Metodología y técnicas para el estudio de enfermedades musculares

bellvitgehospital.cat

Metodología y técnicas para el estudio de enfermedades musculares

Metodología y técnicas para el estudio de enfermedades musculares

Dolores Moreno León.

Técnico Superior Anatomía Patológica y Citología

INP (Instituto Neuropatología)

IDIBELL

HUB (Hospital Universitari de Bellvitge).

L´Hospitalet de Llobregat.

CIBERNED


BIOPSIA MUSCULAR Introducción

Anatomía del músculo esquelético

Músculo esquelético

Fascículo

Fibra muscular

(varios mm a varios cm)


BIOPSIA MUSCULAR Introducción

Anatomía del músculo esquelético

Motoneurona

Tipo I Miofibrillas

Motoneurona

Tipo II

Fibra muscular

Tipo I

Fibra muscular

Tipo II

Miofibrillas

Fibras tipo I y tipo II, y contracción muscular

Tipo I rojas +++ lenta,

+++ mitocondrias

+++ actividad oxidativa

+++ mioglobina

+++ gotas lipídicas

Tipo IIb blancas +++ rápida,

+++ glucógeno

+++ miofibrillas

IIa intermedias ++ rápidas

IIIc regenerativas


BIOPSIA MUSCULAR Introducción

Esquema fibra muscular

Miofibrillas

Mitocondrias

Complejo

Sarcoglicanos

Distrofina

Actina asociada

al esqueleto

δ γ α β

α B-cristalina

Miotilina

Teletonina

lípidos

β1 Laminina 2

Glucógeno

Desmina

α 2

α

β

γ 1

sarcómero

Complejo

Distroglicano

Miosina

Titina

Sarcoplasma

Caveolina

Actina

Troponina

Tropomiosina

Nebulina

Banda Z

α-actina

Lamina A/C

B T

B T

T B

Núcleo

Emerina

Sarcolema


BIOPSIA MUSCULAR Introducción

Miofibrillas

Mitocondrias

Complejo

Sarcoglicanos

Distrofina

Actina asociada

al esqueleto

δ γ α β

α B-cristalina

Miotilina

Teletonina

lípidos

β1 Laminina 2

Glucógeno

Desmina

α 2

α

β

γ 1

sarcómero

Complejo

Distroglicano

Miosina

Titina

Sarcoplasma

Caveolina

Actina

Troponina

Tropomiosina

Nebulina

Proteínas membrana:

Patrón distrófico

Banda Z

α-actina

Lamina A/C

B T

B T

T B

Núcleo

Emerina

Sarcolema


BIOPSIA MUSCULAR Introducción

Miofibrillas

Mitocondrias

MFM= miopatia miofibrilar

Complejo

Sarcoglicanos

Distrofina

Actina asociada

al esqueleto

δ γ α β

α B-cristalina

Miotilina

Teletonina

lípidos

β1 Laminina 2

Glucógeno

Desmina

α 2

α

β

γ 1

sarcómero

Proteínas

de sostén:

patrón MFM

Complejo

Distroglicano

Miosina

Titina

Sarcoplasma

Caveolina

Actina

Troponina

Tropomiosina

Nebulina

Banda Z

α-actina

Lamina A/C

B T

B T

T B

Núcleo

Emerina

Sarcolema


BIOPSIA MUSCULAR Introducción

Miofibrillas

Mitocondrias

Fallo en el

metabolismo

de la fibra:

enfermedades

metabólicas

Complejo

Sarcoglicanos

Distrofina

Actina asociada

al esqueleto

δ γ α β

α B-cristalina

Miotilina

Teletonina

lípidos

β1 Laminina 2

Glucógeno

Desmina

α 2

α

β

γ 1

sarcómero

Complejo

Distroglicano

Miosina

Titina

Sarcoplasma

Caveolina

Actina

Troponina

Tropomiosina

Nebulina

Banda Z

α-actina

Lamina A/C

B T

B T

T B

Núcleo

Emerina

Sarcolema


BIOPSIA MUSCULAR Introducción

Miofibrillas

Mitocondrias

Complejo

Sarcoglicanos

Distrofina

Actina asociada

al esqueleto

δ γ α β

α B-cristalina

Miotilina

Teletonina

lípidos

β1 Laminina 2

Glucógeno

Desmina

α 2

α

β

γ 1

sarcómero

Complejo

Distroglicano

Miosina

Titina

Sarcoplasma

Caveolina

Actina

Troponina

Tropomiosina

Nebulina

Infiltrados

Inflamatorios:

miositis

Banda Z

α-actina

Lamina A/C

B T

B T

T B

Núcleo

Emerina

Sarcolema


BIOPSIA MUSCULAR Introducción

Las enfermedades neuromusculares

- La mayoría son de carácter genético y generalmente hereditarias

- Son enfermedades crónicas y progresivas

- Afectan a la musculatura y al sistema nervioso periférico

- Su aparición puede producirse en el nacimiento o en otras etapas de la

vida

- Las características más importantes son la pérdida progresiva de fuerza

muscular, y la degeneración de los músculos y de los nervios periféricos


BIOPSIA MUSCULAR Introducción

Enfermedades neuromusculares

Motoneurona Periférica

(Asta anterior de la

médula espinal)

Hereditarias:

.-Amiotrófias espinales

Adquiridas:

.-Virales: poliomielitis

.-Degenerativas: Esclerosis

lateral amiotrófica(ELA)

Nervio periférico (fibra nerviosa) Unión

Neuromuscular

Neuropatías sensitivo-motora

Hereditarias:

.-Enfermedad Charcot-Marie-Tooth

.-Leucodistrófias

Adquiridas:

.-Inflamatorias: S. Guillain Barré, polineuropatía

desmielinizante crónica inflamatoria (PCDI)

.-Infecciosas

.-Tóxicas

.-Metabólicas (e.j. diabetes)

Enfermedades

de la unión

neuromuscular

Hereditarias:

Síndromes

miasténicos

Congénitos

Adquiridas:

Miastenia gravis

Fibra Muscular

DISTROFIAS MUSCULARES CONGÉNITAS

DISTROFIAS MUSCULARES

GLUCOGENOSIS

MITOCONDRIALES METABÓLICAS

MIOPATÍAS LIPÍDICAS

MIOSITIS

MFM (Miopatia Miofibrilar)

MIOPATÍAS CONGÉNITAS

MIOPATÍAS DISTALES

MIOTONÍAS CONGÉNITAS

PARÁLISIS PERIÓDICA

DISTROFIAS MIOTÓNICAS


BIOPSIA MUSCULAR Introducción

Distrofias musculares I

Distrofia muscular de Duchenne

recesiva ligada a X, Xp21,2(distrofina)

Distrofia muscular de Becker

recesiva ligada a X, Xp21,2(distrofina)

Distrofinopatías menores

recesivas ligadas a X, Xp21,2(distrofina)

Distrofia muscular con déficit de adhalina o

de alfasarcoglicano (LGMD 2D)

autosómica recesiva, 17q12-q21 (adhalina o

alfasarcoglicano)

Distrofia muscular con déficit en

betasarcoglicano (LGMD 2E)

autosómica recesiva, 4q12 (betasarcoglicano)

Distrofia muscular con déficit en

gammasarcoglicano (LGMD 2C)

autosómica recesiva, 13q12 (gammasarcoglicano)

Distrofia muscular con déficit en

deltasarcoglicano (LGMD 2F)

autosómica recesiva, 5q33 (deltasarcoglicano)

Distrofia muscular de cinturas tipo “Erb”

(LGMD 2A)

autosómica recesiva, 15q15 (calpaina 3)

Distrofias musculares de cinturas

(LGMD 1A)

autosómica dominante, 5q22-q34

(LGMD 2B)

autosómica recesiva, 2p13-p16

Distrofia muscular facioescapulo-humeral

(Miopatía de Landouzy-Déjérine)

autosómica dominante, 4q35

Distrofias musculares II

Distrofia muscular de Emery-Dreifuss

recesiva ligada a X, Xq28 (emerina)

Miopatía de Bethlem

autosómica dominante, 21q22,3 (sub-unidades a1 y

a2 del colágeno VI) – 2q37

Distrofia muscular congénita con déficit de

merosina

autosómica recesiva, 6q22 – 23 (merosina)

