuenciadores...
• expresión de DNA (transcriptómica) mediante arrays de
expresión génica.
• epigenética: la ventaja frente a los biomarcadores proteicos
es que puede amplificarse y detectarse fácilmente mediante
PCR. Es posible detectar DNA metilado en muestras de
sangre y aire exhalado ofreciendo resultados prometedores
(5).
2.) Micro-RNAs (miRNAs):
ventajas: 1ml de sangre es suficiente, son estables y no es
necesario amplificar (6), alta E. En CaP hay poco publicado
(7). Tecnologías: microarrays, citometría flujo, RT-PCR.
3.) Proteómica:
estudio de perfiles de expresión, con varios trabajos para CaP
(8), y la búsqueda de nuevos biomarcadores. Poco
reproducible.
4.) Marcadores tumorales:
llama la atención el original trabajo de Yee et al. (9).
5.) Metabolómica:
• Glicanos: importante papel en cáncer (10). Variabilidad de
resultados.
• Lípidos: fisiología del pulmón (surfactantes, protanoides y
señalización). Tecnología: LC-MS-MS. Ejemplo: la sintetasa
de ácidos grasos (FAS, fatty acid synthasa) está en mayor
cantidad en los tejidos bronquiales con cáncer de pulmón (11)
• Compuestos orgánicos volátiles (VOCs): se recogen en el
condensado de aire exhalado (EBC) y se analizan por
espectrometría de masas o “narices electrónicas” (arrays de
sensores). Gran potencial en cribado ya que el EBC es
mínimamente invasivo. Limitación: poca estandarización y
reprodubilidad en el recogido del EBC (12). Numerosos
estudios en la detección de cáncer de pulmón (3).
[56]
BIBLIOGRAFÍA
1. Pepe MS. Integrating the predictiveness of a marker with its performance
as a classifier. Am J Epidemiol. 2008 Feb 1;167(3):362-8.
2. McIntosh MW, Pepe MS. “Combining several screening tests: optimality
of therisk score.” Biometrics. 2002 Sep;58(3):657-64.
3 A Cassidy, JP Myles. “The LLP risk model: an individual risk prediction
model for lung cancer”. British Journal of Cancer (2008) 98, 270 – 276.
4. Sozzi Gl. Plasma DNA quantification in lung cancer ct screening: fiveyear
results of a prospective study. Am J Respir Crit Care Med 2009; 179:
69–74.
5. Hsu HS. Characterization of a multiple epigenetic marker panel for lung
cancer detection and risk assessment in plasma. Cancer 2007, 110:2019-
2026.
6. Resnick KE. The detection of differentially expressed microRNAs from
the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform.
Gynecol Oncol 2009, 112: 55–59.
7. Johnson SM, Grosshans H. RAS is regulated by the let-7 microRNA
family. Cell 2005;120:635– 47.
8. Han KQ, Huang G. Identification of lung cancer patients by serum
protein profiling using surface-enhanced laser desorption/ionization timeof-flight
mass spectrometry. Am J Clin Oncol 2008.
9. Yee J, Sadar MD, Sin DD. Connective tissue activating peptide III: a novel
blood biomarker for earlylung cancer detection. J Clin Oncol. 2009 Jun
10;27(17):2787-92.
10. Heo SH. Identification of putative serum glycoprotein biomarkers for
human lung adenocarcinoma by multilectin affinity chromatography and
LC-MS/MS. Proteomics 2007; 7: 4292–4302.
11. Orita H, Coulter J. Selective inhibition of fatty acid synthase for lung
cancer treatment. Clin Cancer Res 2007; 13: 7139–7145.
12. Miekisch W. Impact of sampling procedures on the results of breath
analysis. J Breath Res 2008; 2:1–7.
13. Phillips M. Prediction of lung cancer using volatile biomarkers in breath.
Cancer Biomark 2007; 3: 95–109.

Valor diagnóstico y
pronóstico de los
autoanticuerpos en
diferentes enfermedades
autoinmunes: Celiaquía,
Artritis Reumatoide,
Cirrosis Biliar Primaria y
Lupus Eritematoso
Sistémico.
LUÍS MANUEL FERNáNDEZ DOMÍNGUEZ.
Servicio Análisis Clínicos. Complejo Hospitalario
Universitario de Albacete.
1. Objetivos, material y métodos:
El objetivo de este trabajo es realizar una revisión del valor de
los autoanticuerpos en el diagnóstico y pronóstico de
diferentes enfermedades autoinmunes (EAI), como son la
celiaquía (EC), el Lupus Eritematoso Sistémico (LES), la
Artritis Reumatoide (AR) y la Cirrosis Biliar Primaria (CBP).
El objetivo final es un intento de estandarización en el uso de
estos autoanticuerpos.
Para realizar la revisión bibliográfica se han tenido en cuenta
las principales guías clínicas que existían para cada
enfermedad, en el caso de no existir dichas guías, se han
buscado artículos relacionados que revisen y evalúen el valor
diagnóstico y pronóstico de los autoanticuerpos en cada
enfermedad. También se han revisado artículos que evalúen
el valor pronóstico y diagnóstico de los autoanticuerpos en las
EAI que disponían de guía.
2. Resultados:
2.1. AuToAnTiCueRPoS DiSPoniBLeS en LA enFeRMeDAD CeLiACA:
Todos los marcadores séricos, cuando se usan para
diagnóstico, se deben determinan con los pacientes siguiendo
una dieta con gluten. Si existe déficit selectivo de Ig A se
determinarán las Ig G de los distintos marcadores. Además,
un resultado negativo no descarta del todo la EC. En menores
de 5 años y déficit selectivo de Ig A puede ser de utilidad el
uso de los péptidos sintéticos antigliadina (AGA).
En la tabla I se resumen las recomendaciones de las diferentes
guías. Se recomienda el uso de antitransglutaminasa tisular
Ig A (tTg IgA) como marcador inicial. Los antiendomisio
(EMA), más específicos, pueden ser usados para eliminar
posibles falsos positivos. No se recomienda el screening en la
Tabla I. Recomendaciones en EC de: MSC: Ministerio de Sanidad y
Consumo de España; AGA: American Gastroenterological Association;
NIH: National Institue of Health; WGO: World Gastroenterology
Organisation; NASPGHAN: North American Society for Pediatric
Gastroenterology, Hepatology and Nutrition. NE: No especifica.
MSC AGA NIH WGO NASPGHAN
Autoanticuerpos de
screening
tTG-IgA tTG-IgA tTG-IgA tTG-IgA tTG-IgA
Determinación de IgA Sí No NE Sí No
Screening población
general
NE NE No NE No
Screening familiares/
población riesgo
Sí Sí Sí NE NE
población general pero sí en familiares de primer grado y en
enfermedades con mayor riesgo de EC (Diabetes Mellitus tipo
I, Tiroiditis Autoinmune,…). Hay discrepancia en la
determinación simultánea de IgA.
Los marcadores séricos pueden utilizarse para ver la respuesta
al tratamiento, evolución de los síntomas, controlar el
crecimiento en los niños y el cumplimiento de la dieta, pero
pueden necesitar de un tiempo prolongado (más de un año)
para normalizarse, especialmente en adultos (en niños ocurre
más rápida y completamente) y, además, puede que el
resultado de estos marcadores no se correlacione con la
histología [1-5].
En el caso del hallazgo de positividad de los anticuerpos antireticulina
deberán determinarse los marcadores séricos
habituales para confirmar el diagnóstico [6].
2.2. AuToAnTiCueRPoS DiSPoniBLeS en LA ARTRiTiS ReuMAToiDe:
La utilidad diagnóstica del factor reumatoide (FR) para la AR
varía en función de que la prueba se realice en personas con
síntomas compatibles con AR o sin ellos. Además el FR tiene
valor pronóstico ya que se asocia a enfermedad más grave.
Los antipéptido cíclico citrulinado (anti-CCP) pueden
preceder a la aparición de la enfermedad durante varios años,
su presencia se relaciona con la gravedad y tienen una
sensibilidad para el diagnóstico de la AR similar a la del FR
pero mayor especificidad (95%), por lo que para algunos
autores su utilidad es superior a la del FR. También
constituyen un factor pronóstico de evolución hacia la AR.
Deben solicitarse en la evaluación del paciente con artritis de
comienzo reciente y permiten a los clínicos distinguir los
pacientes con AR de aquellos con otras artritis. El pronóstico
es peor cuando ambos autoanticuerpos son positivos [7,8].
La Vimentina Citrulinada Mutada necesita de más estudios
para utilizarse [9].
2.3. AuToAnTiCueRPoS DiSPoniBLeS en eL LuPuS eRiTeMAToSo
SiSTéMiCo:
Los anticuerpos iniciales son los antinucleares (ANA). Ante la
ausencia de ANA a títulos de 1/160 o superiores y con anti-
Ro-60 negativos, es seguro descartar el diagnóstico de LES
[10] pero, al ser poco específicos, los ANA tienen un alto
valor pronóstico negativo pero un valor pronóstico positivo
de sólo el 10%.
