Resumen - Sección Limnología

Universidad de la República
Montevideo, Uruguay
Tesis de Licenciatura en Bioquímica
2011
FLEXIBILIDAD FENOTÍPICA DE LA
CIANOBACTERIA INVASORA
Cylindrospermopsis raciborskii EN UN
GRADIENTE LUMÍNICO
Orientadora:
Dra. Sylvia Bonilla
Sección Limnología
Coorientador:
Dr. Luis Aubriot
Sección Limnología
Tribunal:
Dr. Daniel Naya
Sección Evolución
INDICE TEMÁTICO
María Amelia Fabre Iturburúa

1. Resumen 1
2. Introducción 2
2.1. Flexibilidad fenotípica del fitoplancton 2
2.2. Las floraciones de cianobacterias 6
2.3. La problemática de Cylindrospermopsis raciborskii 7
3. Hipótesis y predicciones 9
3.1. Hipótesis 1 9
3.2. Hipótesis 2 10
4. Objetivos 11
4.1. Objetivo general 11
4.2. Objetivos específicos 11
5. Metodología 12
5.1. Aislamiento y condiciones de cultivo 12
5.2. Determinación del crecimiento 12
5.3. Aproximación experimental 13
5.4. Determinación de la morfometría 14
5.5. Análisis de datos 14
6. Resultados 16
6.1. Aclimatación a las intensidades de luz 16
6.2. Respuesta morfológica 18
6.3. Crecimiento en un gradiente lumínico 21
7. Discusión 24
7.1. Aclimatación a las condiciones lumínicas 24
7.2. Flexibilidad morfológica 25
7.3. Ecoestrategia lumínica 26
7.4. Metodología y parámetros de crecimiento 27
8. Conclusiones y perspectivas 30
Agradecimientos 31
Referencias 32
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1. RESUMEN
Los organismos con flexibilidad fenotípica pueden aclimatarse a las variaciones ambientales
expresando caracteres alternativos que aumenten su aptitud a las nuevas condiciones.
Cuando el tiempo de respuesta del organismo le permite sincronizar sus cambios
fenotípicos con los ambientales, puede conferirle ventajas competitivas tanto en ambientes
fluctuantes como en la colonización de nuevos ambientes. La cianobacteria tóxica C.
raciborskii se ha expandido desde zonas tropicales hacia climas templados y subtropicales,
como en Uruguay, donde forma floraciones en sistemas destinados a potabilización. Dado
que esta especie presenta flexibilidad en varios aspectos fenotípicos, ésta podría ser una
propiedad importante para su comportamiento invasor. Trabajos previos relacionan dicho
comportamiento con su capacidad de crecer a bajas intensidades de luz, sin embargo, los
resultados obtenidos sobre su ecoestrategia lumínica son contradictorios. Con el objetivo
de esclarecer el comportamiento ecológico de la especie frente a la luz, se realizaron
experimentos de crecimiento en siete intensidades lumínicas (entre 10 y 350 µmol fotón m -2
s -1 ) de un aislamiento de Uruguay de C. raciborskii (MVCC19). Se realizó aclimatación previa
de los cultivos a las condiciones experimentales y se evaluó la tasa de crecimiento durante el
proceso de aclimatación y la flexibilidad morfológica al final de los experimentos. MVCC19
fue capaz de aumentar su tasa de crecimiento luego de diez días de aclimatación y su
ecoestrategia fue de luz alta con tolerancia a intensidades bajas. Luego de dos semanas se
evidenció la flexibilidad morfológica del organismo como cambios en la relación
superficie/volumen, la misma respondió de forma convergente frente a la limitación o la
inhibición (fotoinhibición) del crecimiento por la luz. Los resultados sugieren que la
capacidad de aclimatarse a los distintos ambientes lumínicos sería una de las claves del éxito
invasivo de C. raciborskii.
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2. INTRODUCCIÓN
2.1. Flexibilidad fenotípica del fitoplancton
Algunos ambientes naturales son altamente variables y muchos organismos tienen la
capacidad de alterar la expresión de algunos de sus caracteres fenotípicos frente a esas
variaciones (Piersma & Drent 2003). Esta propiedad se denomina plasticidad fenotípica y
puede mejorar la aptitud del organismo en las condiciones ambientales, proceso
denominado aclimatación (Walters 2005). Si bien la capacidad de aclimatación podría
representar una desventaja competitiva en ambientes estables, la misma sería una ventaja
fundamental en ambientes fluctuantes o en la colonización de nuevos ambientes (West-
Eberhard 1989, Auld et al 2010). Para que sea una ventaja para el organismo, los cambios
fenotípicos deben estar sincronizados con los cambios ambientales, de modo que el nuevo
fenotipo se exprese en el nuevo ambiente y no antes o después (Stomp et al 2008). La
importancia de la sincronización se ha demostrado en cianobacterias, por ejemplo en la
respuesta pigmentaria frente a cambios en el color de la luz y en la respuesta fisiológica
frente a fluctuaciones en la disponibilidad de nutrientes (Stomp et al 2008; Aubriot et al
2011, en prensa).
La mayoría de los ecosistemas acuáticos son altamente variables, por ejemplo en la
intensidad y la calidad de luz. Por ser uno de los recursos fundamentales para el
fitoplancton, la disponibilidad y variabilidad de la luz determinan las especies que puedan
desarrollarse en el ecosistema (Reynolds 1984). Por lo cual, muchos organismos que
componen el fitoplancton cuentan con caracteres fenotípicos flexibles (caracteres plásticos
reversibles) que les permiten aclimatarse a la variabilidad del ambiente lumínico. Además,
las fluctuaciones de luz en los ecosistemas naturales se dan en distintas escalas temporales,
desde mensuales (ciclos estacionales) hasta diarias (horas), como por ejemplo: fotoperíodo,
estado del tiempo (tormentas, nubes), propiedades ópticas inherentes del sistema acuático,
entre otros (Ferris & Christian 1991). En ecosistemas lénticos, la disponibilidad de la luz
está además condicionada por la hidrodinámica del sistema, que está a su vez determinada
por sus características morfométricas (profundidad, área, superficie). Todos esos factores
que determinan el ambiente lumínico que percibe el fitoplancton, pueden resumirse en la
relación entre las zonas eufótica y de mezcla (Zeu/Zm) (Reynolds 1984, Lambert &
Sommer 2007). La zona eufótica es la capa iluminada de agua, delimitada por la
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profundidad donde se registra el 1% de la luz en superficie. La zona de mezcla es la
profundidad de la capa de agua con temperatura homogénea (Lambert & Sommer 2007).
En lagos donde la zona de mezcla supera o iguala a la zona eufótica (Zeu/Zm ≤ 1), la luz
que reciben los organismos es fluctuante e incluye períodos de oscuridad total. Mientras
que en lagos poco mezclados puede darse Zeu/Zm ≥ 1, los organismos están expuestos a
la luz durante todo el día (Reynolds 1994). Las especies cuentan con adaptaciones
evolutivas a los diferentes ambientes lumínicos, que junto con la aclimatación a las
condiciones particulares, determinan su comportamiento ecológico o ecoestrategia. Las
especies con ecoestrategia de luz alta son aquellas con altos requerimientos lumínicos y por
eso colonizarán ambientes estratificados o con Zeu/Zm ≥ 1. En cambio, las especies con
ecoestrategia de sombra están adaptadas para crecer con baja intensidad de luz y
colonizarán preferentemente ecosistemas con Zeu/Zm ≤ 1.
Para definir la estrategia ecológica de una población respecto a la luz, se estudia su
respuesta en el crecimiento frente a un gradiente de intensidades de luz y se determinan los
parámetros α e I K (Figura 1). El parámetro α representa la pendiente inicial de la curva de
crecimiento en función de la intensidad de luz (I) y el índice de subsaturación, I K,
representa la cantidad máxima de fotones que la célula puede procesar (Falkouwski &
Raven 1997). Por encima del I K la tasa de crecimiento se estabiliza y ocurre el crecimiento
máximo (µ MAX). Si se aumenta aún más la intensidad de luz, la tasa de crecimiento puede
disminuir, fenómeno denominado fotoinhibición (Kirk 1994) (ver más adelante).
Los valores de I K para las especies con estrategia de luz alta serán superiores a los
correspondientes para la estrategia de sombra. Mientras que α tiende a ser mayor para las
especies con estrategia de luz baja respecto a las otras. Si bien I K es el más variable entre
ecoestrategias (MacIntyre et al 2002), α está fuertemente condicionado por éste y también
presentará variaciones. A su vez, estos parámetros pueden variar, aunque en menor medida,
dentro de cada ecoestrategia y dentro de cada especie o población. La variabilidad entre
poblaciones se debe en parte, a la existencia de ecotipos, siendo éstos los distintos clados
de organismos (pertenecientes a la misma especie) que difieren en su genotipo y algunas de
sus características fisiológicas y ecológicas (Cohan 2009). Otra fuente importante de
variabilidad dentro de las ecoestrategias es la aclimatación de las poblaciones a su ambiente
lumínico particular, o más específicamente, la fotoaclimatación (Walters 2005).
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μ (d -1 )
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Figura 1. Curva teórica de la tasa de crecimiento (µ) en función de la intensidad de luz (I) para una especie
con estrategia de sombra (línea gris oscuro) y de luz alta (línea gris claro). Se indican los parámetros: tasa de
crecimiento máxima (µmax), pendiente inicial de la curva (α), intensidad de luz de subsaturación (IK) y
pendiente de inhibición (β).
μ MAX
α IK
0 100 200 300 400
I (μmol fotón m -2 s -1 )
La fotoaclimatación esta regulada por señales que provienen de la propia fotosíntesis y
forman parte de los mecanismos de regulación homeostática (Walters 2005). Tales
mecanismos son diversos y se dan en diferentes escalas temporales. A corto plazo
(segundos-minutos) comprende procesos que no requieren de la síntesis proteica, como la
modificaciones en las vías de regulación. A mediano y largo plazo (horas-días-semanas), la
fotoaclimatación involucra la síntesis y degradación específica de grandes complejos
moleculares y variaciones en el número de fotosistemas, en la proporción entre los centros
de reacción de los fotosistemas I y II (PSI y PSII del inglés ‘photosystem’ respectivamente)
y en los centros de captación de energía (Bhaya et al 2002, Walters 2005).
Es frecuente que los organismos del fitoplancton estén expuestos a altas intensidades de
luz en los ecosistemas naturales, por ejemplo durante periodos de estratificación en el
verano. En este caso, la energía lumínica que percibe el organismo es elevada, incluso más
de la que puede ser procesada por el aparato fotosintetizador. El exceso de energía provoca
la excitación de las moléculas de clorofila a, que entonces pueden excitar al oxígeno
β
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formando oxígeno reactivo, que a su vez pueden derivar en otras formas también reactivas
de oxígeno (ROS: reactive oxygen species) (Müller et al 2001). Los ROS causan daño
oxidativo sobre las proteínas, los lípidos y los ácidos nucleicos, provocando en última
instancia la muerte celular (Müller et al 2001). Para evitarlo, la energía de excitación en
exceso de las moléculas de clorofila a puede decaer por emisión de fluorescencia o es
neutralizada por enzimas antioxidantes (Müller et al 2001). Sin embargo, cuando la
intensidad de luz supera la capacidad de estos mecanismos, provoca la fotoinhibición o
reducción de la eficacia fotosintética (Walters 2005). Algunos organismos pueden
aclimatarse a la luz alta mediante la modificación de estructuras y complejos moleculares,
así como también utilizando métodos de decaimiento energético alternativos no
fotosintéticos (NPQ: non-photochemical-quenching) (Müller et al 2001, Karapetyan 2007).
Dentro de los mecanismos NPQ más importantes se encuentran: la redistribución de la
energía de excitación entre los PS mediante el transporte rápido y reversible de electrones
(Campbell & Öquis 1996, Yang et al 2009); la síntesis de novo de moléculas dañadas y
reemplazo por otras más resistentes (ejemplo D1:1 y D1:2, Bhaya et al 2002); el
decaimiento térmico, por ejemplo mediante la zeaxantina (Demmig-Adams & Adams
2000); la disminución de la cantidad de clorofila a y aumento de carotenoides totales, que
actúan como quenchers (Schagerl & Müller 2006) y la biosíntesis de proteínas de estrés
HLIPs (high light-inducible polypeptides) (Wang et al 2008).
Las modificaciones moleculares pueden derivar en modificaciones estructurales si el
organismo es flexible. Por ejemplo, el empaquetamiento de los tilacoides (en eucariotas) o
de la membrana tilacoidal (en cianobacterias) modifica la superficie de exposición de los
complejos captadores de energía lumínica. A altas intensidades de luz, la membrana puede
empaquetarse de forma tal que la superficie expuesta disminuye. Por el contrario si la luz es
escasa, las células se verán favorecidas con empaquetamientos laxos que aumenten la
superficie expuesta (Kirk 1994). Además, la exposición de los tilacoides o de la membrana
tilacoidal se verá modificada si varía la relación entre la superficie y el volumen (S/V) de la
célula (Falkouwski & Raven 1997). En este caso, no solo se verá afectada la captación de
luz sino que también se condicionan la fisiología y el comportamiento ecológico de todo el
organismo (Reynolds 2006, Neselli-Flores et al 2007). La relación S/V está estrechamente
relacionada con el mantenimiento de la homeostasis, dado que determina la capacidad de
intercambio de sustratos (nutrientes y deshechos) con el medio circundante, a través de la
membrana plasmática (Lewis 1976). A mayor relación S/V, mayor es la velocidad de
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intercambio por difusión pasiva con el medio externo. A nivel ecológico, la relación S/V
influye sobre la velocidad de sedimentación y la susceptibilidad del organismo a ser
depredado (Reynolds 2006, Van Donk et al 2010). Por ejemplo, la cianobacteria unicelular
Cyanobium produce microestructuras en forma de espina en presencia del depredador,
Ochromonas sp. (Jezberová & Komárková 2007).
2.2. Las floraciones de cianobacterias
Dentro del fitoplancton, las cianobacterias son uno de los grupos más estudiados porque
frecuentemente dominan la comunidad en ecosistemas de agua dulce de todo el mundo
(Dokulil & Teubner 2000). Las cianobacterias planctónicas pueden producir toxinas y
desarrollar floraciones. Las floraciones son el aumento significativo de biomasa de una o
pocas especies en un período de tiempo corto (Smayda 1997). Aunque otros organismos
fitoplanctónicos también tienen el potencial de formar floraciones tóxicas (algunas
clorofitas y dinoflagelados), las cianobacterias son las más importantes en sistemas de agua
dulce (Huisman & Visser 2005). La dominancia de una o pocas especies de fitoplancton
afecta la estructura de las demás comunidades del ecosistema y provoca la disminución de
