Neurospora crassa - BioScripts

Tema 13
Genética de hongos filamentosos:
Neurospora crassa

Genética Molecular de Neurospora crassa
•Ciclo de vida
•Neurospora en el laboratorio
•Genética de Neurospora
•Genética molecular de Neurospora
•Transformación
•Herramientas disponibles
•Inactivación génica
•El genoma de Neurospora

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•Inactivación génica
•El genoma de Neurospora

Neurospora en la naturaleza

Neurospora crece
sobre troncos que
han sido quemados

Primera descripción de Neurospora como el hongo que causó
la contaminación de panaderías francesas en 1843

Shear CL y Dodge BO (1927)
Life stories and heterotallism
of the red bread mold fungi of
the Monilia sitophila group.
J. Agric. Res. 34: 1019-1042.
Describió las estructuras sexuales y la
segregación del tipo sexual en varias
especies de Neurospora.
Bernard O. Dodge
(1872-1960)

Ciclos de vida de Neurospora crassa

Especies de Neurospora
Heterotálicas
N. crassa
N. discreta
N. intermedia
N. sitophila
Pseudohomotálica
N. tetrasperma
Homotálicas
N. africana
N. dodgei
N. galapagosensis
N. lineolata
N. terricola
N. pannonica

Ciclo sexual de una especie heterotálica

Ciclo sexual de una especie homotálica

Ciclo sexual de una especie pseudohomotálica

Ciclo vegetativo de Neurospora crassa
germinación
conidios
micelio
conidióforos

Hifas de
Neurospora

Conidiación de Neurospora crassa

Conidios de Neurospora crassa

Macroconidios y microconidios de Neurospora

Un reloj
circadiano
regula la
conidiación

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•Inactivación génica
•El genoma de Neurospora

Cultivos de Neurospora crassa

Cultivos de Neurospora crassa

Medio con sorbosa

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Mutagénesis
Agentes mutagénicos usados en Neurospora
Radiaciones
• Ultravioleta
• Rayos X
Agentes químicos
• Ácido nitroso
• Metanosulfonato de etilo (EMS)
• Metilhidroxiamina
• ICR170
• Nitrosoguanidina

medio completo
Búsqueda de
mutantes
auxótrofos
medio mínimo
medio con grupos de nutrientes
medio con distintos
aminoácidos
el medio con arginina permite el crecimiento

Premio Nobel de Fisiología o Medicina 1958
George W. Beadle
(1903-1989)
Edward L. Tatum
(1909-1975)
El aislamiento y la caracterización mutantes auxótrofos de Neurospora les
permitió formular la hipótesis de que un gen era responsable de una
enzima.

Enriquecimiento por filtración
Los protótrofos se
quedan en el filtro
Medio mínimo
Silvestres
protótrofos
Mutantes
nutricionales
(auxótrofos)
Sembrar
Los auxótrofos pasan
a través del filtro
Los auxótrofos crecen
Medio con leucina

Ruta de la carotenogénesis de Neurospora

Medio con sorbosa
Mutante albino

Mutantes de la carotenogénesis de Neurospora
Naranja
(silvestre)
Albino
Amarillento
Rojizo

Mutantes morfológicos
de Neurospora

0.5
Frecuencia de los conidios
0.4
0.3
0.2
0.1
0.15
0.46
0.25
0.09
0
1
0.03
0.01 0.01
2 3 4 5 6 7
Núcleos por conidio

Heterocariosis
Los heterocariontes nos dan información sobre los
mutantes:
• Permite saber si las mutaciones son dominantes
of recesivas
• Permite identificar grupos de complementación

El micelio de Neurospora es un cenocito

Complementación en Neurospora
Células arg-1 alteradas en una
enzima de la ruta de síntesis
de arginina
Células arg-2 alteradas en una
enzima distinta de la ruta de
síntesis de arginina
Fusión
El heterocarionte
crece sin arginina

Grupos de
complementación:
grupo
I
II
III
IV
V
mutantes
1, 5
2, 4, 6, 7
3
8, 10
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
o
+
+
+
o
o
+
o
+
o
+
+
o
+ o
+ o + o + o
+ o + o + o o
+ + + + + + + o
+ + + + + + + + o
+ + + + + + + o +
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
o

