Identificación Bacteriana - BioPlac Medios

Evaluación de Métodos Prácticos
para la identificación bacteriana
Dra. Beatrice Hervé E.
Mayo 2007

Necesidad de técnicas rápidas
microbiología toma tiempo
pronóstico de los pacientes depende de
una identificación oportuna, que permita
orientar terapia
interpretación de sensibilidad depende
de la identificación
tema de costos involucrado

• Desde el siglo XIX se intenta encontrar pruebas
bioquímicas que permitan diferenciar una especie
bacteriana de otra
• paralelamente se intentaba desarrollar sistemas que
redujeran el tiempo de espera para lograr una
identificación correcta
• primeros ejemplos de pruebas rápidas
– spot indol 1963
– Patho’Tec tiras de papel impregnado con reactivos
que permiten probar la actividad de algunas enzimas
específicas (ureasa, ornitina decarboxilasa, hidrólisis
de esculina) 1964
– abrieron la puerta a los sistemas comerciales de
identificación, ya sea manuales o automatizados, que
se conocen en la actualidad.

Automatización en Microbiología
• Consecuencia de la carrera espacial:
– 1973: automicrobic system: objetivo era detectar,
enumerar e identificar microorganismos en espacio y
tiempo reducidos.
• Tarjeta plástica miniaturizada desechable
• Detección basado en óptica en estado sólido
• Minicomputador asociado (Vitek 1ª generación)
• Demuestra que:
• incubación por 13 hrs,
• inóculo de 10(4) ufc/ml,
• >92% identificación correcta.
• Desde entonces, mejoría constante de paneles
y sistemas

Fundamentos de la tecnología actual
• Reacciones basadas en cambio de pH ,requieren 15 a
24 hrs de incubación.
• reacciones enzimáticas, requieren 2 a 4 hrs de
incubación,
• utilización de fuentes de carbono, 4 a 6 hrs.
• detección visual de desarrollo bacteriano, turbidez
requiere al menos incubación overnight
• a menor tiempo, requieren mayor inóculo
• las tres primeras se visualizan por cambio de color.

Al elegir un sistema
• Conocer sus fortalezas y debilidades
• No pedirle más de lo que puede dar
• conocer nº de taxa y especies incluídas en la base de
datos
• Tiempos (incubación, mantención, inoculación)
• MF necesario
• Reactivos adicionales
• Nivel de aceptabilidad y pruebas adicionales requeridas
• Cómo se comporta en pruebas de eficacia y desafío
• % de identificaciones incorrectas
• Costo
• Conectividad a LIS

• Actualización de bases de datos, dado
cambios taxonómicos constantes.
• No siempre una actualización mejora la
precisión de un sistema.
– API 20E 1977: 87 taxa: 91.1% id.corr/24hrs
– API 20E 1992:110taxa: 78.7% id.corr/24hrs
– Nueva versión 2002 con 102 taxa

• Microbiología interpretativa:
– No basta con el resultado del kit.
• Tomar en cuenta además:
– Morfología de la colonia
– Información clínica
– Resultados de susceptibilidad

Objetivo del laboratorio de
microbiología
• Proveer resultados :
–Precisos
– Confiables
– Clínicamente relevantes
– Costo efectivos

Ventajas de la automatización
• Menor tiempo: mayor sensibilidad analítica.
Detecta cambios antes que el ojo
• Reproducibilidad de los resultados
• Traceabilidad
• Menor cantidad (vol) de desechos contaminados
• Menor carga de trabajo
• Conexión al LIS reduce errores post analíticos
• Conexión con sistemas de experto

Estudios: definiciones
• Pruebas de eficacia (weighed laboratory profile):
especies comunes y en proporción a su
frecuencia en clínica
• Pruebas de desafío (stress /challenge):
especies de baja frecuencia, generalmente de
stock
• Pruebas de reproducibilidad entre laboratorios
• Exigible >90%de identificaciones correctas en
eficacia, 85% en stress
• ID correcta: > 90% de probabilidad

Estudios (2): indicadores
• Si se quiere tener un sistema que
entregue resultados a las 2-6 hrs, el
centro debería evaluar qué porcentaje de
identificaciones completas se tienen en
ese tiempo.