la diversidad biológica en los distintos niveles tróficos (Lehman et al 2010). Otra
consecuencia importante es la pérdida de la calidad de agua debida al olor y aspecto
desagradables generados por la gran cantidad de biomasa. Muchas veces se inhabilita al
ecosistema acuático como recurso, por ejemplo como fuente de agua para potabilización,
riego, pesca y/o recreación (Huisman & Visser 2005, Bonilla 2009).
Los principales factores que desencadenan las floraciones algales son el aumento de la
temperatura y de la disponibilidad de nutrientes, por lo cual son frecuentes durante el
período estival en lagos con alto estado trófico (eutróficos) (Jöhnk et al 2008, Paerl &
Huisman 2008). En Uruguay la eutrofización de sistemas de agua dulce ha aumentado en
los últimos tiempos como consecuencia de la creciente producción agrícola-ganadera y la
urbanización. Este fenómeno ha llevado a un incremento de los casos de floraciones de
cianobacterias potencialmente tóxicas en lagos y lagunas de todo el territorio (Scasso et al
2001, Bonilla 2009).
Las floraciones pueden clasificarse según su dinámica en el ecosistema en acumulativas o
dispersivas, que esta determinada por la ecoestrategia de las especies que las forman. En las
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acumulativas los organismos se encuentran en la superficie del lago mientras que en las
dispersivas están distribuidas en toda la columna de agua. Las floraciones acumulativas
generalmente se dan en lagos con poca mezcla o en el epilimnion de lagos mezclados
(Chorus & Bartram 1999). Las especies que forman este tipo de floraciones poseen una
ecoestrategia de luz alta, un ejemplo muy estudiado de este grupo es el género Microcystis
(Visser et al 2005). Por otro lado, las floraciones dispersivas tienen bajos requerimientos
lumínicos y toleran periodos de sombra. Éstas son comunes en lagos someros de alto
estado trófico, donde Zeu < Zm (Chorus & Bartram 1999), estos lagos son en general
polimícticos y a la vez turbios debido a la resuspensión de sedimento. Cuando se dan las
floraciones, la penetración de la luz disminuye aún más, favoreciendo las especies de
sombra, de forma tal que se favorecen con el aumento de su propia biomasa. Esto resulta
en un estado estable de autoperpetuación de alta biomasa de cianobacterias tolerantes a la
sombra. Este fenómeno constituye el tercer estado estable para lagos someros (Scheffer et
al 1997). Por ejemplo, Planktothrix agardhii (oscillatorial) se encuentra en floración
permanente en el Lago Rodó desde hace más de una década, éste lago es un sistema
hipereutrófico y extremadamente turbio, en parte debido a la alta biomasa (Scasso et al
2001, Aubriot et al 2011, en prensa). Las pérdidas ecosistémicas y de calidad de agua que
ocasionan las floraciones estables pueden ser muy difíciles de revertir.
Dentro del grupo de cianobacterias con ecoestrategia de sombra, se encuentran las
cianobacterias del Orden Oscillatoriales pero también muchas especies filamentosas del
Orden Nostocales, grupo que tiene la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico. Dicha
característica podría favorecer su desarrollo en sistemas donde el nitrógeno limite el
crecimiento de las Oscillatoriales (Oliver & Granf 2002).
2.3. La problemática de Cylindrospermopsanis raciborskii
Cylindrospermopsis raciborskii (Wołoszyńska) Seenaya & Subba Raju (1972) es una
cianobacteria filamentosa perteneciente al Orden Nostocales, que forma floraciones
potencialmente tóxicas en ecosistemas de agua dulce, principalmente lénticos. Las toxinas
que puede producir esta especie son: microcistina LR, cylindrospermopsina, saxitoxina,
neosaxitoxina y neusaxitoxina. Las primeras dos son hepatotoxinas mientras que las
saxitoxinas son neurotoxinas (Hawkins et al 1985, Lagos et al 1999, Carneiro et al 2009).
Aún no hay registros oficiales de intoxicación de personas y animales en Uruguay pero si en
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otros países (Kuiper-Goodman et al 1999). Por ejemplo, la ingesta de agua con floración de
C. raciborskii en Australia provocó la muerte de ganado bovino y enfermedades hepáticas en
humanos (Hawkins et al 1985, Thomas et al 1998).
C. raciborskii fue reportada por primera vez en Java, Indonesia y por ello fue clasificada
como una especie tropical (Padisák 1997). Recientemente ha despertado el interés científico
mundial por su expansión desde zonas tropicales hacia regiones subtropicales y templadas
de Asia, África, Australia, Europa y Norte América (Padisak 1997, Hamilton et al 2005, van
Vuuren & Kriel 2008, Kaštovský et al 2010). En América del Sur ha sido reportada en
Brasil, Argentina y Uruguay (Zalocar et al 1998, Tucci & Sant’Anna 2003, Bonilla 2009). En
nuestro país fue encontrada en 2005 en alta biomasa en lagos destinados a potabilización y
recreación, siendo el registro más austral de la especie (Vidal & Kruk 2008). En este
escenario de expansión mundial, C. raciborskii ha sido considerada como una especie
invasora. Las especies invasoras son aquellas con la capacidad colonizar, establecerse,
expandirse y persistir en nuevos ambientes (Mack et al 2000). Como consecuencia de las
invasiones biológicas, los ecosistemas naturales sufren grandes desequilibrios ecológicos
que pueden derivar en la pérdida de especies nativas vulnerables y pérdidas económicas,
entre otros (Mack et al 2000).
Las propiedades de C. raciborskii que le permiten colonizar ecosistemas tan diversos no
están claras aún. La producción de toxinas no sería uno de los factores determinantes para
su dominancia, aunque su rol ecológico aún esta en estudio y podría favorecerla en otros
aspectos (Alster et al 2010). A su vez, tiene ventajas competitivas frente a otros organismos
en condiciones de deficiencia de luz o nutrientes. Por ejemplo, posee gran velocidad de
incorporación de fosfato, aún en bajas concentraciones y una gran capacidad de
acumulación de gránulos de polifosfato (Isvánovics et al 2000, Posselt & Burford 2009).
También tiene la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, aunque el máximo crecimiento
se da en presencia de amonio o nitrato (Shafik et al 2003, Burford et al 2006). Esto se debe
a que la formación de células especializadas y la reacción de fijación per se constituyen un
consumo energético importante (Ferber et al 2004). Además, por tener la capacidad de
regular su flotabilidad puede acceder fácilmente al amonio que se libera desde el sedimento.
Sumado a esto, en los lagos uruguayos se ha encontrado que la presencia de esta especie no
estaría relacionada con la deficiencia por nitrógeno (Fabre et al 2010). Por lo tanto, la alta
eficiencia de captación tanto de nitrógeno como de fósforo, favorecerían la dominancia de
C. raciborskii (Padisak 1997, Kenesi et al 2009).
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El éxito de C. raciborskii, en colonizar ambientes tan diversos podría podría estar
involucrada su flexibilidad fenotípica. Algunos de sus caracteres flexibles ya han sido
descritos, por ejemplo morfológicos frente a distintas concentraciones de nitrógeno, según
la fuente de nitrógeno disponible o la deficiencia por fósforo (Hawkins et al 2001, Shafik et
al 2003). En particular para el aislamiento MVCC19 se observaron respuestas flexibles del
crecimiento de acuerdo al patrón de suministro de fosfato (Amaral et al., en prep.).
Con respecto a la luz, se ha planteado que la alta dominancia de esta especie podría estar
relacionada con su ecoestrategia de tolerancia a la sombra (Padisak 1997). Sin embargo, las
conclusiones obtenidas al respecto son contradictorias, ya que ha sido clasificada tanto
como una especie de baja intensidad lumínica (Ik < 30 µmol fotón m -2 s -1 , Briand et al
2004) como lo opuesto (Ik > 80 µmol fotón m -2 s -1 , Mehnert et al 2010). En Uruguay se ha
registrado a C. raciborskii en sistemas con luz variable y su presencia estuvo correlacionada
con una alta relación Zeu/Zm (Fabre et al 2010).
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3. HIPÓTESIS Y PREDICCIONES
3.1. Hipótesis 1
Dado que C. raciborskii se ha expandido desde zonas tropicales a subtropicales y templadas,
los sistemas en los que habita son muy diversos. La colonización de ambientes tan diversos
podría estar relacionada con la flexibilidad fenotípica de la especie. Por otro lado, el
ambiente lumínico es uno de los factores ambientales más variables entre ecosistemas de
diferentes regiones climáticas. Por lo tanto es posible que esta especie cuente con
flexibilidad en caracteres fenotípicos involucrados en la captación y aprovechamiento de la
luz que le permitan colonizar ambientes diversos. Dentro de esos caracteres flexibles frente
a cambios en el amiente lumínico podrían estar involucrados los morfológicos, dado que la
relación S/V esta fuertemente relacionada a la captación de luz. Estos antecedentes
permiten plantear la siguiente hipótesis 1:
C. raciborskii presenta flexibilidad fenotípica y esto le permite aclimatarse y
optimizar su crecimiento en ambientes con distintas intensidades de luz.
Predicción 1.1. MVCC19 responde modificando su relación S/V frente a las distintas
intensidades de luz.
Predicción 1.2. MVCC19 aumenta su tasa de crecimiento luego de transcurrido el tiempo
necesario para aclimatarse a las nuevas condiciones lumínicas.
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3.2. Hipótesis 2
Se ha planteado que el éxito de C. raciborskii en colonizar ecosistemas tan diversos esta
relacionado con su capacidad de crecer a bajas intensidades de luz (Pádisak 1997). Sin
embargo, en trabajos más recientes, se ha planteado lo contrario. Por ejemplo, Wiedner et
al (2007) encontraron una relación directa entre la intensidad de luz en la zona de mezcla y
la abundancia de la especie. En el lago Javier (de donde fue aislada MVCC19) la presencia
de la especie estuvo asociada a una alta relación Zeu/Zm en comparación con lagos
aledaños de similares características (Fabre et al 2010). Además, Menhert et al (2010)
mediante experimentos de laboratorio y mesocosmos encontraron valores de α e I K para C.
raciborskii que coinciden con una ecoestrategia de luz alta. En base a estos antecedentes, se
plantea la hipótesis 2:
C. raciborskii es una especie con ecoestrategia de luz alta, pero que puede tolerar
periodos de sombra.
Predicción 2.1. Los parámetros de crecimiento en función de la intensidad de luz de
MVCC19 son representativos de una ecoestrategia de luz alta.
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4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Evaluar la respuesta la morfología y el crecimiento de un aislamiento de C. raciborskii
(MVCC19) frente a un gradiente de intensidades lumínicas.
4.2. Objetivos específicos
Objetivo específico 1. Determinar la respuesta en la flexibilidad morfológica de MVCC19
frente a diferentes intensidades de luz. (Hipótesis 1, predicción 1.2)
Objetivo específico 2. Evaluar la capacidad de aclimatación de MVCC19 frente a un
gradiente de intensidades lumínicas en condiciones de laboratorio. (Hipótesis 1, predicción
1.1)
Objetivo específico 3. Determinar la ecoestrategia de la especie en base a los parámetros
de crecimiento en función de la intensidad lumínica. (Hipótesis 2, predicción 2.1)
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5. METODOLOGÍA
5.1. Aislamiento y condiciones de cultivo
C. raciborskii fue aislada del lago Javier (34° 51´ S, 56° 02´ W) en el Departamento de
Canelones. Es un lago poco profundo (profundidad máxima: 9,8 m), artificial y eutrófico
(fósforo total: 1,97 µM) que se utiliza para recreación por la población aledaña (Vidal &
Kruk 2008). El cultivo madre del aislamiento (código: MVCC19) es parte del cepario de la
Sección Limnología y corresponde a un solo ecotipo según pruebas moleculares (Piccini et
al en rev.). Este aislamiento se mantiene en medio BG11 modificado (Stanier et al 1971), a
26 ± 2 °C y 80 µmol fotón m -2 s -1 , con fotoperíodo 16:8 L:D y burbujeo continuo de aire
filtrado y pre-humedecido con agua Milli-Q. Los experimentos fueron desarrollados en
estas mismas condiciones.
5.2. Diseño experimental
El experimento consistió en cultivos semicontinuos de 60 ml en frascos Schott de 80 ml
sometidos a diferentes intensidades de luz. El método semicontinuo implicó que cada vez
que la densidad óptica del cultivo se duplicaba se extraía ½ del volumen total (30 ml) y se
lo remplazaba por medio de cultivo, de modo que el cultivo se diluía a la mitad sin
modificar el volumen total (60 ml) (Fig. 2A). Las intensidades de luz probadas (niveles) se
escogieron dentro del rango de crecimiento de la especie según la bibliografía (Briand et al
2004, Mehnert et al 2010, Shafik et al 2001, Bonilla et al en prep.) y fueron: 10, 30, 50, 80,
120, 180 y 350 µmol fotón m -2 s -1 (cuantificadas con un fotoradiómetro Li-Cor 4π). Se
utilizaron tubos de luz incandescente colocados encima y a los lados de los cultivos, sin
alterar la temperatura de los mismos.
Para cada nivel hubo una etapa inicial donde se aclimataron alícuotas del cultivo madre a
cada una de las luces probadas, con una réplica por nivel. Se utilizaron también cultivos
semicontinuos y se mantuvieron en esta etapa hasta que la tasa de crecimiento fue
constante en dos diluciones sucesivas. Cada nivel fue tratado de forma independiente de
modo que cada uno estuvo un período de tiempo diferente en esta etapa. En una segunda
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etapa, cada uno de los cultivos de la etapa anterior se dividió en 4 cultivos semicontinuos (4
réplicas por nivel) con una densidad óptica inicial de 0,11 ± 0,05 ua (Fig. 2B).
A
Crecimiento
Figura 3. A: esquema del método de cultivo semicontinuo, donde se diluye el cultivo a la mitad cuando la
absorbancia inicial (A1 en t1) se duplica (A2 en t2). B: esquema del diseño experimental, en la primera etapa se
aclimató una alícuota del cultivo madre a cada uno de los nivel de luz del tratamiento, cuando la tasa de
crecimiento se estabilizó se pasó a la 2° etapa, donde alícuotas de cada uno de esos cultivos se repartieron en
4 réplicas (ejemplificado solo para el nivel 50 µmol fotón m -2 s -1 ), el tiempo total del experimento incluye
ambas etapas.
5.3. Determinación del crecimiento
El crecimiento se monitoreó diariamente durante ambas etapas, mediante densidad óptica
(absorbancia a 750 nm, Thermo Scientific - Evolution 60) y fluorescencia in vivo de clorofila
a (Aquafluor 0800-010). Estas medidas también se tomaron antes y después de cada
dilución. La densidad óptica se correlacionó positivamente con la clorofila a (r = 0,705;
p

