Clase 1

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Clase 1

"Cultivo in vitro de células y tejidosvegetales.

AplicacionesBiotecnológicas"


Biotecnología Vegetal

¿Paraquécultivarin vitrocélulas,tejidosyórganosvegetales?

• micropropagación

• mejoramiento deplantas

• producción decompuestos deinterés in vitro

producción demetabolitos secundarios

producción yutilización deproteínas vegetales

producción depolímeros biodegradables

• establecimiento deplantas transgénicas

plantas resistentes avirus

plantas con rutas metabólicas modificadas

plantas mejoradas en cuanto acomposición de

proteínas, aceites, etc.

• fitorremediación

remoción dexenobióticos

remoción demetales pesados


Principales conceptos

fisiológicos aplicables a los

cultivos in vitro

-Totipotencialidad celular

-Indiferenciación / Rediferenciación


Concepto de “ Totipotencia ”

toda célula vegetal individual es capaz de regenerar

una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin

importar el grado de diferenciación alcanzado

Haberlandt a principios del siglo veinte


Principales conceptos fisiológicos

aplicables a los cultivos in vitro

Indiferenciacion-rediferenciación


Tipos de cultivo


Aplicaciones

-Mejora y selección genética

-Conservación del germoplasma

-Sanidad Vegetal

-Estudios metabólicos y fisiológicos

-Micropropagación

-Producción de metabolitos primarios, secundarios y de proteínas.

-Bioconversiones y biocatálisis


Cultivos organizados: Son aquellos que mantienen

características de organización estructural. La progenie

presenta idénticas propiedades que el material original.

Por ejemploel cultivo de órganos.

Cultivos no organizados: Son aquellos en los que las

células otejidos aislados se indiferencian ingresando en un

ciclo de división y crecimiento de duración indefinida. La

principal desventaja de estos el la inestabilidad genética ya

que se genera frecuentemente poliploidía. Por ejemplo las

suspensionescelulares.

Cultivos organizados-no organizados: Son aquellos que se

originan apartir de cultivos indiferenciados (no organizados)

que dan origen acallos yagregados celulares, con cierto grado

de diferenciación, obien aórganos oembriones somáticos. La

principal desventaja es que la progenie no siempre es

completamente idéntica puesto que surgen de cultivos

potencialmentepoliploides.


¿Qué tener en cuenta para cultivar in vitro vegetales?


a.- Sala de lavado y esterilización

b.- Sala de preparación de medios

c.- Sala de transferencia de material

d.- Sala de incubación


área delavadoypreparación

Disponibilidad de agua corriente, agua destilada, agua

bidestiladay/o desionizada

Material de vidrio de uso exclusivo para cultivo

Balanzas, equipos de medición de pH,

agitadores, mantos de calentamiento,

microondas, heladeras, freezers

Equiposdeesterilización:

Estufas

AUTOCLAVES!!!!!


AREA DE TRANSFERENCIA

consiste en una ZONA ESTÉRIL con disponibilidad de

fuentes de electricidad, vacío, aire comprimido y fuego

Habitación pequeña, libre de polvo,

superficies de trabajo lisas,

con una lámpara UV sobre la mesada de trabajo,

presión positiva,

sistema de filtración de aire

Filtros HEPA (high-efficiency particulate air filter)

0.3-µm HEPA de 99.97-99.99% eficiencia


Lo recomendable Cabina de FLUJO LAMINAR

In a LAMINAR FLOW HOOD the air is forced into the unit through adust filter then passed through

a HEPA filter. The air is then either directed downward (VERTICAL FLOW UNIT) or outward

(HORIZONTAL FLOW UNIT) over the working surface. The constant flow of microbe-free filtered air

prevents non-filtered air and particulate matter in the room from settling on the working surface.


Otra opción: Caja de Guantes


Sala o cámara de cultivo


LA TEMPERATURA

la mayoría de las especies desarrollan bien a

temperaturas de incubación que oscilan entre los

20 y28°C. Para especies de zonas templadas es

idealtrabajara22°C

El control de la temperatura no es solamente importante

porque pueda afectar al crecimiento del cultivo sino

también porque puede ser un factor que induzca otros

procesos fisiológicos

Lo importante es el mantenimiento de temperaturas

constantes

Así, temperaturas bajas (del orden de 4-5°C) permiten superar los

periodos de dormición de algunas leñosas yla conservación prolongada

dedeterminados cultivos in vitro;

mientras que una temperatura constante de 20°C induce la formación

deraíces en lamayoría deconíferas


LA TEMPERATURA

¿Como se controla?