Si los ANA son negativos no se deberían hacer ni antiDNA de
[57]

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doble cadena (anti-dsDNA) ni antígenos extraíbles del núcleo
(ENA´s) y, si son positivos, se debe informar tanto el título
como el patrón [11]. Si este es homogéneo o moteado habrá
que investigar más y determinar el patrón concreto, así si el
patrón es homogéneo se harán los anti-dsDNA y si es
moteado los ENA´s. Tanto los anti-dsDNA como los anti-Sm
son muy específicos de LES; por lo que a elevados títulos son
casi patognomónicos de LES [12]. La definición de un umbral
mayor para la positividad de los anti-dsDNA aumentaría el
valor pronóstico mientras que los anti-Sm tienen baja
sensibilidad. La correlación entre los anti-dsDNA y la
actividad renal es limitada y no predicen los brotes. Para su
determinación, los métodos ELISA son considerados más
sensibles pero menos específicos que la IFI en Crithidia
luciliae (CLIF) y la Farr inmunoprecipitación [10, 13].
Los anticuerpos anti-histonas no son específicos de LES. El
valor de los anti-Ro 60 y anti-La para seguimiento del
progreso de la enfermedad es muy limitado [10].
2.4. AuToAnTiCueRPoS DiSPoniBLeS en LA CiRRoSiS BiLiAR
PRiMARiA:
Los anticuerpos antimitocondriales (AMA) son el “sello”
inmunológico más sensible (más del 90%) y son específicos de
la enfermedad, pero la magnitud del título de AMA no tiene
ninguna significancia clínica ni valor pronóstico. Se deben
determinan por IFI en triple tejido (hígado, riñón y estómago
de rata) para evitar la confusión con los anti-LKM-1
(anticuerpos antimicrosomales de hígado/riñón) [14]. Si se
hayan AMA positivos y test hepáticos normales, estos
pacientes podrían desarrollar CBP latente o precoz. Se
recomienda considerar la Hepatitis Autoinmune (HAI) en el
diagnóstico diferencial [15].
El western immunoblotting (W-IB) se puede utilizar para
confirmar la presencia de AMA detectada por IFI o para
identificar reactividades específicas de AMA en pacientes con
AMA negativos, dado que el W-IB tiene mayor sensibilidad
que la IFI [14]. La ausencia de AMA en pacientes con CBP
(Colangitis Autoinmune), resulta casi irrelevante, por lo que
el manejo de estos pacientes no debería ser diferente [16]. A
menudo estos pacientes con AMA negativos tiene ANA (más
del 85%) y antimúsculo liso (SMA) positivos a un elevado
título. Los ANA específicos de CBP (los ACA
(anticentrómero), anti-PNM (puntos nucleares múltiples) y
los antimembrana nuclear) se encuentran más en pacientes
con enfermedad avanzada y a menudo coexisten los patrones
en el mismo suero [17].
Los ACA podrían identificar pacientes con mayor riesgo de
desarrollar una CBP más severa [17].
3. Conclusiones:
El éxito del tratamiento de una EAI depende de la prontitud
del diagnóstico, de que se llegue a este diagnóstico antes de
[58]
que un órgano comience a fallar. El uso de los
autoanticuerpos puede ayudar a realizar el diagnóstico con
mayor antelación ya que se ha visto que estos pueden aparecer
con mucha antelación a los síntomas de la enfermedad.
El problema radica cuando estos autoanticuerpos se usan de
manera errónea o cuando no se sabe cómo interpretarlos, hay
que tener en cuenta que no está totalmente claro todavía el
papel de estos anticuerpos. Una estandarización de la
utilización de estos anticuerpos favorecería su interpretación.
4. BIBLIOGRAFÍA:
1. Grupo de trabajo sobre “Diagnóstico precoz de la EC”. Ministerio de
Sanidad y Consumo. 2008.
2. Rostom A, Murray JA, Kagnoff MF. American Gastroenterological
Association (AGA) Institute technical review on the diagnosis and
management of celiac disease. Gastroenterology. 2006 Dec;131(6):1981-2002.
3. NIH Consensus Development Conference on Celiac Disease. NIH
Consens State Sci Statements. 2004 Jun 28-30;21(1):1-23.
4. World Gastroenterology Organisation Practice Guidelines: Enfermedad
celíaca.
5. Hill ID, Dirks MH, Liptak GS, Colletti RB, Fasano A, Guandalini S et al;
North American Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and
Nutrition. Guideline for the diagnosis and treatment of celiac disease in
children: recommendations of the North American Society for Pediatric
Gastroenterology, Hepatology and Nutrition. J Pediatr Gastroenterol Nutr.
2005 Jan;40(1):1-19.
6. Bagnasco M, Grassia L, Pesce G. The management of the patient with
unexpected autoantibody positivity. Autoimmun Rev. 2007 Jun;6(6):347-53.
Epub 2007 Feb 15.
7. Actualización de la guía de práctica clínica para el manejo de la artritis
reumatoide en España. Sociedad Española de Reumatología (SER). 2006.
8. Rheumatoid arthritis National clinical guideline for management and
treatment in adults Royal College of Physicians. 2009
9. Egerer K, Feist E, Burmester GR. The serological diagnosis of rheumatoid
arthritis: antibodies to citrullinated antigens. Dtsch Arztebl Int. 2009
Mar;106(10):159-63. Epub 2009 Mar 6.
10. Kurien BT, Scofield RH. Autoantibody determination in the diagnosis of
systemic lupus erythematosus. Scand J Immunol. 2006 Sep;64(3):227-35.
11. Solomon DH, Kavanaugh AJ, Schur PH; American College of
Rheumatology Ad Hoc Committee on Immunologic Testing Guidelines.
Evidence-based guidelines for the use of immunologic tests: antinuclear
antibody testing. Arthritis Rheum.2002 Aug;47(4):434-44.
12. Benito-Garcia E, Schur PH, Lahita R; American College of
Rheumatology Ad Hoc Committee on Immunologic Testing Guidelines.
Guidelines for immunologic laboratory testing in the rheumatic diseases:
anti-Sm and anti-RNP antibody tests. Arthritis Rheum. 2004 Dec
15;51(6):1030-44.
13. Kavanaugh AF, Solomon DH;; American College of Rheumatology Ad
Hoc Committee on Immunologic Testing Guidelines. Guidelines for
immunologic laboratory testing in the rheumatic diseases: anti-DNA
antibody tests. Arthritis Rheum. 2002 Oct 15;47(5):546-55.
14. Muratori L, Granito A, Muratori P, Pappas G, Bianchi FB.
Antimitochondrial antibodies and other antibodies in primary biliary
cirrhosis: diagnostic and prognostic value. Clin Liver Dis. 2008
May;12(2):261-76; vii.
15. Kumagi T, Onji M. Presentation and diagnosis of primary biliary
cirrhosis in the 21st century. Clin Liver Dis. 2008 May;12(2):243-59; vii.
16. Bogdanos DP, Invernizzi P, Mackay IR, Vergani D. Autoimmune liver
serology: current diagnostic and clinical challenges. World J Gastroenterol.
2008 Jun 7;14(21):3374-87.
17. Mendes F, Lindor KD. Antimitochondrial antibody-negative primary
biliary cirrhosis. Gastroenterol Clin North Am. 2008 Jun;37(2):479-84, viii.

Nanotecnología aplicada al
Laboratorio Clínico
MARÍA GUTIéRREZ AGULLÓ
Servicio de Bioquímica Clínica, Hospital Universitari Vall
d’Hebron, Barcelona
Introducción
La nanotecnología (NT) es una ciencia relativamente joven
que ha generado grandes expectativas en muchas áreas de
conocimiento, especialmente en la nanomedicina. Las
mayores inversiones (unos 68.000 millones de dólares
anuales) se centran en manipulación y distribución de
fármacos, diagnóstico por la imagen, tratamiento y
diagnóstico del cáncer, terapia celular y cirugía. No obstante
las aportaciones de la NT a este campo se consideran
actualmente una promesa más que un hecho, debido a una
actitud de precaución por los riesgos por toxicidad, más
documentados que los beneficios, en las aplicaciones in vivo.
En general, las técnicas de diagnóstico in vitro son poco
populares, pero están experimentando avances nada
despreciables precisamente por su bajo contacto con el
paciente, que además en todos los casos es muy poco invasivo.
Precisamente por este desconocimiento, una revisión
bibliográfica puede ser una buena forma de aproximarse a los
conceptos y aplicaciones más relevantes en Nanotecnología
relacionados con el laboratorio de diagnóstico clínico.