µ = (ln A 2 - ln A 1) / (t 2 - t 1)
Donde A 2 es la absorbancia a 750 nm en el tiempo t 2 y A 1 es la absorbancia a 750 nm en el
tiempo t 1, siendo t 1 < t 2. El valor de A 1 representa no solo el inicio del experimento sino
también la A tomada después de realizar cada dilución (0,11 ± 0,05 ua). A 2 corresponde a
las medidas realizadas cada 24 horas a partir de t 1, por cada medida se calculó una µ.
Para estudiar la respuesta en el crecimiento en el gradiente de luz probado, se seleccionaron
las 5 tasas de crecimiento máximas obtenidas en cada nivel, si bien este valor fue escogido
arbitrariamente, el mismo no solo contempla los máximos obtenidos sino también la
variabilidad de las tasas (Lakeman et al 2009). Excepcionalmente para el nivel a 180 µmol
fotón m -2 s -1 se descartó el valor más alto por considerarse fuera de rango (se alejó más de
dos desvíos estándar del valor promedio). Estos datos se graficaron en función de la
intensidad de luz que perciben los organismos y luego se ajustó la curva de Platt et al (1980)
para fotosíntesis:
µ = µ max [1 - exp (-αI/μmax) ] exp (-βI/μ MAX )
Donde µ es la tasa de crecimiento observada e I la intensidad de luz que reciben los
organismos. A partir del ajuste se determinaron los siguientes parámetros: la tasa de
crecimiento máxima, µ MAX, la pendiente inicial de la curva que corresponde a la fase de
crecimiento limitado por la luz, α, y la pendiente final de la curva correspondiente a la
fase de fotoinhibición, β. A partir de los parámetros de crecimiento obtenidos se calculó la
luz de sub-saturación I K:
I K = µ MAX/α
Para la interpretación de los resultados se utilizó la intensidad de luz promedio que
perciben los organismos, Ip en µmol fotón m -2 s -1 , que fue calculada como:
Ip = (Io + Iz)/2
Donde Io es la intensidad de luz incidente (10 a 350 µmol fotón m -2 s -1 ) y Iz es la intensidad
de luz en el centro de la botella calculada a partir de la ecuación de Kirk (1994) como:
Iz = Io exp (-Kd*z)
- 16 -