Distrofia muscular congénita de tipo

Fukuyama

autosómica recesiva, 9q31 – q32 (déficit parcial de

43 DAG y de merosina)

Síndrome de Walker-Warburg

autosómica recesiva

Síndrome MEB (Músculo-Ojo-Cerebro o

enfermedad de Santavuori)

autosómic recesivo

Distrofia muscular oculofaríngea

autosómica dominante, 14q11.2q13

Enfermedades musculares

inflamatorias

Polimiositis

adquiridas

Dermatomiositis

adquiridas

Miositis por cuerpos de inclusión (IBM o

inclusion body myositis)

esporádica

Miopatías metabólicas

Miopatías mitocondriales

transmisión materna, autosómica dominante,

autosómica recesiva ligada a X, esporádica

Lipidosis musculares:

Miopatías con déficit de carnitina

autosómica recesiva

Miopatías con déficit de carnitina

palmitiltransferasa de tipo II (CTP II)

autosómica recesiva, 1p32

(carnitina palmitiltransferasa)

Lipidosis con déficit en acil CoA

deshidrogenasa

autosómica recesiva, 12q22-qter (acil CoA

deshidrogenasa)

Glucogenosis musculares:

Enfermedad de McArdle

autosómica recesiva, 11q13 (fosforilasa muscular)

Enfermedad de Tauri

autosómica recesiva, 12q13.3 (fosfofructoquinasa)

Enfermedad de Pompe

autosómica recesiva, 17q225 (maltasa ácida)

Miopatias Miofibrilares (MFM)

Desmina

autosómica dominante 2q35

Miotilina

autosómica, dominante 5q31

FLNC,

autosómica dominante, 7q32.0

Zasp

autosómica dominante 10q22.3-23.2

Alfa-B-cristalina

autosómica dominante, 11q21-23


BIOPSIA MUSCULAR

Recepción de la biopsia muscular

M.E.

Estudio

ultraestructural

Historia clínica. Pruebas complementarias

Biopsia muscular

Congelación/OCT Reserva s/m

Cortes criostato

Estudio

EHQ/HQ/IHQ

Extracción de

proteínas

western blotting

DIAGNÓSTICO Consejo Genético

Extracción ADN

PCR

Recepción

Banco

Tejidos

Banco

ADN


BIOPSIA MUSCULAR

Recepción de la biopsia muscular

- Comprobación de datos del paciente y número de registro

- Separación de diferentes fragmentos para sus diferentes estudios:

-OCT

- Reserva sin montar para western blotting y/o ADN

- PFA 4% (paraformaldehído)

- m.e. (microscopía electrónica)

- Congelación de la biopsia muscular al corte transversal en isopentano

enfriado en nitrógeno líquido y posterior montaje en OCT

- Conservar la muestra a -80ºC

- Cortes de criostato entre 6 y 8 μm. Montaje en portas pretratados

Recepción


BIOPSIA MUSCULAR Recepción

Recepción de la biopsia muscular

Comprobarción de los datos y número

de laboratorio

Fibras sin orientar

Orientar las fibras en la misma

dirección

Seleccionar los diferentes

fragmentos

Mantener el número asignado durante

todo el proceso de congelación


BIOPSIA MUSCULAR Congelación

Congelación de la biopsia muscular

Diferentes pasos de la congelación de la muestra

Congelación durante 10’’

en metilbutano frio

Inclusión en OCT con la

orientación transversal al corte

N 2

Metilbutano

Bloque

de OCT

Reserva

sin montar


BIOPSIA MUSCULAR

Técnicas histológicas y EHQ de rutina en la biopsia muscular:

-H-E (hematoxilina-eosina)

-T. Gomori (Tricrómico de Gomori)

-PAS, PAS+D (ácido periodico de Schiff, más diastasa)

-NADH (nicotin-adenina deshidrogenasa)

-ATPasas (ATPasas miosínicas)

-COX (citocromo oxidasa)

-SDH (succinato deshidrogenasa)

-Fosforilasa

-Fosfofructocinasa

-oil red/sudán negro

Tinciones


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

Hematoxilina-eosina

(Tinción topográfica de rutina)

Hematoxilina de Harris: Colorante natural (haematoxylon campechianum):

- oxidación

- mordiente (alumbre)

Vacuolas festoneadas

- progresiva/regresiva

- diferenciación/viraje

Eosina: Colorante artificial derivado del xanteno

-regresiva

-diferenciación

Valoración:

Forma y tamaño de las fibras,

necrosis, atrofias, hipertrofias,

inclusiones citoplasmáticas,

infiltrados inflamatorios.