Material y Métodos
Se realizó una búsqueda bibliográfica estratificada en el
Medline, con diferentes criterios en función de los objetivos.
En una primera aproximación se utilizaron los términos
Nanotechnology or Nanobiotechnology or Nanodiagnostics.
Posteriormente se añadieron restricciones como clinical o in
vitro diagnostics y se realizaron búsquedas especializadas por
tecnología o por aplicación, como Quantum Dots, Gold
Nanoparticles, Nanowires, etc. con la posterior adición del
término clinical. También se utilizaron los recursos
electrónicos de los principales organismos de referencia como
la National Nanotechnology Initiative (NNI) o
Nanotechnology and Nanoscience.
Resultados
Los resultados obtenidos a través de las distintas estrategias
de búsqueda muestran considerables diferencias según los
términos y criterios utilizados. La disminución en el número
de artículos en función de las restricciones aplicadas es muy
diferente si se comparan los resultados obtenidos al emplear
los términos generales o específicos, lo que proporciona cierta
idea de la heterogeneidad del contenido de muchas
publicaciones y de su dependencia con el nivel de
especialización (Tabla I). El número de publicaciones en
general (NT) aumenta de forma lineal a lo largo de los años,
siendo actualmente de casi 20.000 publicaciones (2009).
Tabla I. Análisis de resultados de búsqueda aplicando diferentes tipos de
restricciones.
Términos de la búsqueda Número de publicaciones Porcentaje
respecto al
número inicial
Sin límites Límites + “Clinical”
Nanotechnology (NT) 19246 1716 677 39%
Nanobiosensor 19559 28 3 11%
Nanowire OR Nanotube 11659 11691 135 1%
Gold Nanoparticles OR
Gold Nanoshells
4802 4473 151 3%
Quantum Dots 4475 3273 115 4%
NT + Diagnosis - 5533 558 10%
NT + Drug - 2893 2653 92%
NT + DNA - 2094 1835 88%
NT + Cancer - 1107 989 89%
NT + Diagnosis in vitro - 459 444 97%
NT + Point-of-care - 56 53 95%
Revisión
nAnoBioTeCnoLoGíA
Según la NNI, la NT se define como el desarrollo tecnológico
y la investigación a escala atómica, molecular o
macromolecular, para la creación controlada y uso de
estructuras, dispositivos y sistemas que deben cumplir dos
requisitos: tener un tamaño entre 1-100 nm y mostrar
propiedades diferentes (gravedad, tensión superficial,
resonancia…) debido a su tamaño. Es importante no
confundir la miniaturización con la nanotecnología: debe
existir alguna propiedad adicional determinada por la escala
y no sólo la ventaja de ser más pequeño, por lo que el DNA y
toda la tecnología derivada (biochips, microarrays, etc),
aunque coincidan en dimensiones, no debe ser considerada
como tal.
nAnoCABLeS y nAnoTuBoS
Los nanocables son partículas metálicas semiconductoras con
una elevada relación superficie-volumen: menos de 1 μm de
diámetro y longitud variable. Son particularmente
interesantes en el análisis múltiple de biomoléculas por su
estructura: segmentos de dos o más metales de longitud
variable que identifican a cada nanotubo con una secuencia
única, discriminable y cuantificable. Además la composición
metálica permite una gran versatilidad en el tipo de detección
(óptica, electroquímica, basada en la masa…) y en el tipo de
análisis. Esto significa una gran plasticidad en el diseño del
tipo de análisis según el objetivo del usuario: determinar una
molécula de interés a baja concentración en una matriz
compleja o determinar muchas moléculas diferentes en un
solo paso. Actualmente existen aplicaciones que emplean de
10 a 100 nanotubos y que permiten el análisis simultáneo de
30 SNP (Single Nucleotide Polimorfism) o la identificación de
secuencias de DNA de menos de 100 pmol en un solo paso y
sin riesgo de contaminación.
QuAnTuM DoTS
Los quantum dots (QD) son partículas de materiales
semiconductores altamente fluorescentes que son excitados
por un amplio espectro de longitudes de onda pero que tienen
un estrecho espectro de emisión. Se estructuran en un núcleo
y una envuelta de diferente composición (habitualmente
cadmio/selenio y cinc/azufre, respectivamente) de forma que
[59]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
el espectro de emisión de cada parte es diferente, único y
modulable lo que constituye su propiedad más relevante para
el diagnóstico in vitro. Con el uso de 6 colores y 10 niveles de
intensidad se pueden codificar teóricamente 106 dianas
diferentes, por lo que se está desarrollando su uso en el
screening múltiple de alta resolución de ácidos nucleicos y
proteínas. Actualmente hay datos impresionantes sobre las
aplicaciones de los QD a la bioquímica clínica y la genética:
hasta 40.000 análisis de forma simultánea (30). Pero tienen
dos grandes inconvenientes: no emiten en el infrarrojo
cercano, lo que impide su uso en el análisis de sangre total, y
tienen una hidrosolubilidad y una biocompatibilidad muy
baja, lo que limita su uso en matrices biológicas, además de su
elevada toxicidad. Es posible la conjugación con moléculas
orgánicas como oligonucleótidos, anticuerpos o incluso
estreptavidina, pero hasta ahora los métodos disponibles
tienen un rendimiento muy bajo y encarecen mucho el
proceso de síntesis.
nAnoPARTíCuLAS De oRo
Las nanopartículas y nanoshells (nanocorazas) de oro (Gold
Nanoparticles GNP o Gold Nanoshells GNS) son partículas
formadas por esferas concéntricas (centro y coraza) de un
mismo material (en general sulfito de oro) pero de diferente
grosor. Esto permite determinar los índices de refracción de
moléculas de interés adsorbidas a estas superficies, con la
posterior cuantificación e identificación. Las GNP
proporcionan una gran sensibilidad para la detección de DNA
y proteínas con una gran especificidad: detección de
moléculas sin unión a un ligando específico, con demasiados
ligandos o con uniones inespecíficas. Aunque las primeras
medidas se llevaron a cabo mediante resonancia superficial
de plasmón, hoy en día es posible adaptar los GNP a la
detección óptica, hecho que ha supuesto la aparición de un
gran número de técnicas analíticas basadas en GNP y GNS.
Uno de ellos es el análisis con biocódigo de barras (Biobarcode
assay, BCA) que es probablemente una de las mayores
promesas de la incorporación de la NT al laboratorio clínico.
Ya existe una técnica validada capaz de detectar
concentraciones de PSA (antígeno prostático específico) de 30
amol/l (10-18 mol/l) en 10 μl de sangre total. También existe
un método para la detección de ligandos difusibles derivados
de péptidos β-amiloides (ADDL) para el diagnóstico precoz
de la enfermedad de Alzheimer, que inicialmente fue
descartado por su baja concentración fuera del sistema
nervioso. El BCA, con una sensibilidad 106 veces mayor que
un ELISA convencional (del orden de 500 zmol/l, 10-21 mol/l)
ha permitido su rescate y abre todo un abanico de
posibilidades en la búsqueda, cuantificación y evaluación de
biomarcadores. Esta elevada sensibilidad, la eliminación de la
amplificación con la consiguiente reducción del riesgo de
contaminación y la toxicidad nula hacen que este conjunto de
técnicas haya sido calificado por muchos autores como la
mejor alternativa a la PCR.
nAnoCAnTiLéVeRS
Los nanocantilévers son capaces de transformar una reacción
química en un evento mecánico que puede ser medido
directamente por la desviación de la luz en la superficie del
material (son como trampolines: un extremo se acaba
curvando porque ocurre algo en él). Esta tecnología también
se plantea como una alternativa a la PCR y como
complemento a los microarrays de proteínas. Los
[60]
nanosensores basados en esta tecnología también se conocen
como biosensores sin etiqueta (label-free biosensors) porque
no es necesario marcar o copiar la molécula diana; esto ha
determinado la aparición de un gran número de aplicaciones,
como la detección de secuencias de DNA, genotipado y
detección de virus y bacterias, entre otras. Es uno de los
sectores de la NT más explotados actualmente, como
demuestran las más de 25 compañías que se dedican a la
comercialización de kits basados en esta tecnología.
nAnoTeCnoLoGíA y PRueBAS en CABeCeRA De PACienTe (PoinT oF
CARe, PoC)
A pesar de que, a priori, las aproximaciones del POC a la NT
deberían ser abundantes, en general la literatura al respecto
es muy pobre, con trabajos todavía muy inmaduros y de bajo
interés clínico. A pesar de todo son destacables las
aportaciones en el campo de la enfermedad cardiovascular,
con el desarrollo de paneles con más de 20 marcadores
basados en nanocables, y en el de las enfermedades
infecciosas, probablemente el área más desarrollada. Existen
bastantes técnicas basadas en GNS, nanotubos y
nanocantilévers dirigidas a la detección (múltiple) e
identificación de microorganismos y otros agentes infecciosos
en el ámbito del POC.