Donde z corresponde al diámetro del frasco de cultivo y K d al índice de extinción de la luz
debida a la biomasa. K d fue calculado a partir de la absorbancia a 440 (A 440 ) según Kirk
(1994):
K d = 2,303 A 440 /z
5.4. Determinación de la morfometría
El análisis morfométrico se realizó para todos los niveles excepto en el de 10 µmol fotón
m -2 s -1 , en el que no fue posible determinar la morfología con exactitud debido a que los
organismos se presentaron agrupados en haces. Dicho análisis se hizo al final de los
experimentos: 18, 14, 15 17, 11 y 21 días para los niveles a 10 y 30, 50, 80, 120, 180 y 350
µmol fotón m -2 s -1 respectivamente. Se tomaron muestras de dos de las réplicas de cada
nivel, se fijaron con formol neutralizado al 4% y posteriormente se midieron los filamentos
para determinar su morfología utilizando un microscopio óptico OLYMPUS BX40. Para
los filamentos medidos, los parámetros morfológicos determinados fueron: ancho, largo de
la dimensión máxima (LDM); luego, la superficie y el volumen fueron calculados de
acuerdo a fórmulas geométricas sencillas (Hillebrand et al 1999). Se midieron 20 filamentos
para LDM y entre 5 y 10 filamentos para determinar el ancho. Para el LDM se utilizaron 2
réplicas por cada uno de los niveles. Para estudiar las medidas de ancho se utilizaron 2
réplicas para los niveles a 30 y 50 µmol fotón m -2 s -1 y 3 réplicas para los demás niveles No
fue posible realizar medidas balanceadas, sin embargo, este parámetro es la variable mas
conservada en el fitoplancton de forma filamentosa (Reynolds 1984). A partir del promedio
de las medidas de ancho y cada medida de LDM se calcularon el volumen (µm 3 ), la
superficie (µm 2 ) y la relación superficie/volumen (S/V, µm -1 ) de los organismos, por lo que
se obtuvieron 20 medidas de V, S y S/V por réplica.
5.5. Análisis de datos
Dado que el tiempo de respuesta del organismo (aumento en la tasa de crecimiento) no
siempre coincidió con el tiempo experimental establecido para su aclimatación (tiempo de
1° etapa), por lo que se realizó una estimación del tiempo de aclimatación del cultivo (T A)
para poder comparar la respuesta entre tratamientos. Para evaluar el tiempo de aclimatación
- 17 -