•Conociendo la temperaturaambientede lasaladondesesitúe

yel calor generado por las fuentes de luz deque dispone.

•El control de la temperatura ala que se desarrolla el cultivo in

vitro se efectúa mediante un sistema de refrigeracióncalefacción

controlado através deun termostato.

•El sistema de refrigeración-calefacción debe estar

correctamente dimensionado a fin de conseguir que la

temperatura de la zona de cultivo se mantenga dentro de los

límites deseados.


LA TEMPERATURA

IMPORTANTE!!!!

•LA HOMOGENEIDAD de temperatura: es decir la variación

de la temperatura en diferentes zonas de la cámara. Se

puede aumentar la homogeneidad haciendo circular el aire

dentro de la cámara mediante un sistema de ventilación

•LA ESTABILIDAD DE LA TEMPERATURA: es decir, una

medida de la variación de la temperatura de la cámara de

cultivo a lo largo del tiempo


LA LUZ

•La luz es esencial para las plantas debido a que proporciona la energía

necesaria para la fotosíntesis.

•La clorofila y los demás pigmentos fotosintéticos captan la energía

contenida en diferentes radiaciones para incorporarla a las diversas

reacciones químicas que constituyen el proceso.

•Pero la luz tambien puede intervenir en otros procesos fisiológicos,

como el fototropismo, la germinación, la floración,etc.

•Todos estos fenómenos no son producidos en igual medida por todos

los tipos de luz (radiaciones de cualquier longitud de onda) sino que

algunas radiaciones concretas tienen un efecto notable mientras que

otras tiene poco o ningún efecto. Es por ello que es preciso conocer el

espectro de la radiación que es activo en el proceso fisiológico

estudiado.


LA LUZ

•La cámara de cultivo deberá reproducir lo mejor

posible ese espectro de luz activo, por lo tanto

conviene conocer cual es el espectro que emiten

nuestras fuentes de luz y en que medida se adapta

éste a las necesidades de nuestro cultivo.

La luz es uno de los factores principales que

determinan el desarrollo de los organismos

autótrofos, en ello radica la importancia de

controlar el factor luz enlos cultivos invitro.


LA LUZ

•LA CANTIDAD DE LUZ: LA IRRADIACIÓN:

•la iluminación de una superficie se puede expresar en

lux (en realidad se trata de una unidad definida en

términos de percepción del ojo humano);

• o bien midiendo la irradiancia, es decir, la energía

radiante que llega a una superficie dada en un intervalo

de tiempo. La irradiancia puede ser expresada en

función de la energía: Wm -2 ; o en función de los fotones:

µmol m -2 s -1

•Cuando el sensor del equipo con el que medimos

la irradiancia está diseñado para detectar solo las

longitudes de onda comprendidas entre 400 y 700

nm, obtenemos una medida de la radiación

fotosintéticamente activa (PAR)


LA LUZ

•LA CANTIDAD DE LUZ: LA IRRADIACIÓN:

•La irradiación habitual en el campo (a plena insolación puede

llegar a 450 W m -2 ) resulta nociva en condiciones in vitro

•Es habitual usar irradiaciones mucho menores (un 10% del valor de

plena insolación)

•Se asume que las necesidades de luz de los

cultivos in vitro son inferiores a las de la planta in

vivo, dado que el medio de cultivo contiene

cantidades importantes de sacarosa, los cultivos in

vitro se comportan sólo parcialmente de forma

autotrófica. Además, una irradiación excesiva

produciría un aumento notable de la temperatura

dentro del recipiente de cultivo debido al efecto

invernadero.


LA LUZ

•Principales fuentes de luz usadas en las cámaras de cultivo

LAMPARAS

INCANDESCENTES

Producenla luzporfenómenos de incandescencia del filamento calentadopor

el pasode la corriente eléctrica. Buena parte del espectro se halla en la zona

del rojo/rojo lejano. Producen gran cantidadde calor y mucho consumode

electricidad.

LAMPARAS

FLUORESCENTES

Producenla luzporfenómenos de fluorescencia del gas sometidoa un arco

voltáico. El espectro de la luz producidaes ricoen la zonadel azul, existen

fluorescentes especiales con un espectro ricoen la zona azuly roja. Consumen

menoselectricidad.