Conclusiones y Discusión
Existe suficiente literatura como para poder afirmar que la
nanotecnología aplicada al laboratorio de diagnóstico clínico
ya no es ciencia ficción. No obstante, el nivel de implantación
es bajo. Las técnicas basadas en NT prometen incorporar al
laboratorio de diagnóstico clínico básicamente las siguientes
mejoras: mayor sensibilidad y rapidez, menor coste y análisis
múltiple con mayores prestaciones. La crítica más importante
es la escasez de datos: faltan estudios de validación analítica,
de practicabilidad, de aproximación económica, de
adecuación a la demanda o a las necesidades reales tanto de
los clínicos como de los profesionales del laboratorio. Las
nanotécnicas son una potente herramienta para el
laboratorio, pero su incorporación debe hacerse con rigor y
precaución, siendo los profesionales del laboratorio de
diagnóstico clínico los responsables de que ésta se lleve a cabo
correctamente.
BIBLIOGRAFÍA
H M Azzazy, M M Mansour, S C Kazmierczak. Nanodiagnostics: a new
frontier for clinical laboratory medicine. Clin Chem 2006, 52 (7) 1238–1246.
K K Jain. Nanotechnology in clinical laboratory diagnosis. Clin Chim Acta
2005; 358: 37-54
B He, T J Morrow, C D Keating. Nanowire sensors for multiplexed detection
of biomolecules. Curr Opin Chem Biol. 2008 October; (5): 522–528.
E D Goluch, J M Nam, D G Georganopoulou, T N Chiesl, K A Shaikh, K S
Ryu et al. A bio-barcode assay for on-chip attomolar-sensitivity protein
detection. Lab Chip. 2006;6 (10):1293-1299.
A Condon. Designed DNA molecules: principles and applications of
molecular nanotechnology Nat Rev Genetics 2006; 7: 565–575
H M Azzazy, M M Mansour In vitro diagnostic prospects of nanoparticles.
Clin Chim Acta. 2009; 403 (1-2):1-8.

Utilidad diagnóstica y
pronóstica de la detección
de mutaciones en el gen p53
en muestras de tejido
pulmonar
SILVIA MARTÍNEZ COUSELO
Servicio de Bioquímica. Hospital de la Santa Creu i Sant
Pau, Barcelona
Introducción
El cáncer de pulmón es una de las entidades tumorales
con peor pronóstico, por lo que se precisa de nuevos
marcadores que permitan seleccionar pacientes con mayor
riesgo de recidiva tras el tratamiento quirúrgico, y en los
cuales terapias más agresivas podrían estar indicadas (1,2).
El enfoque molecular de la carcinogénesis ha permitido
ampliar el conocimiento del cáncer de pulmón y enfocarlo
como una enfermedad genética. Varias mutaciones se han
relacionado con el cáncer de pulmón en las últimas décadas,
pero ninguna ha mostrado la suficiente sensibilidad y
especificidad (3,4,5). El gen p53 es el gen supresor tumoral
que se encuentra con más frecuencia alterado en los tumores
humanos, observándose en el 66% de los pacientes afectos de
cáncer de pulmón y en un 50% de los carcinomas de células
no pequeñas (3,5,7). Las mutaciones en el gen K-ras se han
descrito en un 25-48% de los adenocarcinomas pulmonares,
y la actividad telomerasa se expresa en el 85% de los tumores
y se asocia a un peor pronóstico y a una menor supervivencia
en pacientes con cáncer de pulmón (6,8).
Objetivos
Estudio prospectivo de la sensibilidad diagnóstica y
pronóstica de la detección de mutaciones p53, así como
del análisis combinado (mutaciones p53, K-ras y actividad
telomerasa). Analizar si la presencia de las mutaciones p53
se asocia al tipo histológico, estadio tumoral, diferenciación
celular y hábito tabáquico y finalmente, estudiar la frecuencia
y localización de los diferentes tipos de mutaciones p53 y su
asociación a las variables estudiadas.
Material y métodos
Se obtuvieron de forma prospectiva un total de 58 muestras
de tejido tras resección quirúrgica del tumor en pacientes
con sospecha de cáncer de pulmón. El diagnóstico final de
los individuos evaluados se estableció y confirmó gracias al
curso clínico, técnicas de imagen, análisis cito-histológico y/o
estudio anatomopatológico del tejido reseccionado. Así del
total de 58 pacientes, 54 presentaron tumores malignos de los
cuales 46 fueron tumores primarios de pulmón (20 de tipo
adenocarcinoma, 18 carcinomas escamosos y 8 carcinomas
de células grandes), 7 fueron metástasis pulmonares (6
adenocarcinomas y 1 metástasis de osteosarcoma), y 1
mesotelioma. Únicamente en 4 casos de sospecha clínica de
cáncer de pulmón, los tumores reseccionados resultaron ser
de baja malignidad o benignos (figura 1). La detección de
mutaciones p53 se realizó mediante una primera reacción en
Adenocarcinoma pulmón
Carcinoma escamoso
Tumor carcinoide
Mesotelioma
Adenocarcinoma metastásico
Carcinoma células grandes
Nódulo benigno
Metástasis osteosarcoma
Figura 1. Clasificación histológica de los tumores estudiados
cadena de la polimerasa (PCR) de amplificación optimizada
por separado para los exones: 5-6, 7 y 8-9, seguida de
una purificación del ADN amplificado, y posterior PCR
de secuenciación para cada fragmento. Las secuencias
obtenidas se interpretaron y alinearon con la cadena de
ADN madre permitiendo la detección de polimorfismos
y mutaciones así como de cadenas wild type. La detección
de mutaciones en el gen K-ras y la actividad telomerasa en
estas muestras habían sido estudiadas por nuestro grupo en
trabajos anteriores. El estudio de mutaciones K-ras se realizó
mediante el método de los polimorfismos de los fragmentos
de restricción (RFLP) en productos amplificados por PCR, y
enriquecimiento por digestión enzimática continua. Mientras
que la actividad telomerasa se determinó mediante el método
Telo TAGGG Telomerasa PCR-ELISA de Roche® que se basa
en la amplificación de las secuencias teloméricas repetidas y
lectura fotométrica.
Resultados
14%
31%
3% 3% 2% 2%
10%
35%
La sensibilidad diagnóstica global de la detección de
mutaciones p53 fue del 39%, un 35% en adenocarcinoma,
un 33% en carcinoma escamoso y un 62% en carcinoma de
[61]

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
células grandes. El análisis combinado de las mutaciones
p53, K-ras y actividad telomerasa dio lugar a una
sensibilidad diagnóstica del 84% (80% en adenocarcinoma,
86% en carcinoma escamoso) y permitió observar que la
presencia de la mutación p53 incrementaba la sensibilidad
diagnóstica global y, de forma significativa, la sensibilidad
en el carcinoma escamoso, donde la detección de K-ras es
infrecuente (figura 2). No se detectaron mutaciones en los
nódulos benignos ni en los tumores de baja malignidad.
Posteriormente, se evaluó la asociación de la detección de
mutaciones p53 a las variables tumorales estadio tumoral,
100
90
80
70
60
% 50
40
30
20
10
0
grado de diferenciación y hábito tabáquico sin observarse
asociación estadísticamente significativa entre ellas. De las
21 mutaciones detectadas, localizadas principalmente en los
exones 5 y 8, las más frecuentes fueron las transiciones G-A
(57%) y las transversiones G-T (24%), otras transversiones
detectadas fueron G-C, A-T y CG-AT, y una delección de
4 pares de bases. El 80% de los pacientes con transversión
G-T eran fumadores; este tipo de mutación se observó en
pacientes con carcinoma escamoso y carcinoma de células
grandes y se asociaron a un mejor pronóstico. Un 67% (8/12)
de los pacientes con transición G-A presentaron tumores de
tipo adenocarcinoma, en su mayoría (6/8) en estado avanzado
y su presencia se asoció a un peor pronóstico. No se observó
relación estadísticamente significativa entre la presencia
de mutaciones p53 y la supervivencia global y libre de
enfermedad. En el análisis combinado p53 y K-ras se observó
una mediana de supervivencia libre de enfermedad superior
en los pacientes que no presentaron las mutaciones p53 ni
K-ras; sin embargo, su asociación no fue estadísticamente
significativa. El análisis estadístico de los resultados
obtenidos fue realizado mediante el programa estadístico
SPSS 15.0 para Windows. Se aplicó la prueba estadística de
χ2 de comparación de medianas aplicando la corrección
[62]
32
100 100
16
p53 K-ras AT p53, K-ras y/o AT
63
Sensibilidad Especificidad
84
75 75
Figura 2. Sensibilidad y especificidad diagnósticas de la detección
de mutaciones p53, K-ras y/o actividad telomerasa en muestras de
tejido pulmonar.
de Yates y la prueba estadística exacta de Fisher cuando el
número de casos esperados era muy bajo. Para el análisis
de la supervivencia se empleó el método de Kaplan-Meier y
comparación Log-Rank, y para analizar la utilidad pronóstica
la regresión de Cox.