Ciclo sexual de
Neurospora

Ciclo sexual de Neurospora
Niveles bajos
de C y N
Peritecio
Formación de
protoperitecios

Ciclo sexual de Neurospora
Meiosis

Ascosporas

Las octadas ordenadas permiten
detectar el ligamiento al centrómero

El reparto de los cromosomas en la octada permite
observar varios patrones de segregación

Productos de la meiosis en Neurospora
Desarrollo de ascas con el resultado de la meiosis de un diploide producto de
un cruzamiento entre dos mutantes de la coloración de la ascospora. Se
observa la segregación en la primera y segunda división meiótica.

Durante la
recombinación se
producen
moléculas de ADN
heterodúplices

Detección de la conversión
génica

Estimación de la distancia genética por
recombinación

cyhR: resistente a cicloheximida
hom: auxórofo de homoserina
nic: auxórofo de nicotóico
al: albino
cyhR al hom nic
cyhR al hom nic
silvestre
+ + + +
1 2 3
cyhR al hom nic + + + + parentales 99 106
cyhR + + + + al hom nic
cyhR al + + + + hom nic
rec en 1
rec en 2
22 22
4 8
cyhR al hom
+ + + +
nic
rec en 3
22 17
cyhR
+
hom nic + al + +
rec en 1 y 2
1 1
cyhR
+
+ nic + al hom +
rec en 1 y 3
0 0
cyhR al
+ nic + + hom +
rec en 2 y 3
3 5

Estimación de la distancia genética por
recombinación
cyhR al hom nic
+ + + +
1 2 3
17.4 % 4.5 % 15.2 %
cyhR al hom nic
17.4 4.5 15.2

Grupo de ligamiento I
Existen unos 1000 marcadores genéticos
localizados en siete grupos de ligamiento

Detección de mutaciones en el ADN
mitocondrial

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Ingeniería genética en Neurospora
Introducción de ADN:
• Transformación de esferoplastos
• Electroporación de conidios
Plásmidos integrativos
• Resistencia a benomilo e higromicina
Otras herramientas:
• Promotores regulables: qa-2
• Fusiones con lacZ, GFP y luciferasa para medir
transcripción y detectar proteínas.
• Inactivación génica.

Integración del ADN en hongos
Vector
Receptor de la
transformación
Cromosoma I
Cromosoma II
Reemplazamiento
génico
Duplicación
Integración
ectópica
Vector

Receptor
vector
Integración ectópica
Integración ectópica múltiple
Integración homóloga
Reemplazamiento

Transformación en Neurospora
• La competencia es una propiedad del núcleo (co-transformación).
• Cuando ocurre integración homóloga no suele ocurrir integración
ectópica en el mismo núcleo.
• El 1% de los transformantes estables han sufrido recombinación
homóloga (si es posible).
• 10% de transformantes ectópicos han sufrido alteraciones
cromosómicas con frecuencia.
• 100% de transformantes por recombinación homóloga en estirpes
con una mutación en el gen mus-51 o mus-52 responsables de la
recombinación no homóloga.

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Cósmidos para construir genotecas en Neurospora

Clonación en
Neurospora por
selección de
grupos (sib
selection)

Núcleos de Neurospora marcados con H1-GFP

Microtúbulos de
Neurospora
marcados con
tubulina-GFP

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El genoma de Neurospora
Tamaño: 42 Mb
Genoma secuenciado: 39.225.835 bp (rel. 7)
Cromosoma
I
II
III
IV
V
VI
VII
Tamaño (Mb)
10.3
9.2
5.7
5.1
4.6
4.0
4.0

Contenido G+C
Total: 50%
ADN codificante: 44%
ADN no codificante: 56%
Intrones
Presentes en el 80% de los genes
Longitud promedio: 134 pb
Promedio de 1,7 intrones por gen
Un transposón activo, Tad, muchas copias de
transposones inactivos (RIP),

Tamaño (Mb)
Genes
Haemophilus
Saccharomyces
C. elegans
Drosophila
Homo
1,8
12
100
165
3000
1.709
6.144
18.266
13.338
20.000
Neurospora 42 ? 10.620

Fin