Diferentes tamaños de fibras

Músculo normal


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

Tricrómico de Gomori (TG)

Músculo normal

(Técnica estructural)

Tinción nuclear con Hx de Harris/Weigert

Mezcla de colorantes citoplasmáticos:

- Cromotopo 2R

- Fast green

- ácido fosfostúngstico

Inclusiones citoplasmáticas

Bastones Nemalínicos

Bastones Nemalínicos

Ragged-red

Vacuolas rimmed

Valoración:

Las mitocondrias, las fibras “ragged-red” (rojo-rasgadas), las vacuolas “rimmed”

(festoneadas), los cuerpos nemalínicos, la mielina y los nervios se tiñen de rojo. Resto del

citoplasma de color verde oscuro; los núcleos de color lila/negro.


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

Oil red O/ sudán negro (Tinción de lípidos)

- Colorante Oil Red O o Sudan negro a

saturación en solución alcohólica.

- Capacidad de tinción por “comodidad”

del colorante.

- Contraste nuclear con H. de Harris

Valoración:

Las vacuolas lipídicas y los lípidos neutros se tiñen de

rojo o de negro dependiendo del colorante (Oil Red O o

sudán negro)

Oil Red Con contraste nuclear

Sudan Black


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

PAS y PAS + diastasa (Técnica histoquímica)

Oxidación de los grupos hidroxilo del glucógeno con ácido periódico

O

OH

O

CH 2

OH

OH

Valoración:

Núcleos lilas y depósitos de glucógeno

fucsia.

PAS+diastasa: diferencia glucógeno vs

mucinas: el glucogeno se va

OH

CH2 OH CH2 OH

O O O O

O

CH 2

H H OH H

H

OH

OH

H

O

C

H O

O

C H

O

C

HO

CH 2

OH

HO

O

C

C H


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

Técnicas EHQ (ATPasas miosínicas, NADH, COX, SDH, fosforilasa, fosfofructocinasa)

Técnicas que ponen de manifiesto si existe la actividad del enzima en estudio

S

E= Enzima

S= sustrato

P= Producto

MO= Microscópio óptico

EHQ= enzimohistoquímica

E

Solución tamponada

pH

Sustrato

Capturdor de color

P

Capturador

de color

Producto

Visible al

MO


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

Técnicas EHQ: ATPasa miosínica

- Sustrato: Adenosina-trifosfato

- Acetato sódico/ácido acético; veronal/cloruro cálcico

- Incubación a 3 pH diferentes

- El capturador de color es cloruro de cobalto y sulfuro de amonio

ATP=ADP+P

P+ClCo=Co3(PO4)2

Co3(PO4)2+(NH4)2S =CoS

Tipo I rojas, lentas, +++ mitocondrias+++actividad oxidativa

Tipo II blancas, rápidas, +++ glucógeno

Valoración:

pH 4.35 fibras tipo I, IIc

pH 4.63 fibras tipo I, IIb, IIc

pH 9.4 fibras tipo II

pH4.35

pH 4.63

pH 9.4


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

Técnicas EHQ: NADH (NAD Diaforasa)

- Sustrato: Nicotinamida-adenina-dinucleótido

- Capturador de color: NBT (cromógeno)

- Solución tampón: Tris

-pH7.4

NADH=NAD+H H + NBT = NBT -

Targets: fibras en diana Lesión tipo core

Central core

Membrana

interna

Citoplasma

Membrana Externa

NADH +

Espacio intermembrana

Normal

C-I C-II C-III C-IV

Succinato

NAD Fumarato

Refuerzo

subsarcolémico

Fosforilación Oxidativa

Transporte de Electrones

Normal

Cit C

½O 2

H 2O 2

Valoración:

Actividad mitocondrial lila.

Complejo I de la respiración

mitocondrial. Diferenciación

de tipos de fibras.