Conclusiones
La detección de mutaciones p53 fue similar para los dos tipos
histológicos mayoritarios, adenocarcinoma y carcinoma
escamoso. En el adenocarcinoma la detección de mutaciones
p53 se asoció a estadios más avanzados, mientras que en el
carcinoma escamoso se detectó en estadios más tempranos
y localizados. El análisis combinado de la detección de
mutaciones p53, K-ras y actividad telomerasa, incrementó la
sensibilidad diagnóstica global y, de forma significativa, la
sensibilidad en el carcinoma escamoso, donde es infrecuente
la detección de mutaciones K-ras.
Las mutaciones p53 más frecuentes fueron las transiciones
G-A detectadas en adenocarcinomas avanzados y su presencia
se asoció a un peor pronóstico, y las transversiones G-T
observadas en carcinomas escamosos y en carcinomas
de células grandes se asociaron a un mejor pronóstico.
Se observó una mayor proporción de fumadores entre los
individuos que presentaban transversiones G-T.
La mediana de supervivencia libre de enfermedad fue
superior en los pacientes que no presentaron mutaciones en
el gen p53 ni en el gen K-ras, sin embargo, la relación entre la
presencia de estas mutaciones y la supervivencia global y libre
de enfermedad no fue estadísticamente significativa.
BIBLIOGRAFÍA
1. Guia de práctica clínica en Cáncer de Pulmón. Programa de Cáncer, 2004.
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Adaptación OncoGuia de pulmón.
2. OncoGuia de pulmón. Barcelona: Agencia de Evaluación de Tecnología e
Investigación Médicas. CatSalut. Departamento de Sanidad y Seguridad
Social. Generalitat de Catalunya. Noviembre 2003 (OG02/2003).
3. Mitsuo Sato MD, David S. Shames, Adi F. Gazdar MD, John D. Minna. A
Translational View of the Molecular Pathogenesis of Lung Cancer. J Thorac
Oncol 2007; 2: 327-343.
4. Forgacs E, Zöchbauer-Müller S, Oláh E, Minna J. Molecular Genetic
Abnormalities in the Pathogenesis of Human Lung Cancer. Pathology
Oncology Research 2001; 7(1): 6-13.
5. Sánchez-Cespedes M, Rossell R. Cáncer de pulmón. II Curso de la Escuela
Europea de Oncología. Centro Nacional de Investigación Oncológica
(CNIO), 2005.
6. Mora J, Gómez G, Martínez S, Urgell E, Zapico E, Comas L, Boluda R,
Antonijuan A, González-Sastre F. Detección tisular de mutaciones K-ras en
cáncer de pulmón: contribución a los resultados de CEA y CYFRA 21-1 en
suero. Resultados preliminares. Química Clínica 2004; 23(1): 20-24.
7. Sigal A, Rotter V. Oncogenic Mutations of the p53 Tumor Suppressor: The
Demonds of the Guardian of the Genome. Cancer Res 2000; 60: 6788-93.
8. Targowski T, Jahnz-Rózyk K, Szkoda T, Plusa T, From S. Telomerase
activity in transthoracic fine-needle biopsy aspirates from non-small cell
lung cancer as prognostic factor of patients’ survival. Lung Cancer
2008;61(1): 97-103.

Tirotropina y hormonas
tiroideas discordantes
ANA Mª SANTO QUILES
Servicio de Análisis Clínicos. Hospital General de Elda
Virgen de la Salud.
INTRODUCCION
Las enfermedades tiroideas son las patologías endocrinas más
frecuentes (1) y las pruebas bioquímicas constituyen el pilar
fundamental para su diagnóstico y seguimiento.
Cuando la función hipotálamo-hipofisaria es normal y el eje
está conservado, la relación entre las concentraciones de TSH
y hormonas tiroideas es una relación inversa logarítmicalinear
que resulta del mecanismo de feedback negativo de las
hormonas tiroideas sobre la tirotropina (TSH) (2). A veces,
esta relación está alterada y podemos encontrar hormonas
tiroideas discordantes. Esto lleva a una situación de
desconcierto para el clínico, incluso a una toma de decisiones
erróneas y tratamientos inapropiados, por lo que es muy
importante conocer los factores que condicionan y afectan la
interpretación de la valoración bioquímica de la función
tiroidea en la práctica clínica (3).
OBJETIVOS
1. Establecer los pasos a seguir ante situaciones con hormonas
tiroideas elevadas asociadas a TSH inapropiadamente alta y
discrepancia con la clínica mediante la presentación de varios
casos.
2. Establecer el algoritmo de actuación en las pruebas de
función tiroidea en caso de discrepancia.
METODOS
Realización sobre tres pacientes con hormonas tiroideas
discordantes con situación clínica diferente. Se realizan:
- Determinación de la concentración de TSH y hormonas
tiroideas libres mediante inmunoanálisis en “un paso” de
Electroquimioluminiscencia (EQLA) en el autoanalizador
Modular E-170 (Roche Diagnostics®).
- Determinación de la concentración de TSH y tiroxina libre
(T4L) y triyodotironina libre (T3L) en un inmunoanálisis en
“dos pasos” quimioluminiscente de micropartículas (CMIA),
en el autoanalizador Architect (Abbott ®). Como método
alternativo de comprobación.
- Dilución seriada de las muestras con el Diluent Universal
Cobas Analizer
- Determinación de la concentración de anticuerpos
antimicrosomales (Ac Anti-TPO) y anitcuerpos
antitiroglobulina (Ac Anti-TG) por enzimoinmunoanálisis
de micropartículas (Axsym, Abbot®)
- Determinación de la concentración de anticuerpos antireceptor
de TSH por enzimoinmunoanálisis competitivo
(Medipan, Medizym®)
- Determinación de la concentración de Tiroglobulina (TG)
por quimioluminiscencia (Immulite 2000, Siemens®).
- Extracción con PEG-6000 al 25% para Macro-TSH
- Determinación de la concentración de anticuerpos anti-T4 y
anti-T3 por método específico de radioinmunoprecipitación.
T3 ó T4 marcadas con I125 (Coat-A-Count Total T4,
SIEMENS Medical Solutions Diagnostics®).
RESULTADOS
Paciente 1. Varón de 60 años de edad con patología tiroidea
conocida y concentraciones de TSH de 77 mU/L ( valores de
referencia: 0,38-4,84) y de T4L de 11 ng/L (valores de
referencia: 0,8-2,0). Resultó Incumplimiento Terapéutico.
Paciente 2. Mujer de 61 años con TSH de 5,34 mU/L y T4L de
26 ng/L. Ac anti-TPO, Ac anti-TG, proteína transportadora
de hormonas sexuales (SHGG) y subunidad alfa dentro de la
normalidad. Se cumple linealidad en las diluciones de TSH,
descartando interferencias. La T4L y T3L no se pueden diluir
por lo que se comprueban resultados mediante un método de
dos pasos observándose una discrepancia de resultados
interlaboratorios. Se decide realizar determinaciones de
anticuerpos anti-T4L y anti-T3L decartándose su presencia.
Resultó interferencia metodológica de causa desconocida.
Paciente 3. Niña de 4 días con TSH 112 U/L en cribado
neonatal en muestra de sangre sobre papel de filtro.
Extracción venosa a los 11 días (recomendaciones de la
NACB), obteniéndose los siguientes valores de TSH 96,3 U/L,
T4L 1.9 μg/L y TG 68 μg/L (1-48 μg/L) con Ac antiTG
negativos (

Roche Diagnostics informa Especial 6 as Jornadas para Residentes | Octubre 2010
1. Comprobar el resultado, repitiendo la
determinación en la misma alícuota y a ser
posible en otra distinta de la misma muestra
para descartar un error puntual o
contaminación. Además descartar errores de
identificación y visualizar la muestra
comprobando su buen estado.
2. Si se confirman los valores sería
conveniente comentar la problemática con el
médico solicitante y recabar información
sobre el paciente como posibles tratamientos
que pudieran dar origen a interferencias y la
clínica que le ha llevado a solicitar la prueba,
o incluso contactar con el paciente si tiene un
tratamiento tiroideo establecido para valorar
un posible incumplimiento terapéutico.
Pacientes incumplidores que unos días antes
de realizarse la analítica de control reanudan
el tratamiento, la T4L alcanza valores
normales mientas que la TSH se adapta muy
lentamente.