del organismo en cada uno de los niveles (T A) se realizó un diagrama de dispersión de las
tasas de crecimiento respecto al tiempo y luego se estudió la dispersión de las mismas
respecto a su tendencia central. Se realizaron diagramas de dispersión de las unidades de
desvío estándar (UDS) de cada una de las tasas de crecimiento obtenidas respecto a la
media total:
UDS = (µ PROM - µ)/DS PROM
Donde µ PROM es la tasa de crecimiento promedio calculada a partir de todos los valores
obtenidos (se calculó un promedio por cada nivel); µ representa cada una de las tasas de
crecimiento; DS PROM es el desvío estándar calculado a partir de las tasas de crecimiento (se
calculó un promedio por cada nivel). Luego, las UDS se graficaron en función del tiempo
de exposición a la luz de la población, tomando como hora cero el inicio de la primera
etapa. En base a dichos gráficos se estableció T A para cada condición lumínica,
arbitrariamente como el tiempo en el que µ ≥ 0,9 UDS, luego del cual se consideró que el
cultivo estaba ‘aclimatado’. Para evaluar posibles diferencias antes y después de T A se
realizaron ANOVAs de una vía para los niveles: 50, 80, 120 y 350 µmol fotón m -2 s -1 . Para
el nivel a 180 µmol fotón m -2 s -1 se realizó un test U de Mann-Whitney (MW) debido a que
estos datos no cumplían con los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza
necesarios para el ANOVA ni fue posible transformarlos mediante ecuaciones sencillas.
Dado que los distintos niveles tuvieron diferente tasa de crecimiento promedio, se calculó
el número de generaciones transcurridas hasta T A para cada uno, como forma de
estandarizar el tiempo transcurrido para realizar comparaciones entre ellos. El número de
generaciones fue calculado como:
N° Generaciones = µ A * T A
Donde µ A es el promedio de las tasas de crecimiento individuales de las 4 réplicas antes de
T A.
Para visualizar la distribución de los LDM se realizaron histogramas sobre los que se
estimó la distribución de Kernel para compararlos, utilizando el programa PAST 1,81
(Hammer et al 2001). La comparación de las medidas de LDM, ancho y S/V entre niveles
se realizaron con el análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis debido a que no todos los
niveles cumplieron con los supuestos de distribución normal y homogeneidad de varianza,
aún aplicando transformaciones simples. Se realizaron diagramas de dispersión de la
- 18 -

elación S/V en función de otras variables y luego un análisis de correlación de Spearman
entre S/V y la intensidad de luz promedio que perciben los organismos (Ip), dado que los
datos no cumplieron con el supuesto de normalidad.
Para obtener los parámetros de crecimiento en función de la intensidad de luz, se realizó un
ajuste de las tasas de crecimiento máximas a la ecuación de Platt et al (1980) por el método
de mínimos cuadrados, en el programa Table Curve 2D 2,00. Luego se probó el ajuste de la
aproximación mediante la prueba de Fischer.
- 19 -

6. RESULTADOS
6.1. Aclimatación a las distintas intensidades de luz
El tiempo de aclimatación, definido como el tiempo que transcurrió hasta alcanzar tasas de
crecimiento estables, fue de 9 días para la mayoría de los niveles, mientras que para los
niveles a 30 y 120 µmol fotón m -2 s -1 el mismo fue mayor, 15 y 14 días respectivamente
(Tabla I). El número de generaciones transcurrido en dicho tiempo fue variable (entre 6 y
19) y estuvo positivamente correlacionado con la tasa de crecimiento máxima (r = 0,786; p
< 0,05).
Tabla I: Tiempos de respuesta de cada nivel, la tasa de crecimiento global promedio (µ0) con UDS = 0, y el
número de generaciones transcurridas al tiempo de aclimatación (TA) calculadas a partir del promedio de las
tasas de crecimiento antes de dicho tiempo.
Nivel
(µmol fotón m -2 s -1 )
TA
(d)
µ0
(d -1 )
N° de
Generaciones
10 9 0,23 6
30 15 0,33 13
50 9 0,47 8
80 9 0,59 11
120 14 0,58 19
180 9 0,77 17
350 6 0,58 14
La diferencia entre las tasas de crecimiento antes y después del tiempo de aclimatación del
cultivo (T A) fue significativa para todos los niveles excepto para los de 10 y 30 µmol fotón
m -2 s -1 (Tabla II).
- 20 -

Tabla II. Resultados significativos de los análisis de varianza ANOVA entre las tasas de crecimiento antes y
después de TA para los distintos niveles del tratamiento, el valor p se indica entre paréntesis.
Nivel (µmol fotón m -2 s -1 ) Valor F
50 F1, 19 = 100,1 (p

A A
Tasas de crecimiento (μ)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.0
1.5
1.0
0.5
10 μmol fotón m-2 s-1
50 μmol fotón m -2 s -1
0.0
2.0
120 μmol fotón m-2 s-1 1.5
1.0
0.5
0.0
2.0
1.5
1.0
0.5
350 μmol fotón m -2 s -1
0.0
0 100 200 300 400 500
Tiempo de exposición (h)
30 μmol fotón m -2 s -1
80 μmol fotón m -2 s -1
180 μmol fotón m -2 s -1
0 100 200 300 400 500
Tiempo de exposición (h)
- 22 -

B
Unidades de desvio estándar de μ (UDS)
4
3
2
1
0
-1
-2
4
3
2
1
0
-1
-2
4
3
2
1
0
-1
-2
4
3
2
1
0
-1
10 µmol fotón m -2 s -1
50 µmol fotón m -2 s -1
120 µmol fotón m -2 s -1
350 µmol fotón m -2 s -1
-2
0 100 200 300 400 500
Tiempo de exposición (h)
30 µmol fotón m -2 s -1
80 µmol fotón m -2 s -1
180 µmol fotón m -2 s -1
0 100 200 300 400 500
Tiempo de exposición (h)
Figura 3. A: diagramas de dispersión de las tasas de crecimiento en función del tiempo de exposición a la
intensidad de luz de cada nivel del tratamiento. B: Unidades de desvío estándar (UDS) de cada tasa de
crecimiento respecto al promedio global en función de las horas de exposición a la intensidad de luz para
cada nivel. Para el nivel a 350 µmol fotón m -2 s -1 se utilizaron sólo los datos hasta 500 h.
- 23 -

6.2. Respuesta morfológica
El aislamiento MVCC19 respondió a los diferentes niveles de luz con cambios en su
morfología. El LDM varió entre 52,5 y 682,5 µm mientras que el ancho estuvo
comprendido entre 2 y 3 µm.
N° de Observaciones
18 30 µmol fotón m
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 80 160 240 320 400 480 560 640 720
-2 s -1
18
80 µmol fotón m
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 80 160 240 320 400 480 560 640 720
-2 s -1
18 180 µmol fotón m
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 80 160 240 320 400 480 560 640 720
-2 s -1
LDM (µm)
Figura 4. Histogramas del largo de la dimensión máxima (LDM) de los diferentes niveles con estimación de
densidad de Kernel. Se indica el nivel al que corresponde cada gráfica.
18
50 µmol fotón m
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 80 160 240 320 400 480 560 640 720
-2 s -1
18
16
120 µmol fotón m
14
12
10
8
6
4
2
0
0 80 160 240 320 400 480 560 640 720
-2 s -1
18 350 µmol fotón m
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 80 160 240 320 400 480 560 640 720
-2 s -1
Los valores máximos de LDM (Fig. 4) y V (datos no mostrados) se registraron en el nivel a
180 µmol fotón m -2 s -1 , mientras que los mínimos fueron a 30 µmol fotón m -2 s -1 .
- 24 -