LAMPARAS DE VAPOR DE

MERCURIO Y SODIO

Producenla luzporefecto del pasode la corrienteeléctrica a través

de gases calientes de mercurio(azul y verde) y sodio(naranja). Son

altamenteeficientes en el consumode electricidad.


LA LUZ

•La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad:

El fotoperiodo: Algunos fenómenos propios del desarrollo

de las plantas (germinación, floración, tuberización, etc.)

pueden ser activados por el número de horas diarias de

luz que recibe la planta.

De forma análoga, el número de horas de luz que recibe

el explanto cultivado in vitro puede afectar a su

desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será

también el mejor fotoperiodo in vitro.


LA LUZ

Control del fotoperiodo

La regulación del fotoperiodo se consigue

mediante un programador conectado al circuito de

iluminación.

El programador del fotoperiodo puede estar

relacionado con el programador de temperaturas,

de forma que se puedan programar diferentes

temperaturas según sea la fase del fotoperiodo en

la que se halle el cultivo.


¿Qué tener en cuenta para cultivar in vitro vegetales?


Tissue Culture Media-Composition

One of the most important factors governing the growth

and morphogenesis of plant tissues in culture is the

compositionof the culture medium.

The basic nutrient requirements of cultured plant cells

are very similarto those of whole plants.

Plant tissue and cell culture media are generally made up of some or all of

the following components:

macronutrients, micronutrients, vitamins, amino acids or other nitrogen

supplements, sugar(s), other undefined organic supplements, solidifying

agents or support systems, and growth regulators..

Several media formulations are commonly used for the majority of all cell

and tissue culture work.

These media formulations include those described by White, Murashige and

Skoog, Gamborg et. al., Schenk and Hilderbrandt, Nitsch and Nitsch, and

Lloyd and McCown.


Macronutrients

The macronutrients provide the six major elements:

nitrogen (N),

phosphorus (P),

potassium (K),

calcium (Ca),

magnesium (Mg),

and sulfur (S)-required for plant cell or tissue

growth

The optimum concentration of each nutrient for achieving

maximumgrowth rates varies considerably among species


Macronutrients

N

Culture media shouldcontain at least 25-60 mM of inorganic

nitrogenfor adequateplant cell growth

NITRATES RANGE 25-30 mM

Plant cells may grow on nitrates alone, but considerablybetter results are

obtainedwhen the medium containsboth a nitrate and ammoniumnitrogen

source

AMMONIUM RANGE 2 - 20 mM

For certain speciesammoniumconcentrationsin excess of 8 mM may be

deleteriousto cell growth of certain species

Some cells can grow on a culture medium containingammonium

as the sole nitrogen source if one or more of theTCA cycle acids

(e.g., citrate, succinate, or malate) are also includedin the culture

mediumat concentrationsof approximately10 mM.

Whennitrate and ammoniumsources of nitrogen are utilized together in the culture

medium, the ammoniumions will be utilized more rapidly and before the nitrate ions.


Macronutrients

K

Potassiumis required for cell growth of most plant

species. Most media contain K, in the nitrate or chloride

form, at concentrationsof 20-30 mM.

P

Mg

S

Ca

The optimumconcentrationsof P, Mg, S, and Ca

range from 1-3 mM when all other requirementsfor

cellgrowth are satisfied.

Higher concentrationsof these nutrientsmay be

requiredif deficienciesin other nutrientsexist.


Micronutrients

The essentialmicronutrientsfor plant cell and tissue growth include:

iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), and

molybdenum (Mo)

Fe Concentrationarround 1µM

Iron may be the most critical of all the micronutrients. Iron citrate and

tartrate may be used in culture media, but these compounds are

difficult to dissolve and frequently precipitate after media are

prepared. Murashige and Skoog used an ethylene diaminetetraacetic

acid (EDTA)-iron chelate to bypass this problem.