3. Hacer nueva extracción para descartar
errores preanalíticos o interferencias
puntuales. A partir de aquí, si se siguen
confirmando los valores, continuar con una
serie de pasos:
4. Comprobar el cumplimiento de diluciones
de la muestra para TSH para descartar
anticuerpos heterófilos o anticuerpos
antiTSH (3). No se recomienda hacer
diluciones de las muestras en los análisis de
T4L y T3L utilizados de rutina por los
laboratorios clínicos, porque estos
inmunoanálisis están influidos por la
concentración de las proteínas de transporte
y no dan respuestas lineales a las diluciones.
5. En cuanto a la determinación de hormonas tiroideas libres
puede haber problemas metodológicos en presencia de factor
reumatoide o alteraciones en las proteínas transportadoras
como en la Hipertiroxinemia disalbuminémica familiar. Se
requiere repetir y valorar los resultados de T4L y T3L
mediante un método alternativo que sea lo más diferente
posible al utilizado, tanto en procedencia de los anticuerpos
como en el tipo de señal y lectura.
6. También es importante excluir interferencias
metodológicas como anticuerpos anti-T4 y/o anti-T3 que
podemos comprobar mediante un método específico de
radioinmunoprecipitación.
Si tras todo ello no hemos llegado a la solución de la
discordancia de valores habrá que pensar en la posibilidad de
un tumor productor de TSH (TSHoma) o en la Resistencia a
Hormonas Tiroideas (RHT) haciendo un diagnóstico
diferencial entre ambos y sabiendo que en el caso del TSHoma
las técnicas de imagen como Resonancia Magnética Nuclear
(RMN) y Tomografía Computarizada (TC) serán de gran
ayuda en la evidencia de una masa hipofisaria mientras que
en el caso de la RHT, el diagnóstico definitivo lo da el estudio
molecular que se realizará como último paso una vez
excluidas el resto de posibles causas de secreción inapropiada
de TSH.
[64]
TSH normal o alta + T4L alta
TSH, T4L, T3L, SHGB, AC antiTPO, AC antiTG
Tener en cuenta clínica, fármacos, ENT…
T
¿Clínica de hipertiroidismo?
SI NO
SUBUNIDAD ALFA
ELEVADA NORMAL DESCARTAR PROBLEMAS
METODOLOGICOS:
- Diluciones seriadas de TSH
- IA en dos pasos de T4L y T3L
RMN
TSHoma
Hormonas tiroideas a familiares de primer
grado
Normal Alteradas
Estudio molecular
RHT
SI
TSH normal o alta + T4L alta
CONCLUSIONES
La presencia de factores que interfieren en los inmunoanálisis
es una realidad que nos obliga a los especialistas de
laboratorio a considerarlos y hacer que los clínicos tengan
justa conciencia de ellos. Ante concentraciones de hormonas
tiroideas libres elevadas y TSH inapropiada deben descartarse
en primer lugar problemas metodológicos y posponer
estudios y exploraciones de mayor coste económico, como las
pruebas de imagen y los estudios moleculares. Debemos
identificar la causa mediante el procedimiento analítico
apropiado en cada caso (figura 1).
BIBLIOGRAFIA
1. Monaco F. Classification of thyroid diseases: suggestions for a revision. J
Clin Endocrinol Metab 2003; 88(4):1428-32.
2. Guyton AC, Hall JE. Tratado de Fisiología Médica.11ed. Elsevier España.
2006; p.1040-42
3. Ismail A, Barth J. Editorial. Wrong biochemistry results. Interference in
inmunoassays is insidious and cold adversely affect patient care. BMJ 2001;
323:705-6.
4. Halsall DJ, Fahie-Wilson MN, Hall SK. Macro Thyrotropin-IgG complex
causes factitious increases in thyroid-stimulating hormone screening tests
in neonate and mother. Clin Chem 2006;52:1968-9.
5. Jones A, Honour J. Unusual results from immunoassays and the role of
the clinical endocrinologist. Clin Endocrinol 2006; 64:234-44.
NO
Ac anti-T4 y anti-T3
Figura 1. Algoritmo diagnóstico en pacientes con concentraciones inapropiadas de TSH para las
de hormonas tiroideas circulantes. T4L:T4 libre, T3L: T3libre, ENT: enfermedad no tiroidea, IA:
Inmunoanálisis, RMN: Resonancia magnética nuclear, RHT: Resistencia a hormonas tiroideas, Ac:
Anticuerpos.

Estudio de la relación entre
el polimorfismo i/d del gen
ace y la presión arterial
GEMMA SOLé I ENRECH
Laboratorio de Bioquímica Hormonal y Génica del
laboratorio clínico del Hospital Universitario de Bellvitge
L’Hospitalet de Llobregat (Barcelona).
Introducción y objetivos
La hipertensión arterial es una enfermedad multifactorial,
producida por la interacción de factores genéticos y
ambientales (1,2), que representa un gran problema de salud
en los países desarrollados (3). El principal mecanismo
regulador de la presión arterial es el sistema renina
angiotensina, y son los genes implicados en la síntesis de
proteínas de esta ruta metabólica los más estudiados en el
desarrollo de la hipertensión arterial. Entre ellos, el gen ACE
es el que ha recibido más atención por parte de los
investigadores, aunque los resultados obtenidos hayan
resultado contradictorios (4-9).
Por este motivo, el objetivo de este trabajo ha sido averiguar
la relación existente entre el polimorfismo I/D del gen ACE y
la presión arterial.
Material y métodos
eSTuDio PoBLACionAL
Se ha realizado un estudio retrospectivo a partir de una base
de datos con 806 individuos, en la que se han considerado
diferentes factores históricamente relacionados con la
variación de la presión arterial. éstos son: el sexo (6,10), la
edad, la dieta, la ingesta de alcohol, el hábito de fumar, el
escaso ejercicio y la obesidad (10). Se ha determinado el
genotipo del gen ACE realizado mediante PCR a tiempo real.
También se ha estudiado el perfil tensional de estos
individuos mediante la monitorización ambulatoria de la
presión arterial (MAPA) (11), y así se ha clasificado la
población en función de un perfil considerado normal
(dipper) o no (no dipper, extrem dipper o riser) en base a las
diferencias de presión arterial nocturna observadas, ya que
un perfil “anormal” es indicador de mal pronóstico de la
enfermedad (12). Se ha calculado la presión de pulso ([(PA
sistólica diurna - PA diastólica diurna) + (PA sistólica
nocturna-PA diastólica nocturna)] / 2), ya que es un marcador
de riesgo cardiovascular asociado con la edad y con la
enfermedad renal (13,14).
Se ha recopilado información sobre el tratamiento
farmacológico recibido en la primera visita.
TRATAMienTo eSTADíSTiCo
Se ha utilizado la prueba de Chi-cuadrado para comparar
variables cualitativas. Las variables cuantitativas se han
analizado mediante las pruebas no paramétricas de Kruskal-
Wallis y U de Mann-Whitney. Finalmente, se ha realizado un
análisis de regresión lineal múltiple para evaluar el efecto del
genotipo sobre la presión arterial controlado por variables de
confusión.
Resultados y discusión
ReLACión enTRe LA PReSión ARTeRiAL y eL PoLiMoRFiSMo i / D
DeL Gen ACe
Las diferencias observadas entre el grupo que recibe
tratamiento y el que no, han llevado a realizar el estudio con
el grupo que no recibe ningún tratamiento antihipertensivo
ya que así, la presión no estará influida por esta variable.
Se ha comprobado que todos los grupos se encuentran en
equilibrio de Hardy-Weinberg para asegurar que las
diferencias de presión observadas no son debidas a la
distribución genotípica.
CoRReLACión eDAD-PReSión ARTeRiAL SeGún eL GenoTiPo
Mediante una correlación de Spearmann, se ha observado un
aumento de la presión de pulso con la edad. Esta variable no
es independiente del perfil tensional sistólico ya que, a pesar
de haber una relación significativa y positiva con la edad, ésta
puede ser más o menos intensa dependiendo del perfil dipper
o no dipper. De hecho, en el caso de los individuos dipper
para la presión sistólica, la edad prácticamente no influye en
la presión de pulso, presentan un coeficiente de
determinación (r2) de 0,04 (p= 0,01), en cambio en los no
dipper el coeficiente de determinación (r2) obtenido es de
0,36 (p

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DiFeRenCiAS De PReSión ARTeRiAL SeGún eL PeRFiL TenSionAL
y eL GenoTiPo
Al clasificar a los individuos según su perfil tensional, se
puede observar que la población dipper para la presión
sistólica presenta diferencias estadísticamente significativas
en la presión según el genotipo.