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

Técnicas EHQ: COX (citocromo oxidasa)

- Sustrato: Citocromo C + catalasa

- Capturador de color: DAB (cromógeno reducido)

- Solución tampón: tampón fosfato

-pH7.4

Valoración:

Actividad mitocondrial marrón pardo.

complejo IV de la respiración mitocondrial

diferenciación de tipos de fibras

Membrana

interna

Actividad COX -

Citoplasma

Membrana Externa

NADH +

Espacio intermembrana

Normal COX

C-I C-II C-III C-IV

Succinato

NAD Fumarato

Fosforilación Oxidativa

Transporte de Electrones

COX

Cit C

½O 2

H 2O 2


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

Técnicas EHQ: SDH (succinato deshidrogenasa)

- Sustrato: Succinato sódico

- Capturador de color: NBT (nitroblue tetrazolium)

- Solución tampón: tampón fosfato

-pH7.4

SucNa = sucNa+H

H + NBT = NBT -

Valoración:

Actividad mitocondrial lila

Complejo II de la

Respiración mitocondrial

Diferenciación de tipos

de fibras

Refuerzo SDH

Fibras “ragged-blue”

Normal

Membrana

interna

Citoplasma

Membrana Externa

NADH +

Espacio intermembrana

Normal

C-I C-II C-III C-IV

Succinato

NAD

Fumarato

Normal

Fosforilación Oxidativa

Transporte de Electrones

Normal

Cit C

½O 2

H 2O 2


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

Técnicas EHQ: fosforilasa

- Sustrato: AMP, glucógeno, glucosa 1-fosfato

- Capturador de color: Lugol

- Solución tampón: tampón acetato sódico/

ácido acético

-pH 5.6

La fosforilasa, activada por el AMP, actúa

sobre la glucosa 1-fosfato en presencia de

glucógeno formando un polisacárido.

El polisacárido formado reacciona con el lugol

Valoración:

Actividad fosforilasa lila

Diferenciación de tipos de fibras

NADPH

Ribulosa-5-fosfato

Ribosa-5-fosfato

NADPH

Ruta de

las pentosas

Glucógeno

ATP

AMP

Glucogenolisis

Glucosa-6-fosfato

Fructosa-6-fosfato

ATP

Fructosa-1,6-bifosfato

2-NADH

2-ATP

2-ATP

Ac. Pivúrico

Glucolisis


BIOPSIA MUSCULAR Tinciones

Técnicas EHQ: fosfofructocinasa

- Sustrato:Arsenato sódico

ATP

B-nicotinamida adenina dinucleótico (B-NAD)

- Capturador de color: NBT

- 2 Soluciones incubación: fructosa 1,6 difosfato pH 8.6

fructosa 6 fosfato

sulfato de magnesio pH 7

Valoración:

Actividad fosfofructocinasa lila

Diferenciación tipos de fibras

Fosk 6

NADPH

Ribulosa-5-fosfato

NADPH

Ribosa-5-fosfato

Ruta de

las pentosas

Fosk 1-6

Glucógeno

ATP

AMP

Glucogenolisis

Glucosa-6-fosfato

Fructosa-6-fosfato

ATP

Fructosa-1,6-bifosfato

2-NADH

2-ATP

2-ATP

Ac. Pivúrico

Glucolisis


BIOPSIA MUSCULAR

Resultados

Técnicas histológicas y EHQ de rutina en la biopsia muscular: utilidad en las

diferentes patologías

MFM= miopatia miofibrilar

-H-E (Hematoxilina-eosina)

-T. Gomori (Tricrómico de Gomori)

-PAS, PAS + D

-NADH

-ATPasas

-COX (citocromo oxidasa)

-SDH (succinato deshidrogenasa)

-fosforilasa

-fosfofructoquinasa

-oil red/sudán negro

7

Patrón distrófico

6

1

2

Patrón MFM

4

Denervación

Glucogenosis

3

Mitocondrial

Miopatías lipídicas

5

Patrón inflamatorio:

Miopatías inflamatorias


BIOPSIA MUSCULAR

1. Denervación

H-E Gomori

NADH: targets (fibras en diana) ATPasa 4.35: agrupación por tipos

Resultados

ATPasa 4.35 músculo normal


BIOPSIA MUSCULAR Resultados

2. Glucogenosis IV: McArdle

H-E

Vacuolas subsarcolémicas

PAS NADH

Depósito de glucógeno

subsarcolémico

Fosforilasa

Negativa

Vacuolas subsarcolémicas

Control

Fosforilasa

m.e.: Depósito de glucógeno subsarcolémico

NADPH

Ribulosa-5-fosfato

NADPH

Ribosa-5-fosfato

Ruta de

las pentosas

Glucógeno

ATP

Glucosa-6-fosfato

Fructosa-6-fosfato

ATP

Fructosa-1,6-bifosfato

2-NADH

2-ATP

2-ATP

Ac. Pivúrico

AMP

Glucogenolisis

Glucolisis


BIOPSIA MUSCULAR Resultados

3. Miopatía mitocondrial

H-E TG/ Ragged Red

m.e.: megamitocondrias con inclusiones

Refuerzo SDH Actividad COX-

Refuerzo

NADH

Membrana

interna

Citoplasma

Membrana Externa

NADH +

Espacio intermembrana

Normal

C-I C-II C-III C-IV

Succinato

NAD Fumarato

Fosforilación Oxidativa

Transporte de Electrones

Cit C

½O 2

H 2O 2


BIOPSIA MUSCULAR

4. Miopatías lipídicas

H&E NADH

Sudan

black

Oil Red O

m.e.

Resultados


BIOPSIA MUSCULAR

Técnicas histológicas y EHQ de rutina en la biopsia muscular

MFM= miopatia miofibrilar

DM= Dermatomiositis

IBM= Inclusión Body Miositis

-H-E (Hematoxilina-eosina)

-T. Gomori (Tricrómico de Gomori)

-PAS, PAS + D

-NADH

-ATPasas (Atpasa miosínicas)

-COX (citocromo oxidasa)

-SDH (succinato deshidrogenasa)

-fosforilasa

-fosfofructoquinasa

-oil red/sudan Black

7

Patrón Distrófico

6

Patrón MFM

5

Técnicas de IEHQ

Patrón inflamatorio

Miopatías inflamatorias

Resultados


BIOPSIA MUSCULAR

Técnicas IEHQ en la biopsia muscular:

Técnica Strep-ABC

- Fijación con acetona-metanol

- Bloqueo de la peroxidasa endógena

-Bloqueos de las uniones inespecíficas con

suero normal

- Incubación en primario especifico

- Incubación en secundario biotinilado

- Incubación Strep-ABC

- Revelado con diaminobencidina: DAB

IEHQ= inmunoenzimohistoquímica

H 2 O 2 +DAB - = DAB + =COLOR

Anti-human made in mouse

anti-mouse made in goat

biotilinado

IEHQ


BIOPSIA MUSCULAR IF

Técnicas inmunofluorescencia

- Fijación con acetona-metanol

- Bloqueos de las uniones inespecíficas

con suero bovino fetal 10%

- Incubación en anticuerpo primario especifico

- Incubación en secundario marcado con fluorocromo

IF= inmunofluorescencia

desmina miotilina

anti-humano hecho en ratón

anti-ratón hecho en cabra

conjugado con fluorocromo


BIOPSIA MUSCULAR IF Confocal

Técnicas IF confocal

-Fijación con acetonametanol

- Bloqueos de las uniones

inespecíficas con SBF10%

- Incubación con 2 primarios específicos

- Incubación con 2 secundarios marcado con fluorocromos

de diferentes longitudes de ondas de emisión

- Análisis con microscopio confocal

Anti-human made in rabbit

anti-rabbit made in goat

conjugado con

fluorocromo Y

desmina miotilina merge

anti-mouse made in

goat conjugado con

fluorocromo X

Anti-human made in mouse


BIOPSIA MUSCULAR IEHQ Resultado

7

MFM= miopatia miofibrilar

DM= Dermatomiositis

IBM= Inclusión Body Miositis

Marcadores

Distrofias:

Dys 1, Dys 2, Dys 3

utrofina: DRP1, DRP2

α-sarcoglicano

β-sarcoglicano

δ-sarcoglicano

γ-sarcoglicano

β-distroglicano

emerina

merosina (laminina alfa-2)

laminina β1

disferlina

caveolina

Patrón distrófico

6

Western-Blot

Marcadores MFM:

miotilina

desmina

ubiquitina

αB-cristalina

filamina C

Dys1

gelsolina

Patrón MFM

5

Diagnóstico

Marcadores linfocitarios:

CD4, CD8, MHC clase I

Patrón inflamatorio:

miopatías inflamatorias


BIOPSIA MUSCULAR

5. Miopatías Inflamatorias: dermatomiositis, polimiositis

Dermatomiositis

Polimiositis MHC clase I Control -

DM= Dermatomiositis

IBM_ Inclusión Body Miositis

Dermatomiositis

IEHQ Resultado

Polimiositis

Polimiositis: atrofia perifascicular


BIOPSIA MUSCULAR

6. Miopatía miofibrilar (MFM)

m.e. desminopatía

H-E Gomori

IEHQ Resultado

desmina

αB-cristalina miotilina ubiquitina

C-filamina miotilina

BF-10


BIOPSIA MUSCULAR IEHQ Resultado

7. Patrón distrófico

H-E

Gomori

ATPasa 4.35

COX

NADH

PAS


BIOPSIA MUSCULAR

7. Patrón distrófico

DMB= Distrofia Muscular de Becker

Dys1

Dys2

Dys3

DMB

Dys1

Dys2

Dys3

Control

IEHQ Resultado

Distrofinas


BIOPSIA MUSCULAR IEHQ Resultado

7. Patrón distrófico

DMB Control DMB

Control

α α

β β

DMB= Distrofia Muscular de Becker

δ

γ

Sarcoglicanos

δ

γ


BIOPSIA MUSCULAR IEHQ Resultado

Marcadores

Distrofias:

Dys 1, Dys 2, Dys 3

utrofina: DRP1, DRP2

α-sarcoglicano

β-sarcoglicano

δ-sarcoglicano

Γ-sarcoglicano

β-distroglicano

emerina

merosina (laminina alfa-2)

laminina beta 1

disferlina

caveolina

7

Patrón distrófico

6

western-blotting

Marcadores MFM:

Miotilina

Desmina

ubiquitina

Alfa-Bcristalina

Filamina C

Dys1

Gelsolina

Patrón MFM

5

Diagnóstico

Marcadores linfocitarios:

CD4, CD8, MHC clase I

Patrón inflamatorio

Miopatías inflamatorias:

DM, IBM, Polimiositis


BIOPSIA MUSCULAR Western-Blot

Técnica de western blotting

1.-Extracción de proteínas

(desnaturalización-estructura primaria)

2.-SDS-PAGE ±% acrilamida

+ Marcador con p.m. conocidos + electroforesis

3.-Blotting + IEHQ

4.- Revelado en un film

1 2 3

+

PM= pesos moleculares

SDS-PAGE=sodium dodecil sulfate polyacrilamide gel

-

4

quimioluminiscencia


BIOPSIA MUSCULAR Western-Blot

Técnica de WB en la biopsia muscular

Mini-protean III. Electroforesis SDS-PAGE

Geles teñidos con coomassie


BIOPSIA MUSCULAR

Técnica de western blotting

Semy-dry

Western-Blot

Ponceau, tinción inespecífica de proteínas en

las membranas después de la transferencia


BIOPSIA MUSCULAR

Técnica de western blotting en la biopsia muscular

Cámaras de incubación para los anticuerpos

Western-Blot

Revelado en cámara oscura con luz de seguridad


BIOPSIA MUSCULAR

Técnica de western blotting

Western-Blot

Diferentes exposiciones en dos films


BIOPSIA MUSCULAR Western-Blot: resultado

Técnica de western blotting: Distrofia de Becker

Fig.1

Fig.2

400 kDa

Coomassie

Dys1 Dys2 Dys3 α β δ γ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Fig. 1 Extractos de proteínas de un músculo sano control (carril 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13) y el probando (carril 2, 4, 6,

8, 10, 12, 14) donde se observa una disminución en la inmunotinción de todas las proteínas y un ligero cambio

de peso molecular en la Dys 1( patrón típico de la distrofia de Becker)

Fig. 2 Control de carga teñido con coomassie

8

6

4

2

0

Control

Probando

Dys 1 Dys2 Dys3 Alfa Beta Delta Gamma

50 kDa

35 kDa

200 kDa


BIOPSIA MUSCULAR Western-Blot: resultado

Técnica de western blotting

Miosina

Coomassie

teletonina

1 2 3

control probando control

19 kDa

Miosina

Coomassie

disferlina

1 2 3

control probando control

210 kDa

Carril 1 y 3: control de músculo sano. Carril 2: probando.

Se aprecia la ausencia de teletonina en una distrofia muscular autosómica recesiva tipo 2G

causada por mutación en el gen de la teletonina, y de disferlina en una disferlinopatía

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