Técnicas disponibles
Técnicas semiautomatizadas
y automatizadas
Sistemas manuales
De
Identificación
Medios
cromógenos
Pruebas rápidas de mesón

Técnicas disponibles
Técnicas semiautomatizadas
y automatizadas
Sistemas manuales
De
Identificación
Medios
cromógenos
Pruebas rápidas de mesón

•MicroScan
•MicroScanW/A
• Phoenix
•Vitek
•Vitek2

Manual o dentro del
equipo. MF: Phoenix
Inoculación de una tarjeta
Dentro del equipo
Lectura periódica de
emisiones:
Fluorogénicas , colorimétricas
Incubación
Tiempo depende
del sistema
Internamente, depende del
software y base de datos
Con un nivel de certeza
c/s recomendación de
pruebas adicionales
Identificación

Técnicas disponibles
Técnicas semiautomatizadas
y automatizadas
Sistemas manuales
De
Identificación
Medios
cromógenos
Pruebas rápidas de mesón

• API (BioMerieux)
• Crystal (BBL)

Requisito de
McFarland
Inoculación de tarjeta o panel
Tiempo y Tº dependen del
sistema
Incubación
Con o sin reactivos
adicionales
Lectura de reacciones
Visual o con
lector
Identificación según base de datos
Con nivel de confianza
Con o sin pruebas adicionales
Interpretación de código

Técnicas disponibles
Técnicas semiautomatizadas
y automatizadas
Sistemas manuales
De
Identificación
Medios
cromógenos
Pruebas rápidas de mesón

Medios cromógenos
• Orina
• Levaduras
•SAMR
– Se basan en la utilización en forma exclusiva
de determinados sustratos que producen
cambios de color en las colonias

Agar Cromógeno Orinas
• CPS ID (BioMerieux)
• Chromagar Orient (BBL)
• Chromogenic UTI
• E.coli utiliza beta glucuronidasa, da color rosado. Enterococo, utiliza
beta glucosidasa, da color azul verdoso
• Incubación overnight,
• PAS permite visualizar presencia de flora uretral
• Mejor visualización que Mconkey de cultivos mixtos
• Mayor facilidad para encontrar enterococcus sp
• 87% de id correcta con color colonia + pruebas de mesón: oxidasa,
indol, TDA.

Indol

Triptofano deaminasa +:Proteus
Se separan por indol

Agar cromógeno levaduras
• Candida diagnostic Agar (oxoid)
• Candida ID (BioMerieux)
• Chromagar cand
• Glucosaminidasa es hidrol. por C.albicans, da color
verde turquesa (blanca con puntos rojos en CDA)
• C.,albicans y dublinensis: 98-100% id, se diferencian por
crec a 42ºC. Las otras 72% id por color, requieren
pruebas adicionales: plasma, ttc, tabletas, API

Tabletas: Rapid Yeast Plus Color Guide (Remel)
Rapid Yeast Plus System (Innovative diag) 4 hrs
API 32 ID y API 20C 48 hrs
Plasma, TTC

Agar cromógeno SAMR
•CromagarSAMR (BD)
• MRSA Select (francés)
• Colonias rosadas a las 18 hrs.
–S: 90%
–E:98%
– Enterococcus sp. crecen , pero azul o
trasparente
• Utilidad para control de IIH

Técnicas disponibles
Técnicas semiautomatizadas
y automatizadas
Sistemas manuales
De
Identificación
Medios
cromógenos
Pruebas rápidas de mesón

• Tabletas de identificación
– Cocaceas
– No fermentadores
– Levaduras
• Latex
– Proteinas estructurales
– PBP 2ª
• Spot tests

Tabletas de identificación
• Para usar en placas: evidencian patrones
naturales de sensibilidad (halo de inhibición) o
requisitos nutricionales (auxonograma, factores
de crecimiento)
• Para usar en líquido: reacciones enzimáticas
cromogénicas (cambio de color). Requisitos: MF
4, algunos requieren sello de parafina estéril.
Lectura a las 4 horas