Por otro lado, cuando dentro de un mismo genotipo se
comparan las presiones de los individuos según si el perfil
tensional sistólico es dipper o no, se observan diferencias más
significativas en los individuos II para las presiones diurnas y
en los DD para las nocturnas. En cambio, las diferencias
observadas al considerar a los individuos según su perfil
tensional diastólico se atribuyen mayoritariamente a los
portadores del alelo D.
eSTuDio De ReGReSión LineAL MúLTiPLe
Debido a que las únicas diferencias de presión arterial
observadas al comparar las presiones de individuos con un
mismo perfil tensional se encontraron dentro del grupo
dipper (considerado normal), se elige este grupo para realizar
un análisis de regresión lineal, contemplando las variables
edad, sexo y genotipo.
Para introducir estas variables en el modelo, se codifican: a la
variable sexo se le otorga el valor 0 para los hombres y 1 para
las mujeres. En cuanto al genotipo, se otorga el valor 0 a los
individuos II y 1 a los portadores del alelo D, así se introduce
el polimorfismo como variable dicotómica en el modelo.
Los resultados de este análisis muestran como únicamente
existe una influencia significativa del genotipo en los valores
de presión arterial diastólica nocturna de los individuos
dipper sistólica y casi significativa en la presión arterial
diastólica diurna de los mismos individuos. En base a estos
resultados, se observa que un individuo portador del alelo D
(al que se le ha otorgado el valor de 1) tendrá la presión
arterial diastólica nocturna 6,57 mmHg más baja que un
individuo II, además, cuando este individuo vaya
envejeciendo restará 0,16 mmHg en la presión diastólica
nocturna por año celebrado. Si se añade a este ejemplo que el
sexo del individuo es femenino (al que le corresponde el valor
1), su presión diastólica nocturna será 3,6 mmHg inferior a la
de un hombre (tablaI).
Así pues, es posible concluir que existe una cierta tendencia a
tener valores de presión arterial diastólica nocturna más bajos
en los individuos portadores del alelo D y de sexo femenino lo
[66]
que aumentará su presión de pulso y posiblemente les
comportará un peor pronóstico de su hipertensión arterial.
Estos resultados coinciden con aquellos autores que afirman
la existencia de una relación entre la presión arterial y el
polimorfismo I/D del gen ACE pero sólo en referencia a las
presiones diastólicas (9) y son contrarios a aquellos que
afirman haber encontrado relación únicamente con el sexo
masculino (6). Así pues, a raíz de este trabajo es posible
sugerir un seguimiento más exhaustivo de los individuos que
cumplan las características anteriormente citadas (mujeres
mayores con genotipo DD o ID), a fin de evitar la
empeoramiento precoz de su presión arterial teniendo en
cuenta el riesgo cardiovascular que esto conlleva.
Sin embargo, es importante tener en cuenta que el
polimorfismo I/D del gen ACE sólo es uno de los muchos
factores que como se ha comentado influyen en el desarrollo
de la hipertensión arterial y que por tanto también deberán
tenerse en cuenta.
7. BIBLIOGRAFÍA
1. Maicas C, Lázaro E, Alcalá J, Hernández P, Rodríguez L. Etiología y
fisiopatología de la hipertensión arterial esencial. Monocardio Nº 2003;
5:141-160.
2. Alcasena MS, Martínez J, Romero J. Hipertensión arterial sistémica:
fisiopatología. Annales del sistema sanitario de Navarra 1998; 21(1).
3. Amado E, Brotons C, Dalfó A, Gilbert E, Pepió JM, Salleras N. Guías de
práctica clínica y material docente: hipertensión arterial. Institut Català de
la Salut 2003.
4. Berge KE, Berg K. No effect of insertion/deletion polymorphism at the
ACE locus on normal blood pressure level or variability. Clin. Genet 1994;
45:169-74.
5. Jeunemaitre X, Lifton RP, Hunt SC, Williams RR, Lalouel JM. Absence of
linkage between the angiotensin converting enzyme locus and human
essential hypertension. Nat Genet 1992; 1:72-5.
6. O’Donnell CJ, Lindpaintner K, Larson MG, Rao VS, Ordovas JM, Schaefer
EJ, Myers RH, Levy D. Evidence for association and genetic linkage of the
angiotensin-converting enzyme locus with hypertension and blood pressure
in men but not women in the Framingham Heart Study. Circulation 1998;
97:1766-72.
7. Schunkert H, Hense H.-W, Holmer SR, Stender M, Perz S, Keil U, Lorell
BH, Riegger GAJ. Association between a deletion polymorphism of the
angiotensin-converting-enzyme gene and left ventricular hypertrophy. New
Eng. J. Med 1994; 330:1634-38.
8. Lindpaintner K, Lee M, Larson MG, Rao VS, Pfeffer MA, Ordovas JM,
Schaefer EJ, Wilson AF, Wilson PWF, Vasan RS, Myers RH, Levy D.
Absence of association or genetic linkage between the angiotensinconverting-enzyme
gene and left ventricular mass. New Eng. J. Med 1996;
334:1023-28.
9. Martin P, Conde C, Casanegra A, Romero C, Tabares AH, Orías M.
Association of ACE genotype and predominantly diastolic hypertension: a
preliminary study. JRAAS 2007; 8:42–4.
10. Botey A, Revert L. Angiología e hipertensión arterial. A: Farreras P,
Rozman C. Medicina Interna. Decimotercera edición. Madrid: Elsevier.
1995.
11. MAPA: Monitorización Ambulatoria de Presión Arterial.
http://www.seh-lelha.org/club/cuestion71.htm
12. Pose Reino A, Calvo Gómez C, Hermida R, Pena Seijo M, Rodríguez
Fernández M, Díaz Díaz JL. Guías Clínicas de la Sociedad Gallega de
Medicina Interna: Indicaciones y Valoración de la MAPA. www.meiga.info/
guias/IndicacionesMAPA.asp13. Fernandez-Fresnedo G, Rodrigo E, Martin
de Francisco AL, Sanz de Castro S, Castañeda O, Arias M. Role of Pulse
Pressure on Cardiovascular Risk in Chronic Kidney Disease Patients. J Am
Soc Nephrol 2006; 17:S246–S249.
14. 2007 Guidelines for the Management of Arterial Hypertension. The Task
Force for the Management of Arterial Hypertension of the European Society
of Hypertension (ESH) and of the European Society of Cardiology (ESC).
Journal of Hypertension 2007; 25:1105–87.
15. Pinto E. Blood pressure and ageing. Postgrad. Med. J 2007; 83:109-1.

Inmunoterapia del cáncer
basada en células dendríticas
NATALIA SUáREZ FUENTETAJA
Servicio de Bioquímica Clínica. Clínica Universidad de
Navarra, Pamplona.
Las células dendríticas (CD) son una subpoblación
leucocitaria cuya función principal es la de reconocer
moléculas extrañas en el organismo, procesarlas y
presentarlas a los linfocitos T naïve, induciendo una respuesta
inmunológica antígeno específica (1). Proceden de una célula
madre pluripotencial CD34+ de la médula ósea, que puede
generar CD de estirpe mieloide (CD clásicas o
CD11c+CD123-) con una gran capacidad fagocítica y
productora de citoquinas como IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12
(2) y de estirpe linfoide (CD plasmocitoides o CD11c-
CD123+) con poca capacidad de endocitosis, que serán
grandes productoras de INF de tipo I tras exposición a virus.
Las CD se encuentran en el organismo en dos estadíos
diferentes: inmaduras y maduras. El cambio de un estado
inmaduro a uno maduro se produce cuando se activa el
programa de expresión génica conocido como maduración.
éste se manifiesta fenotípicamente por: i) pérdida de la
intensa capacidad fagocítica que tienen las CD en estado
inmaduro; ii) interrupción del procesamiento antigénico; iii)
cambios en los receptores de quimioquinas, con la finalidad
de alcanzar un fenotipo capaz de migrar a órganos linfoides
secundarios y presentar allí los antígenos a los linfocitos T
(3); iv) incremento de expresión en la superficie celular de
moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)
de tipo I y II; v) aumento de expresión de moléculas de
coestímulo como CD80, CD83, CD86 y CD40; vi) producción
de citoquinas y otros mediadores solubles proinflamatorios.
Los principales estímulos madurativos son: i) citoquinas
proinflamatorias; ii) la interacción con linfocitos T helper
activados; iii) el contacto con moléculas procedentes de
gérmenes como lipopolisacárido bacteriano, o material
genético de origen bacteriano o vírico.
La característica de ser las principales células presentadoras
de antígeno del organismo puede ser aprovechada para
generar una respuesta frente a antígenos específicos de tumor,
creando una inmunidad activa y promoviendo una memoria
inmunológica en el paciente oncológico. El beneficio de su
empleo en terapia del cáncer ha sido confirmado en múltiples
ocasiones en experimentación animal (4-8). Actualmente se
están desarrollando ensayos clínicos con vacunas de células
dendríticas, solas o en combinación terapéutica con
tratamientos convencionales, tales como la resección
quirúrgica del tumor, la radioterapia o la quimioterapia. La
base de estas vacunas de CD es potenciar in vitro la capacidad
de captación de antígenos de las CD del paciente, e inducir su
maduración de modo que activen todas las señales de
coestimulación y la producción de citoquinas
proinflamatorias necesarias para que, una vez reinfundidas al
paciente, puedan llevar a cabo su correcta función,
promoviendo una linfoproliferación de linfocitos T efectores.