Micronutrients

Cu

Co

concentrations of 0.1 µM

Mo

concentrations 1 µM

I concentrations 5 µM Zn

concentrations 5-30 µM

Mn

concentrations 20-90 µM B concentrations 25-100 µM


Componentes (mg/L) Chu N6 DKW/Juglan Gamborg B5

Gamborg B-5

minimal

organics

Hoagland

McCown

woody

plant

Murashige

and

Skoog

Quoirin

and

Lepoivre

Schenk

and

Hildebrandt

White

Ammonium nitrate 1416.0 400.0 1650.0 400.0

Ammonium phosphate

monobasic

115.03 300.0

Ammonium sulfate 463.0 134.0 134.0

Boric acid 1.6 4.8 3.0 3.0 2.86 6.2 6.2 6.2 5.0 1.5

Calcium chloride anhydrous 125.33 112.5 113.24 113.24 72.5 332.2 151.0

Calcium nitrate 1367.0 656.4 386.0 833.77 200.0

Cobalt chloride • 6H 2

O 0.025 0.025 0.025 0.025 0.1

Cupric sulfate • 5H 2

O 0.25 0.025 0.025 0.08 0.25 0.025 0.025 0.2

Na 2

-EDTA 37.25 45.4 37.3 37.25 37.3 37.26 37.3 20.0

Ferric sulfate 2.5

Ferric tartrate • 2H 2

O 5.32

Ferrous sulfate • 7H 2

O 27.85 33.8 27.8 27.85 27.8 27.8 15.0

Magnesium sulfate 90.37 361.49 122.09 122.09 240.76 180.7 180.7 175.79 195.4 360.0

Manganese chloride • 4H 2

O 1.81

Manganese sulfate • H 2

O 3.33 33.5 10.0 10.0 22.3 16.9 0.76 10.0 5.04

Molybdenum trioxide 0.016

Molybdic acid (sodium salt) •

2H 2

O

0.39 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.1

Potassium chloride 65.0

Potassium iodide 0.8 0.75 0.75 0.83 0.08 1.0 0.75

Potassium nitrate 2830.0 2500.0 2500.0 606.6 1900.0 1800.0 2500.0 80.0

Potassium phosphate

monobasic

400.0 265.0 170.0 170.0 270.0

Potassium sulfate 1559.0 990.0

Sodium phosphate monobasic 130.5 130.5 16.5

Sodium sulfate 200.0

Zinc nitrate • 6H 2

O 17.0

Zinc sulfate • 7H 2

O 1.5 2.0 2.0 0.22 8.6 8.6 8.6 1.0 2.67


Carbon and Energy Source

Carbohydratesmust be suppliedto the culture medium becauseonly a few

plantcell lines are fully autotrophic.

The preferred carbohydrate in plant cell culture media is sucrose

Sucrose

concentrationsof culture media normallyrange between 2 and 3 percent

Glucose and fructose are used in some cases

Use of autoclaved fructose can be detrimentalto cell growth!!!!

Other carbohydratesthat have been tested includelactose, galactose, rafinose,

maltose, and starch.


Vitamins

Whenplant cells and tissues are grown in vitro,

some vitamins may become limiting factors for

cell growth

Normal plants synthesize the vitamins required for their growth

and development.

Vitamins are required by plants as catalysts in various metabolic

processes

The vitamins most frequently used in cell and tissue culture

media include thiamin (B1), nicotinic acid, pyridoxine (B6),

and myo-inositol


Vitamins

Thiamin

B1

It is basically required by all cells for growth.

Concentrations range from 0.1 to 10.0 mg/l.

Nicotinic acid

concentrations of 0.1-5.0 mg/l

Pyridoxine B2

used at 0.1-10.0 mg/l

Nicotinic acid and pyridoxine are often added to culture

media but are not essential for cell growth in many

species.


Vitamins

Other vitamins such as biotin, folic acid, ascorbic acid,

pantothenicacid, vitamin E(tocopherol), riboflavin,

and p-aminobenzoic acid have been included in some cell

culture media.

The requirementfor these vitamins by plant cell culturesis generally

negligible, and they are not consideredgrowth-limiting factors.

These vitamins are generallyadded to the culture mediumonly

when the concentrationof thiamin is below the desired level or when

it is desirableto grow cells at very low populationdensities.


Myo-inositol is commonly included

in many vitamin stock solutions

OH

HO

HO

Although it is a polialcohol derived

from carbohydrates not a vitamin

HO

OH

OH

it has been shown to stimulate growth in

certain cell cultures.