En todos los niveles limitados por luz (30, 50, 80 y 120 µmol fotón m -2 s -1 ) el patrón de
distribución del LDM fue similar (Tabla III), el mayor número de observaciones estuvo
comprendido entre 100 y 200 µm de largo (Fig. 4). Los mismos niveles también tuvieron
valores similares en el ancho del filamento, ambos indicadores morfológicos fueron
significativamente diferentes en el nivel a 180 µmol fotón m -2 s -1 con respecto a los demás
(Tabla III, ancho H 5, 152 = 38,9 p < 0,001; LDM H 5, 240 = 68,1 p < 0,001). En este último las
medidas de LDM más frecuentes fueron entre 250 y 350 µm (máximo absoluto = 1313 µm,
no incluido en el gráfico).
Tabla III. Media y desvío estándar del ancho (ancho), el largo de la dimensión máxima (LDM) y la relación
superficie/volumen (S/V) de los filamentos en los diferentes niveles. Las diferentes letras indican diferencias
significativas obtenidas por análisis de Kruskal-Wallis y test de comparación de medias por rangos (a
posteriori) significancia p < 0,05.
Nivel (µmol fotón m -2 s -1 ) Ancho (µm) LDM (µm) S/V (µm -1 )
30 2,5 (± 0,4) abc 136,1 (± 45,3) ac 1,6 (± 0,1) a
50 2,5 (± 0,4) abc 191,9 (± 76,6) bc 1,6 (± 0,1) a
80 2,7 (± 0,4) abcd 170,0 (± 62,4) abc 1,6 (± 0,1) ab
120 2,9 (± 0,3) abcd 175,3 (± 68,4) abc 1,4 (± 0,1) b
180 3,0 (± 0,2) bcd 308,3 (± 135,7) d 1,4 (± 0,0) c
350 2,3 (± 0,4) ab 140,9 (± 44,2) abc 1,7 ± (0,1) a
En el nivel con fotoinhibición (a 350 µmol fotón m -2 s -1 ) la morfología fue semejante a la de
los niveles limitados por luz 30-120 µmol fotón m -2 s -1 tanto en el patrón de distribución de
LDM, como en el ancho del filamento y la relación S/V (Tabla III). Los valores de S/V en
los niveles limitados por luz fueron similares ente si y al nivel con fotoinhibición, mientras
que se diferenciaron significativamente del nivel a 180 µmol fotón m -2 s -1 (Tabla III, KW
H 5, 241 = 146,5; p < 0,001).
Para los niveles entre 30 y 180 µmol fotón m -2 s -1 la distribución de S/V se correlacionó con
la intensidad de luz promedio que perciben los organismos (Ip) (r = 745; p < 0,001) (Fig.
5). La relación S/V del nivel a mayor intensidad de luz no tuvo continuidad con la
tendencia general (a mayor luz mayor S/V), por el contrario, esta relación fue similar a la de
los niveles con menor intensidad lumínica.
- 25 -

30 μmol fotón m -2 s -1
50 μmol fotón m -2 s -1
80 μmol fotón m -2 s -1
120 μmol fotón m -2 s -1
180 μmol fotón m -2 s -1
350 μmol fotón m -2 s -1
S/V (μm -1 )
2.0
Figura 5: Relación superficie/volumen (S/V) en función de la intensidad de luz promedio que perciben los
organismos, para los diferentes niveles con una regresión lineal simple.
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
6.3. Crecimiento en un gradiente lumínico
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Intensidad de Luz Promedio (μmol fotón m -2 s -1 )
La función propuesta para explicar el crecimiento en función de la luz se ajustó a los
resultados obtenidos (r 2 = 0,650; F 2, 34 = 28,734; p < 0,05) (Fig. 6) según la cual la tasa de
crecimiento máxima fue de 1,25 d -1 , el valor de I K fue de 39 µmol fotón m -2 s -1 y la
pendiente inicial (α) fue de 0,026 d -1 µmol fotón m -2 s -1 (Tabla IV). Hubo una fase inicial de
dependencia lineal del crecimiento respecto a la intensidad de luz (correlación de Pearson
F 2, 17 = 0,99; p < 0,001) hasta alcanzar los 50 µmol fotón m -2 s -1 . Dicha fase inicial
corresponde a los niveles a 30 y 50 µmol fotón m -2 s -1 y algunos valores del nivel a 80 µmol
fotón m -2 s -1 . A los 118 µmol fotón m -2 s -1 la pendiente de la curva comienza a ser negativa
hasta alcanzar un mínimo de -0,003 d -1 , correspondiendo a la intensidad de fotoinhibición.
- 26 -

La tasa de crecimiento máxima medida fue de 1,8 d -1 en el nivel a 180 µmol fotón m -2 s -1 ,
con I = 141 µmol fotón m -2 s -1 , valor que quedó por fuera del intervalo de confianza del
95%. La variabilidad en las tasas de crecimiento de cada nivel fue elevada, lo que estuvo
reflejado en la distribución de las UDS en función del tiempo, que variaron ente 0 y 2 UDS
(Fig. 3).
Tasa de Crecimiento (d -1 )
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 50 100 150 200
Intensidad de Luz Promedio (μmol foton m -2 s -1 )
10 μmol fotón m -2 s -1
30 μmol fotón m -2 s -1
50 μmol fotón m -2 s -1
80 μmol fotón m -2 s -1
120 μmol fotón m -2 s -1
180 μmol fotón m -2 s -1
350 μmol fotón m -2 s -1
Fig. 5. Tasas de crecimiento en función de la intensidad de luz promedio que perciben los organismos,
discriminado para cada nivel según los símbolos de colores y el ajuste del modelo de crecimiento (línea gris).
- 27 -

Tabla VI: Parámetros de crecimiento para diferentes cepas de C. raciborskii y otras especies obtenidos en este
trabajo y de la literatura. Se indican: la tasa de crecimiento máxima (μmax), la pendiente inicial de la curva
(α), la luz de subsaturación (IK), la pendiente de fotoinhibición (β) y la intensidad de luz de fotoinhibición (I
inhib.); el método empleado y sus condiciones: semicontinuo (Sc), continuo (C) o cerrado (tipo “Batch”) (B),
aclimatación realizada (si o no), el tipo de medición de luz que utilizan para determinar los parámetros (luz
incidente Io, o luz que perciben las células Ic), la temperatura (T), el fotoperiodo (FP), la conclusión obtenida
sobre su comportamiento ecológico y la fuente de información. Los datos no disponibles se indican como
“nd”.
Especie/Cepa
μmax
(d -1)
α
α
(d-1 μmol
fotón m2 s-1) IK
(μmol
fotón m 2
s -1)
β
(d -1 μmol
fotón m 2
s -1)
I inhib.
(μmol
fotón m 2
s -1)
MVCC19
1,25
0,026
39
MVCC14
0,60
±
0,02
0,079
±
0,028
9
±
3
Cylindrospermopsis raciborskii
ITEP-A3
ACT 9502
1 cepa nd
2 cepas nd
ACT 9502
0,80 0,70 0,35 0,40 0,88
0,030 0,030 0,004 0,005 0,024
26 23 101 83
36
± 3
Planktothrix
agardhii
MVCC 11
0,54
±
0,03
0,082
±
0,024
TCC 83-2
Aphanizomenon
aphanizomenoides
Anabaena bergii
Microcystis
aeruginosa
0,50 0,50 0,40 nd
0,030 0,006 0,004 nd
7 ± 3 17 80
-3E-3 -- -6E-4 -4E-4 nd nd nd -- -- -- -- nd
118
Nulo
a 140
~150 ~130 ~225 ~225 ~200 Nulo
a 140
Nulo a
300
Nulo
a 175
80
a
100
Nulo a
500
Método Sc B B B Sc Sc C B B Sc Sc Sc
Aclimatación
Medición
de I
Si Si No 1 No 1 Si Si Si Si No 2 Si Si Si
Ic Io Io Io Ic Ic Io Io Ic Ic Ic Io
T (°C) 26 26 25 25 20 20 27 26 25 20 20 24
272
a
820
Nulo a
820
FP (L:D) 16:08 16:08 16:08 16:08 12:12 12:12 24:00 16:08 16:08 12:12 12:12 16:08
Ecoestrategia
Fuente
?
Este
trabajo
Luz
baja
Bonilla et
al en prep.
Luz
baja
Luz
alta
Briand
et al 2004
Luz
baja
Luz
alta
Briand
et al 2004
Luz
alta
Mehnert
et al 2010
Luz
alta 3
Mehnert
et al 2010
Luz
baja
Shafik
et al 2001
Luz
baja
Bonilla
et al en
prep.
Luz
baja
Oberhaus
et al 2007
Luz
alta 3
Mehnert
et al 2010
Luz
alta 3
Mehnert
et al 2010
1 Cultivo a 30-50 µmol fotón m 2 s -1 . 2 Aclimatados a 20 µmol fotón m 2 s -1 . 3 Clasificación a partir de los datos de Mehnert et al 2010.
Luz
alta
Deblois &
Juneau
2010
- 28 -