+
+
+
+
Partículas de poliestileno
de carga positiva
+
Porción amino
Terminal
-
Porción carboxilo
Terminal
Anticuerpo especifico
para el antigeno en
detección

Bacilos gram positivos
1998
Corynebact
Coryneform
API
(Rapid)
Coryne
Stress
90%
(4%error)
Rapid CB
plus
95%
75%
Listeria,
Arcanobact
No
Metodo convencional 7 días: Weaver &Hollis. Métodos
comerciales: hasta 48 hrs. 32% requiere pruebas adicionales

C(-) y B(-) fastidiosos
API NH:
Para neisserias, haemophilus y moraxella
2 hrs (4-6)
MF 4
Evaluación Ago 2006: el mejor para
N.Gonorrhoeae y N.meningitidis
No hay evaluación de Phoenix o Vitek
Id: 73.8% sin pruebas adicionales
99.8 con pruebas adicionales
Pruebas sirven para id de fastidiosos
por tablas

Cocaceas gram positivas
Catalasa positiva
2006
Vitek2 (GP)
SCN
stress
70%
(15% error)
Eficacia
(S.epid)
95%
(7% error)
9 especies más frec
Dg. Por pruebas
Enzimáticas:
85% dg 4hrs
97%dg 24 hrs
Treh,ureasa,F.Alc
S Fosfo,Novo,ODC
Crec.en anae.
Phoenix
API ID 32
67%
(18%)
82%
76%
(14%)
89%
JCM,1995
Ieven,Verhoeven
et al.
Staph

Cocaceas gram positivas
Catalasa positiva
S.aur
SAMR:
detecta presencia de
Proteína PBP2a
Partículas de látex cubiertas con
Fibrinógeno e IgG sensibilizado
anti PS 5 y 8
96-98% identif. Correcta.
Si da negativo: coagulasa
Slidex Staph plus (BM)
Staphaurex Plus (Murex dg)
Pastorex Staph plus (Sanofi)

Cocaceas gram positivas
Catalasa negativa
>1990
API
MS
Ph
Vi
entero
81.5
98.7
90
95.3
viridans
83*
66
84*
82*
* Pruebas adicionales

Bacilos Gram Negativo
Ent
BNF
Vibrio
B.cep
Phoe
90
89.4*
81
v.ch>90
56
*abau
probl
MSw/a
93
78.8
100
68
Vi2
93
95
-
55
10 hrs
Cryst
88
50
81*
-
Vch 97
API
88
92
90*NE
-
*V.ch 50
96 -48h
87 abau
Todos tienen % de error
Evaluación más reciente y su mejor tarjeta

B(-). Lactosa (+) en Mconkey, oxid neg
Beta hemolisis en PAS
no
si
Spot indol
PYR
Otras combinaciones:
Identificación completa
Spot indol
I+ P- : E.coli
Posit: E.coli
JCM, Sept 2000: York et al

Conclusiones
• Agar cromógeno
‣Orinas
‣Levaduras
‣SAMR?
• Pruebas rápidas de mesón:
‣Spot test (flujogramas)
‣Látex cocáceas
‣Tabletas en cocaceas, también para
levaduras

Conclusiones (2)
• Kit comercial manual
‣ NH, Staph, Coryne, BGN
‣ Uso de pruebas individuales
‣ Costo
• Kit comercial automatizado-semiautomatizado
‣ Especialmente si está en línea con LIS
‣ Sistemas de experto para susceptibilidad
‣ Identificación de especies rutinarias
‣ Alto costo

Objetivo del laboratorio de
• Proveer resultados :
microbiología
– Precisos : elección del sistema de
identificación contribuye a este objetivo
– Confiables: control de calidad
– Clínicamente relevantes: criterio
microbiológico depende de las personas,
hasta ahora no lo pueden dar los
instrumentos
– Costo efectivos

Agradecimientos
– Claudia Alvarez
– Catalina Cabezas
– Valeria Corvalan
– Juan Henríquez
– Sara Hormazabal
– Antonio Muñoz (al.)
– M.Cristina Díaz
– M.Teresa Ulloa
– Dras. Porte, Juliet, Fernández, San Martín, García,
Camponovo y Pidal.