Myo-inositol is generally used in plant cell

and tissue culture media at

concentrations of 50-5000 mg/l


Vitamin complex

MS Vitamins contains:

2.0 mg Glycine,

0.5 mg NicotinicAcid,

100 mg myo-Inositol,

0.5 mg Pyridoxine HCl,

0.1 mg Thiamine HCl

LS Vitamins contains:

100 mg myo-Inositol

0.1 mg Thiamine HCl

GB Vitamins contains:

1.0 mg NicotinicAcid,

100 mg myo-Inositol,

1.0 mg Pyridoxine HCl,

10.0 mg Thiamine HCl


AMINO ACIDS OR OTHER NITROGEN SUPPLEMENTS

Although cultured cells are normally capable of synthesizing all of

the required amino acids, the addition of certain amino acids or

amino acid mixtures may be used to further stimulate cell growth

Theuse of amino acids is particularly important forestablishing

cell cultures and protoplast cultures

Amino acids provide plant cells with an immediately available source of

nitrogen, which generally can be taken up by the cells more rapidly than

inorganic nitrogen

Whenamino acids are added alone, care must be taken, as

they can be inhibitoryto cell growth

Tyrosine has been used to stimulate morphogenesis in cell

culturesbut should only be used in an agar medium.

Supplementationof the culture mediumwith adenine sulfate can

stimulate cell growth and greatly enhance shoot formation.


AMINO ACIDS OR OTHER NITROGEN SUPPLEMENTS

Themost common sources of organic nitrogen used in culture

media are amino acid mixtures (e.g., casein hydrolysate), L-

glutamine, L-asparagine, and adenine

Casein hydrolysate concentrations between 0.05 and 0.1 percent

Examples of amino acids included in culture media to enhance

cell growth:

glycine at 2 mg/liter,

glutamine up to 8 mM,

asparagine at 100 mg/liter,

L-arginine and cysteine at 10 mg/liter,

L-tyrosine at 100 mg/liter.


Undefined Organic Supplements

Addition of a wide variety of organic extracts to

culture media often results in favorable tissue

responses

Supplements that have been tested include protein

hydrolysates, coconut milk, yeast extracts, malt

extracts, ground banana, orange juice, and tomato juice

They should only beused as a last resort, and only coconut milk

and protein hydrolysates are used to any extent today

coconut milk is commonly used at 5-20% (v/v).


UndefinedOrganicSupplements

The addition of activated charcoal (AC) to culture media may have

a beneficial effect

AC may cause:

absorptionof inhibitorycompounds

absorptionof growth regulatorsfrom the culture medium

and darkeningof the medium

The stimulation of cell growth by AC is generally attributed to its ability

to bind to toxic phenolic compounds produced during culture

The inhibition of growth in the presence of AC is generally

attributed to the absorption of phytoregulators, such as 1-

Napthaleneacetic acid (NAA), kinetin, 6-benzylaminopurine

(BA), indole-3-acetic acid (IAA), and 6-γ-γdimethylallylaminopurine

(2iP)

AC is generally acid-washed prior to additionto the culturemedium

at a concentrationof 0.5-3.0 percent


Solidifying Agents or Support Systems

Agar is the most commonly used gelling agent for preparing

semisolid and solid plant tissue culture media

Agar advantages over other gelling agents

Mixed with water, it forms a gel that melts at approximately 60°-100° Cand

solidifies at approximately 45°C; thus, agar gels are stable at all feasible

incubation temperatures

Agar gels do not react with media constituents and are not digested by plant

enzymes

The firmness of an agar gel is controlled by the concentration and brand of

agar used in the culture medium and the pH of the medium

The agar concentrations commonly used in plant cell culture media range

between 0.5 and 1.0%; these concentrations give a firm gel at the pH’s typical

of plant cell culture media


SolidifyingAgentsorSupportSystems

Carrageenans or carrageenins are a familyof linear

sulphatedpolysaccharidesextracted from red seaweeds

The name is derived from a type of seaweed that is abundantalong the Irish

coastlinenear the village of Carragheen. Gelatinousextracts of carrageen

seaweed (also known as Irish moss) have been used as food additives for

hundredsof years


SolidifyingAgentsorSupportSystems

Alginic acid (algine, alginate) is aviscous gum that is abundant in the cell walls

of brown algae.

Chemically,it is alinear copolymer with homopolymeric blocks of (1-4)-linked ß-Dmannuronate

(M) and its C-5 epimer α-L-guluronate (G) residues, respectively,

covalentlylinked together in differentsequencesor blocks.

The monomers can appear in homopolymeric blocks of consecutive G-residues

(G-blocks), consecutive M-residues (M-blocks), alternating Mand G-residues

(MG-blocks) or randomlyorganized blocks.