Los protocolos de preparación de vacunas de DC, aunque con
algunas diferencias entre ellos, tienen una serie de
procedimientos comunes. Estos son:
1- Obtención de CD: Se pueden obtener de precursores
hematopoyéticos CD34+, o bien de monocitos CD14+, siendo
esta población la más empleada por estar presente en sangre
periférica a mayores concentraciones. Los monocitos se
obtienen de una leucoaféresis del paciente, tras selección
inmunomagnética para purificar CD14+, y tras 5-7 días de
cultivo en presencia de GM-CSF e IL-4 se diferencian a CD.
2- Carga antigénica de las CD: se realiza con péptidos
sintéticos o proteína recombinante (4), ARNm (9), ADNc,
mezclas antigénicas complejas (10-12) o inyección
intratumoral de CD inmaduras que tengan capacidad de
internalizar los antígenos en el propio microambiente
tumoral (13). Se piensa que mezclas de antígenos tumorales
químicamente indefinidos pueden inducir inmunidad
terapéutica con mayor eficacia al promover una respuesta
policlonal frente a todo el repertorio antigénico del tumor.
3- Pulso antigénico y maduración: debe realizarse con las CD
en estado inmaduro para que internalice los antígenos
tumorales del medio de cultivo, los procese y los presente en
superficie junto con MHC. Además, diferentes estimulos
madurativos provocaran el cambio de fenotipo y función en
las CD. Entre los principales estímulos se encuentran: el
INFα, el TNFα, la IL-1β, la PGE2 y el Poly I:C. Dado que todo
el procedimiento de preparación debe llevarse a cabo en
condiciones GMP (good manufacturing practice), esto
dificulta el empleo de productos microbianos como LPS, RNA
bicatenario u otros potentes estímulos probados en ratón.
4-Vía administración: es un tema de discusión, habiéndose
testado por vía subcutánea, intravenosa e intraganglionar.
También pueden ser administradas intratumoralmente, con
el problema de que un elevado porcentaje de las CD
administradas permanecerán retenidas en el microambiente
tumoral (14).
5-Seguimiento de la migración: si un porcentaje de las CD
administradas al paciente ha sido marcado con Indio111 la
distribución de las mismas en el organismo puede ser seguida
mediante gammagrafía. Otra opción son las partículas
superparamagnéticas de óxido de hierro de grado clínico, que
nos permiten ver la migración celular mediante resonancia
magnética nuclear (15).
En ocasiones estas vacunas son, a su vez, combinadas con
otras inmunoterapias con la finalidad de potenciar el efecto
de la vacuna de CD. Entre los diferentes agentes
inmunoterápicos destacan (16): i) la administración de
[67]

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citoquinas de un modo sistémico o bien la
programación génica de su sobreproducción
una vez son introducidas de nuevo en el
paciente oncológico; ii) la administración de
“vacunas pasivas”, como los linfocitos
infiltrantes de tumor (TIL), que son linfocitos
pbtenidos de biopsia tumoral y activados in
vitro, pero este tipo de inmunoterapia tiene el
inconveniente de que su efecto dura mucho
menos tiempo y es dependiente de dosis
continuadas; iii) el empleo de anticuerpos
como terapia adyuvante, así por ejemplo el
empleo de anti-CD25 y anti-CTLA-4
colabora a disminuir la actividad de las Treg,
una subpoblación linfocitaria que regula la
actividad de las células T efectoras; iv)
antimetabolitos como en 1-metiltriptófano,
análogo del triptófano, disminuye la
actividad de la enzima Indolamina-2,3
dioxigenasa, producida por las CD tras un
estímulo de INF-γ, que colabora a hacer
tolerante el microambiente tumoral.
Aunque aún no estamos preparados para una terapia tan
individualizada, y por tanto laboriosa y cara, los avances
tecnológicos empujan a la sociedad a una medicina más
personalizada, con estudios farmacogenómicos, pruebas
genéticas de enfermedades hereditarias y terapia celular. Por
tanto, teniendo en cuenta los beneficios que aporta la
inmunoterapia en el paciente, no sólo con relación a la
disminución de su enfermedad y la activación de un sistema
de alerta o vigilancia inmunológica frente a recidivas del
tumor, sino también a la calidad de vida que se refleja en
menos efectos secundarios durante el tratamiento, debe
potenciarse su combinación con las terapias ya conocidas a
modo de alcanzar una sinergia que permita potenciar la lucha
frente al cáncer.
Agradecimientos
Quisiera agradecer a mis codirectores de tesis: álvaro
González Hernández e Ignacio Melero Bermejo, con los que
me encuentro realizando investigación básica en
inmunoterapia del cáncer basada en células dendríticas.
Además, quisiera hacer mención al Departamento de Terapia
Génica y Hepatología del Centro de Investigación Médica
Aplicada (CIMA) y al Servicio de Oncologia Médica de la
Clinica Universidad de Navarra, con los que participo
activamente en un ensayo clinico en fase II para el
tratamiento de tumores sólidos con células dendríticas
autólogas del paciente.
[68]
Cultivo CD14 +
Leucoaféresis y selección
inmunomagnética de CD14 +
1
(monocitos)
4
Reinfusión de CD al paciente
Citoquinas/factores
que favorecen la
actividad de CD in
vivo
Diferenciar in vitro
a CD
(GM-CSF e IL-4)
2
Carga antigénica y
maduración de CD
CD maduras
CD inmaduras
REFERENCIAS
1- Melief, C.J., Cancer immunotherapy by dendritic cells. Immunity, 2008.
29(3): p. 372-83.
2- Clark, G.J., et al., The role of dendritic cells in the innate immune system.
Microbes Infect, 2000. 2(3): p. 257-72
3- Alvarez, D., E.H. Vollmann, and U.H. von Andrian, Mechanisms and
consequences of dendritic cell migration. Immunity, 2008. 29(3): p. 325-42.
4- Mayordomo, J.I., et al., Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with
synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour
immunity. Nat Med, 1995. 1(12): p. 1297-302.
5- Knight, S.C., et al., Influence of dendritic cells on tumor growth. Proc
Natl Acad Sci U S A, 1985. 82(13): p. 4495-7.
6- Celluzzi, C.M., et al., Peptide-pulsed dendritic cells induce antigenspecific
CTL-mediated protective tumor immunity. J Exp Med, 1996. 183(1):
p. 283-7.
7- Porgador, A., D. Snyder, and E. Gilboa, Induction of antitumor immunity
using bone marrow-generated dendritic cells. J Immunol, 1996. 156(8): p.
2918-26.
8- Zitvogel, L., et al., Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed
dendritic cells: dependence on T cells, B7 costimulation, and T helper cell
1-associated cytokines. J Exp Med, 1996. 183(1): p. 87-97.
9- Gilboa, E. and J. Vieweg, Cancer immunotherapy with mRNAtransfected
dendritic cells. Immunol Rev, 2004. 199: p. 251-63.
10- Stift, A., et al., Dendritic cell-based vaccination in solid cancer. J Clin
Oncol, 2003. 21(1): p. 135-42.
11- Cuadros, C., et al., Vaccination with dendritic cells pulsed with
apoptotic tumors in combination with anti-OX40 and anti-4-1BB
monoclonal antibodies induces T cell-mediated protective immunity in
Her-2/neu transgenic mice. Int J Cancer, 2005. 116(6): p. 934-43.
12- Avigan, D., et al., Fusion cell vaccination of patients with metastatic
breast and renal cancer induces immunological and clinical responses. Clin
Cancer Res, 2004. 10(14): p. 4699-708.
13- Huarte, E., et al., Intratumoural administration of dendritic cells:
hostile environment and help by gene therapy. Expert Opin Biol Ther, 2005.
5(1): p. 7-22.
14- Feijoo E., et al., Dendritic cells delivered inside human carcinomas are
sequestered by interleukin-8. Int J Cancer, 2005 Aug 20;116(2):275-81.
15- de Vries, I.J., et al., Magnetic resonance tracking of dendritic cells in
melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat Biotechnol, 2005.
23(11): p. 1407-13.
16- Melero, I., et al., Palettes of vaccines and immunostimulatory
monoclonal antibodies for combination. Clin Cancer Res, 2009. 15(5): p.
1507-9.
3

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[71]

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Avda. Generalitat 171-173
08174 Sant Cugat del Vallès
05878837001