7. DISCUSIÓN
7.1. Aclimatación a las condiciones lumínicas
La tasa de crecimiento máxima medida para MVCC19 en este estudio es la mayor reportada
para la especie (1,8 d -1 a 26 °C). Mientras que la tasa de crecimiento máxima obtenida a
partir de la curva ajustada de crecimiento en función de la intensidad de luz fue levemente
mayor al de la cepa ACT 9502 (Shafik et al 2001, Tabla V). En general otros trabajos sobre
esta especie tienen importantes diferencias con nuestros resultados, por ejemplo Mehnert
et al (2010) obtuvieron tasas de 0,8 d -1 . Ésta diferencia es relevante si se considera que, de
encontrarse C. raciborskii en las condiciones óptimas en el ambiente, una población podría
duplicar su biomasa en la mitad del tiempo esperado según otros estudios.
En todos los niveles las tasas de crecimiento tienden a aumentar luego de transcurrido un
tiempo dado denominado aquí tiempo de aclimatación (T A), que fue del orden de 10 días.
Esta aproximación fue descriptiva y se deberá determinar con pruebas estadísticas para
validar estas observaciones. Esto evidenciaría la importancia de la aclimatación de los
organismos para mejorar su aptitud en su hábitat. La respuesta del organismo depende del
tiempo en dos aspectos: el tiempo de exposición al factor ambiental y el tiempo que
necesita para modificar su fenotipo (tiempo de respuesta) (Walters 2005, Stomp et al 2008).
El tiempo de exposición condiciona el tipo de respuesta que el organismo puede
desarrollar. O'Brien et al (2009) demostraron que la exposición previa de 2,5 h a luces altas
de una comunidad natural dominada por C. raciborskii disminuye la producción primaria
máxima. Mientras que en un plazo de tiempo mayor (semanas), la exposición a luz alta
genera el aumento de la tasa fotosintética máxima y la disminución de α, provocando el
aumento de I K (Foy & Gibson 1982).
Parte del efecto del tiempo de exposición fue observado en los resultados obtenidos (Fig.
3A y 3B), dado que tras los días de exposición, los organismos mejoraron la eficiencia de
utilización de la luz y con ello la tasa de crecimiento (excepto en el nivel a 30 µmol fotón m -
2 s -1 ). Por lo tanto alcanzaron el estado aclimatado a las condiciones lumínicas impuestas
por el experimento. La aparente ausencia de aclimatación a 30 µmol fotón m -2 s -1 podría
deberse a que la intensidad de luz utilizada en dicho nivel del tratamiento fue similar la
intensidad de luz a la que estaban expuestos previamente, en el cultivo madre. Si el
- 29 -

organismo es capaz de percibir una diferencia en las nuevas condiciones lumínicas, puede
responder a ellas y expresar un fenotipo óptimo para la nueva condición. Sin embargo, la
respuesta del organismo comienza antes con cambios fisiológicos a otras escalas
temporales, que no fueron considerados en este estudio (Aubriot et al 2011, en prensa). Por
ejemplo, los cambios en la pigmentación y en la estructura de los complejos moleculares
captadores de energía y las vías metabólicas que integran la fotosíntesis se dan en pocos
días (Bhaya et al 2002, Walters 2005). Sin embargo, Stomp y colaboradores (2008) hallaron,
para la cianobacteria Pseudanabaena, que el tiempo de aclimatación de su composición
pigmentaria a las variaciones en el color de la luz, fue de 14 días. La respuesta pigmentaria
puede ser dependiente de la especie (Schagerl y Müller 2006) y son fundamentales para la
fotoaclimatación. Resultados preliminares de la respuesta pigmentaria de MVCC19 durante
estos experimentos sugieren que la aclimatación a nivel pigmentario (en la relación
ficocianina/clorofila a) ocurre previo a los cambios observados de la tasa de crecimiento
(datos no mostrados).
Para que MVCC19 alcance su estado aclimatado en la naturaleza, sería necesario que la
relación Zeu/Zm se mantuviera estable por al menos 10 días. Esta situación podría darse
en lagos subtropicales durante la estratificación térmica que ocurre en el verano y en los
lagos someros. Esta situación es más probable aún durante veranos poco lluviosos como
los que ocurren durante el fenómeno climático de ‘La Niña’, lo que favorecería el desarrollo
de floraciones de esta especie. La relación entre la estabilidad de la columna de agua y el
crecimiento de C. raciborskii en altas densidades ha sido descrito en otros estudios (Wiedner
et al 2007). Por ejemplo, en un estudio anual de la población de C. raciborskii Alster et al
(2010) encontraron que el mayor crecimiento ocurría durante la estación seca, cuando el
lago estaba estratificado.
Por lo tanto, parte del éxito ecológico de C. raciborskii en lagos subtropicales podría
explicarse por la adecuación de su tiempo de respuesta a la escala temporal de los cambios
en el ambiente lumínico.
7.2. Flexibilidad morfológica
La aclimatación del aislamiento MVCC19 a las condiciones lumínicas involucró cambios en
el LDM y el ancho modificando la forma del filamento, que se resume en la relación S/V.
- 30 -

La forma del organismo está relacionada con su funcionalidad ecológica (Reynolds 2006),
por ejemplo, condiciona fuertemente la captación de energía lumínica (Lewis 1976).
Cuando la luz es un factor limitante, el aumento en la relación S/V le permite al organismo
mejorar la exposición pigmentaria y por lo tanto la captación energética (Lewis 1976). A
medida que aumenta la disponibilidad de luz, disminuye S/V y con ella la exposición
pigmentaria, disminuyendo el riesgo de sobre-exposición y daño celular (Walters 2005). Por
lo tanto, la morfología obtenida en este trabajo en los niveles a luces bajas (30 - 80 µmol
fotónm -2 s -1 ) se explicaría por la deficiencia de luz. Esto concuerda con la relación negativa
que obtuvimos entre el cociente S/V y la luz hasta el nivel a 180 µmol fotónm -2 s -1 . A
medida que los niveles tuvieron mayor disponibilidad de luz disminuyeron su S/V. Sin
embargo, en el nivel con fotoinhibición (350 µmol fotón m -2 s -1 ) la respuesta en la relación
S/V fue contraria a lo esperado, siendo similar a la de los niveles limitados por baja luz. La
relación S/V fue convergente cuando la luz limita (niveles a 30-120 µmol fotón m -2 s -1 ) o
inhibe (nivel a 350 µmol fotón m -2 s -1 ) el crecimiento. El incremento en S/V durante la
fotoinhibición no puede explicarse con los parámetros determinados en este estudio y
requiere de futuras investigaciones sobre las respuestas morfológicas y estructurales al
estrés lumínico, lo que podría estar relacionado con un cambio pigmentario. Datos
preliminares, aún en análisis, evidencian cambios en los pigmentos accesorios y
fotoprotectores (ficocianinas y lípidicos) frente a cambios en la intensidad de luz que
podrían contribuir a explicar este fenómeno (Fabre et al. datos no publicados).
7.3. Ecoestrategia lumínica
El valor I K es representativo de la ecoestrategia lumínica de la población y fue elevado para
MVCC19 (39 µmol fotón m -2 s -1 ) en comparación con especies con estrategia de sombra
(Tabla V). Por ejemplo, Planktothrix agardhii es una especie de sombra que típicamente se
desarrolla en lagos someros turbios y presenta un I K del orden de 10 µmol fotón m -2 s -1
(Oberhaus et al 2007, Bonilla et al en prep.). En el otro extremo, algunas especies con
ecoestrategia de luz alta presentan I K mayor al de MVCC19, por ejemplo, Microcystis
aeruginosa presenta I K de 820 µmol fotón m -2 s -1 , esta cianobacteria forma floraciones
durante el periodo estival por lo que esta expuesta a alta radiación durante muchas horas
(Huisman et al 2005, Bonilla 2009) (Tabla V). Por otro lado, el valor de la pendiente α,
representativo de la capacidad de crecimiento a bajas intensidades de luz, fue un orden de
- 31 -