The chemical compound sodium alginate is the sodium salt of alginic acid. Its

empirical chemical formula is NaC 6 H 7 O 6 .Its form as agum, when extracted

from the cell walls of brown algae, is used by the foods industry to increase

viscosity and as an emulsifier. It is also used in indigestion tablets and the

preparationof dental impressions.


SolidifyingAgentsorSupportSystems

Another gelling agent commonly used for commercial as well

as research purposes is Gelrite

Gelrite is synthetic and should be used at 1.25-2.5 g/l, resulting in a clear gel

which aids in detecting contamination

Alternative methods of support have included use of perforated cellophane,

filter paper bridges, filter paper wicks, polyurethane foam, and polyester fleece.


pH

El pH final del medio de cultivo es un factor importante por diversas razones:

•Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la solidificación de los agentes

gelificantes añadidos a los medios sólidos Si la evolución del pH del

medio lo hace bajar por debajo de 3.5 se puede producir su licuación

•El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos componentes del

medio de cultivo

•El valor del pH puede afectar a la absorción de determinados nutrientes por

parte del explanto (p.e. la absorción de iones NO 3- aumenta con la acidez del

medio)

•El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y como

consecuencia a la actividad de muchos enzimas


pH

En general, se trabaja a pH entre 5.2 y 5.8.

•Una vez ajustado el pH del medio, este sufrirá una ligera

acidificación durante el proceso de esterilización en autoclave,

para, después, evolucionar nuevamente durante el curso del

cultivo, de forma que habitualmente se irá acidificando

progresivamente como resultado de la absorción diferencial de

algunos componentes del medio de cultivo, así como de la

excreción de exudados por parte del explanto.

•El control del pH inicial del medio y de su dinámica durante el

cultivo tiene una gran importancia en el desarrollo de cualquier

proyecto de cultivo in vitro

•A pesar de su importancia, en muchos experimentos este

control se limita a fijar su valor inicial sin reparar en los posibles

efectos de su dinámica.


Preparingstock solutions

Theuse of stock solutions reduces the number of

repetitiveoperations involved in media preparation and,

hence, the chance of human or experimental error

Macronutrients

Stock solutions of macronutrients can beprepared at 10

times the concentration of the final medium

Sometimesa separatestock solution for calcium saltsmaybe requiredto

preventprecipitation

Stock solution of macronutrients can bestored safely

forseveral weeks in a refrigerator at 2°-4°C


Micronutrients

Micronutrient stock solutions are generally madeup at

100 times their final strength

Itisrecommended that micronutrient stocks be

stored in either a refrigerator or freezer until

needed

Micronutrient stock solutions could be stored in a refrigerator

forup to 1 year without appreciable deterioration

Iron stock solutions should beprepared and stored

separately from other micronutrients in an amber

storage bottle


Vitamins

Vitamins are preparedas 100 X or 1000 X stock

solutions and stored in a freezer (-20°C) until used

Vitamin stock solutions can be stored safely in a

refrigerator for 2-3 months but should be discarded

after that time.


Growth Regulators

The auxins NAA and 2,4-D are considered to be stable

and can be stored at 4°C for several months

IAA should bestored at -20°C

Solution of NAA and 2,4-D can bestored for several

months in a refrigerator or indefinitely at -20°C

Auxinstock solutions are generally prepared at 100-

1000 times the final desired concentrations

Generally IAA and 2,4-D are dissolved in a small volume

of 95% ethyl alcohol or KOH and then brought to volume

withdouble-distilled water

NAA can bedissolved in a small amount of 1 N NaOH or

KOH, which also can beused to dissolve 2,4-D and IAA


Storage of Stock Solutions

For convenience, many labsprepare stock solutions and

then divide them into aliquots sufficient to prepare from

1 to 10 liter of medium; these aliquots are stored in small

vialsor plastic bags in a freezer

This procedure removes the inconvenience of having to

thaw a large volume of frozen stock each time medium

is prepared.

Some have found that heating in a microwave oven is

a satisfactory and quick method of thawing

concentrated medium.


Conviene tener en

cuenta que algunos de

los componentes del

medio de cultivo pueden

ser termolábiles

(algunas vitaminas,

algunos reguladores).

En este caso, la

esterilización de la

solución que contienen

la sustancia termolábil

debe hacerse por

filtración y añadirse una

vez esterilizada al medio

de cultivo previamente

esterilizado y

parcialmente (en medios

sólidos) o totalmente (en

medios líquidos)

enfriado

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