magnitud mayor al de especies o cepas con similar I K (Tabla V). Por lo tanto, proponemos
que el aislamiento MVCC19 analizado en este trabajo, presenta características intermedias
de las ecoestrategias de luz alta y baja (de sombra) que habitualmente se utilizan.
Por otro lado, el valor α que se obtuvo para MVCC19 implica que además de reproducirse
más rápido (µ = 1,25 d -1 ) a intensidades de luz medias a elevadas (120 - 180 µmol fotón m -2
s -1 ), este aislamiento es capaz de mantener un crecimiento alto a intensidades bajas. Esta
capacidad de mantener un crecimiento elevado en un amplio rango de intensidad de luz
sería una ventaja competitiva frente a especies con similar óptimo de luz pero menor α,
como por ejemplo Aphanizomenon aphanizomenoides (Tabla V: nuestro trabajo y Mehnert et al
2010), ya que tanto a altas como a bajas intensidades de luz el crecimiento de C. raciborskii
es más rápido.
Nuestros resultados se contradicen con trabajos previos que proponen que C. raciborskii es
una especie con ecoestrategia de sombra. Asimismo, nuestro resultados se asemejan a los
trabajos que contemplaron la aclimatación previa de los organismos (Mehnert et al 2010,
Shafik et al 2001). Esto es consistente con lo explicado en el apartado 6.1, dado que el I K
puede ser alterado por los procesos de aclimatación del organismo. La cepa de C. raciborskii
ACT 9502 fue clasificada como especie de sombra con valores de I K similar al de MVCC19
sin embargo, dichos valores no coinciden con los de dicha ecoestrategia (Shafik et al 2001,
Whitton & Potts 2002). Por lo tanto, a pesar de que se ha propuesto que el éxito de C.
raciborskii en dominar la comunidad de fitoplancton está relacionado con su estrategia de
sombra (Padisák 1997, Padisák & Reynolds 1998, Wu et al 2009), estas consideraciones
cambian cuando se tienen en cuenta la flexibilidad fenotípica del organismo. Además, en el
ambiente natural, Wiedner et al (2007) encontraron que la intensidad de luz en la zona de
mezcla fue la limitante principal del desarrollo de las floraciones de esta especie, en dos
lagos eutróficos. En dicho trabajo el crecimiento de la comunidad dominada por C.
raciborskii fue nulo a 60 µmol fotón m -2 s -1 y máximo entre 80 y 130 µmol fotón m -2 s -1 .
Otros estudios han encontrado una correlación positiva entre la biomasa de C. raciborskii y
la disponibilidad de luz en su ambiente natural (Fabbro & Duivenvoorden 1996,
Kokocińskiab et al 2010, Fabre et al 2010).
C. raciborskii podría ser una especie adaptada a intensidades de luz intermedia y tolerante a
intensidades bajas, en contraste con lo reportado generalmente en la literatura. Por lo tanto,
en ecosistemas con alta intensidad de luz se desarrollaría rápidamente y podría continuar
- 32 -

creciendo y mantenerse cuando la luz pase a ser limitante por su propia biomasa
(autosombreamiento). Esta especie sería entonces capaz de generar floraciones
permanentes estables al igual que P. agardhii. (Scheffer & van Ness 2007).
7.4. Metodología y parámetros de crecimiento
C. raciborskii ha sido clasificada en diferentes ecoestrategias en los distintos trabajos y una
de las causas podría ser la metodología utilizada para determinar los parámetros de
crecimiento en función de la intensidad lumínica (α, I K y β). La importancia de la
metodología se evidencia al comparar los trabajos de Briand et al (2004) y Shafik et al
(2001) en los que se observan diferencias en los resultados de la tasa de crecimiento y el I K
para la misma cepa de C. raciborksii (ACT 9502). Es de destacar que la diferencia en la
temperatura podría estar afectando dichos los resultados aunque probablemente no sea un
efecto significativo (Shafik et al 2001). Los valores más altos de crecimiento e I K fueron
obtenidos utilizando aclimatación previa y cultivos continuos. La aclimatación es
fundamental para conocer el máximo crecimiento de los organismos, como se explicó en el
apartado 6.1. La obtención de dicha información requiere de una evaluación adecuada del
efecto de las condiciones de cada experimento debido a la gran flexibilidad fenotípica de
estas cianobacterias. Los cultivos cerrados no serían adecuados para realizar experimentos
de exposición a la luz, debido a que la intensidad del recurso a evaluar disminuye junto con
el aumento de la biomasa de los propios organismos. Según nuestros resultados, un
aumento en la biomasa del 48% causa una disminución del 16% de la luz que percibe el
propio organismo. Con el transcurso del experimento, esta situación genera que el
organismo perciba y se aclimate a intensidades menores a la incidente. Como resultado el
crecimiento es menor y la caracterización fisiológica puede ser alterada por las condiciones
experimentales.
Si además de utilizar cultivos cerrados se considera la luz incidente y no la que percibe el
organismo (como por ejemplo Ip, intensidad de luz promedio que percibe el organismo), el
I K se está sobrestimando así como también el requerimiento y la tolerancia lumínica del
organismo. Wiedner et al (2007) propusieron una nueva estimación del ambiente lumínico
que percibe el fitoplancton en el ecosistema. Estos autores utilizan la intensidad de luz
promedio en la zona de mezcla como estimador, lo que es más representativo de la luz que
perciben los organismos in situ. Este cálculo es semejante al que realizamos aquí para
- 33 -

determinar la intensidad de luz promedio que perciben los organismos dentro de las
botellas de cultivo. Por lo que nuestros resultados son representativos de la respuesta del
organismo y no están condicionados por la aproximación metodológica.
Existen diferencias en el fotoperiodo y la temperatura ente los trabajos que comparamos en
esta discusión. Estos factores metodológicos pueden influenciar de forma significativa la
respuesta fisiológica del organismo. Se ha demostrado que pequeños cambios en la
temperatura alteran la tasa de crecimiento de C. raciborskii, en cepas de diferentes regiones
geográficas (Shafik et al 2001, Briand et al 2004, Mehnert et al 2010). Por otro lado, el
fotoperiodo, altera la disponibilidad del recurso y el ritmo circadiano natural de los
organismos (Zevenboom & Mur 1984, Suzuki & Johnson 2001, Litchman et al 2003).
Por lo discutido anteriormente, la metodología utilizada tiene gran influencia en la
respuesta comportamental de los organismos. A su vez, parte de las diferencias en las
respuesta de los aislamientos es debida a la variabilidad genética inherente a los ecotipos
(Chonudomkul et al 2004, Cohan 2009, Mehnert et al 2010). Estas consideraciones son
importantes a la hora de realizar comparaciones con otros trabajos o extrapolar los
resultados a la naturaleza.
- 34 -

8. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
El aislamiento MVCC19 de C. raciborskii fue capaz de aclimatarse y crecer en un amplio
rango de intensidades de luz, apoyando la hipótesis 1. Una vez aclimatada, la población
presentó características de crecimiento que no coinciden con las esperadas para una especie
con ecoestrategia de sombra como ha sido propuesto por otros autores, sino de luz alta
con tolerancia a intensidades bajas, por lo que aceptamos la predicción de la hipótesis 2. La
aclimatación al ambiente lumínico fue producto de la flexibilidad fisiológica y se reflejó en
cambios en la tasa de crecimiento y la morfología en escalas de tiempo relativamente cortas
(días y semanas respectivamente), por lo tanto aceptamos las predicciones 1.1 y 1.2.
Nuestros resultados sugieren que la capacidad de aclimatarse a los distintos ambientes
lumínicos sería una de las claves del éxito invasivo de C. raciborskii.
Por otro lado, en la naturaleza, los organismos interaccionan entre sí y con los factores
abióticos de su ambiente. Por ejemplo, los organismos con flexibilidad fisiológica
responden frente a cambios en la luz y en el suministro de nutrientes limitantes del
crecimiento (Aubriot et al 2011, en prensa; Amaral et al. en prep.). Además, en presencia de
otros organismos se generan interacciones que pueden provocar cambios fenotípicos
recíprocos en las especies interactuantes (Agrawal 2001), por ejemplo, el fitoplancton con
los depredadores (Hessen & van Donk 1993). Por estas razones, sería necesario realizar
experimentos que incluyan otros organismos para probar la capacidad de aclimatación de
C. raciborskii en la naturaleza y así poder determinar el papel de la flexibilidad fenotípica en
su éxito invasivo.
- 35 -

AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer a mis padres por tanto esfuerzo, cariño y confianza.
También a mamá gracias por la ropa limpia y las deliciosas viandas. Gracias a todos los
amigos que me han acompañado durante la carrera por sus abrazos.
Le agradezco especialmente a mi tutora Sylvia, por confiar en mí, por todas las
oportunidades que me ha brindado y por todo el tiempo dedicado. Gracias también a mi
cotutor Luis por su ayuda, por los dibujitos y por tenerme paciencia en las discusiones.
Gracias a todos los compañeros y amigos de la Sección Limnología por los almuerzos, los
mates y los ojitos de la tarde, por hacer que las horas de trabajo sean tan agradables y
divertidas.
Finalmente, agradezco la financiación de la ANII, dentro de su programa de becas de
iniciación a la investigación. Este trabajo fue financiado por ANNI proyecto FCE2007-353.
- 36 -

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