Genética y Biotecnología Ambiental Ge é c y o ec o og b e Ge é c y o ...

Genética y Biotecnología o og Ambiental
CC. Ambientales
Dr. Antonio Coloma Jerez.
Despacho 009 Edificio Departamental I.
Campus de Ciencias de la Salud.
Avda. Atenas s/n C.P. 28922 (Alcorcón).
Teléfono: 914888876
correo electrónico: antonio.coloma@urjc.es
Pág. web docente:
http://docentes.cs.urjc.es/~acoloma
1

Genética y Biotecnología o og Ambiental
CC. Ambientales (Temas 5 a 8)
Dr. Oscar de Luis Jiménez
Despacho 019 Edificio Departamental I.
Campus de Ciencias de la Salud.
Avda. Atenas s/n C.P. 28922 (Alcorcón).
Teléfono: 914888617
correo electrónico: oscar.deluis@urjc.es
Pág. web docente:
http://docentes.cs.urjc.es/~odeluis
2

Genética y Biotecnología Ambiental
• Teoría:
1. BIOLOGÍA MOLECULAR DEL MATERIAL GENÉTICO (Temas 1 a 4).
2. LA TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE (Temas 5 a 9)
3. MODIFICACIÓN C GENÉTICA DEORGANISMOS OS Y SUS APLICACIONES
C BIOTECNOLÓGICAS (Temas 10 a 15).
• Examen final:
-Preguntas de tipo test (opción múltiple) =50% de la nota
-Preguntas cortas = 50% de la nota
3

Genética y Biotecnología Ambiental
• Prácticas:
1. Requisitos indispensables:
Asistencia a las mismas.
Aprobar el examen de prácticas.
2. Consisten en:
-Transformación bacteriana mediante un plásmido y selección de
transformantes resistentes a un antibiótico
-Purificación de DNA del plásmido y análisis mediante electroforesis.
-Mutagénesis. Estudio de la acción de la radiaciónultravioleta ió i l sobre cepas de
bacterias (o levaduras) normales o mutantes deficientes en sistemas de
reparación del DNA.
4

I. Biología Molecular del Material
Genético
Tema 1: Introducción a la tecnología del ADN
recombinante y a la biotecnología.
5

Biotecnología
como disciplina
integrada
6

I. Biología Molecular del Material
Genético
Tema 2: Estructura, organización y reparación del
ADN.
7

Estructura de doble hélice para el DNA bicatenario
Difractograma
10 pb
Watson-Crick: Cadenas
antiparalelas y complementarias
unidas entre sí por 2 PdeH entre
A y T y 3 entre G y C.
8

Estructura de doble hélice para el DNA bicatenario
Polaridad 5’-3’ : síntesis del enlace fosfodiéster de 5’-fosfato a 3’-OH.
Estabilidad del polinucleótido de ADN vs el de ARN
5’ Fosfato.
3’ OH.
9

Estructura de doble hélice para el DNA bicatenario
Ordenación antiparalela, Enlaces
intercatenarios y Surcos.
Formas Z(lev), B(dex) y A(dex) del dsDNA
Regla de Chargaff: En el ADN de
doble hebra, [A]=[T] y [G]=[C]
10

Bases moleculares de las reglas de Chargaff y Watson-Crick
1. Rigidez del enlace fosfodiéster (covalente): restricción de rotación
2. Favorecimiento de la conformación anti del enlace glicosídico
3. Predominio de los tautómeros oxo y amino de las bases.
Enlace fosfodiéster
Conformación sin y anti
Tautomerismo sustituyentes Amino- y Oxo-
Amino-Imino
Oxi-Hidroxi
sin
DNA levógiro
anti
DNA dextrógiro
Ceto-Enol
11

Antiparalelismo: Hebras codificante y molde
Proporciona molde para la replicación y para la transcripción
12

Los componentes básicos y su papel en el proceso
de información (utilización y transmisión)
Dogma central
del flujo de
información
13

Genes
Genes procarióticos
Gen eucariótico
14

Secuencias repetitivas
en Eucariotas
15

Organización estructural
del genoma en eucariotas
16

Nucleosoma
(Core: Octámero)
Organización estructural del
genoma en eucariotas
Nucleosoma con
ADN (Frontal)
H2A
H2B
H3
H4
Nucleosoma con
ADN (Lateral)
1,75 vueltas
17

Cromosomas metafásicos y Cariotipo
Brazo P
Brazo Q
Cromosoma metafásico: 2 Cromátidas
18

Cromosomas metafásicos
y Cariotipo
19

Tipos de proteínas implicadas en la replicación:
-DNA polimerasas
-Helicasas
-Topoisomerasas
-DNA primasa
-Prots. Unión a ssDNA
-DNA ligasa
Polimerizado de desoxinucleótidos.
Desenrrollado progresivo del dsDNA.
Libera la tensión torsional generada por el
desenrrollado inducido por las helicasas.
Inician la síntesis de oligos RNA.
Impiden renaturalizado prematuro del ddDNA.
Sella mellas en hebra sencilla entre la cadena
naciente y los fragmentos de Okazaki en la hebra
retardada.
20

Esquema de la replicación del ADN
21

Mutaciones en la secuencia del ADN
1. Replicación/reparación defectuosa o bien inducidos fisicoquímicamente.
2. Mutaciones somáticas (transmisión horizontal) vs germinales
Transmisión vertical).
3. Consecuencias informacionales de la mutación:
1. Mutaciones de Sustitución
1. Silenciosas
2. Pérdida de función
3. Atenuado-incentivado
2. Mutaciones de cambio en el marco abierto de lectura (ORF)
22

Mutación por daño fisicoquímico al ADN
23

Consecuencias informacionales de la mutación
24

Mecanismos de reparación
25

Errores
de copia
26

Escisión de
Nucleótidos
(Ej.: Dimerización de
timinas por luz UV)
27

FORMACIÓN DE DÍMEROS DE TIMINA
28

ELIMINACION DE
DIMEROS
DE TIMINA
29

E i ió d B
Escisión de Base
(Ej: Desaminación por
hidrólisis de la citosina)
30

REPARACIÓN DE ROTURAS EN EL ADN
-Sistemas de completa fidelidad
-Sistemas que provocan errores
31

REPARACIÓN DE ROTURA CON RESTAURACIÓN COMPLETA DE LA SECUENCIA
32

REPARACION DE FRAGMENTOS SIN HOMOLOGIA TERMINAL
33

REPARACIÓN CON INTRODUCCIÓN DE DELECIONES
34

REPARACIÓN CON
INTRODUCCIÓN DE
DELECIONES
35

Replicación vírica:
Retrotranscripción y Replicación
36

I. Biología Molecular del Material
Genético
Tema 3: Transcripción del ADN. Procesamiento y
traducción del ARN.
37

Analogías y diferencias entre replicación y transcripción
Analogías:
1) Pasos generales de Iniciación-Elongación-Terminación con polaridad 5’-3’.
2) Complejos multicomponentes de gran tamaño en la iniciación.
3) Observancia de las reglas de apareamiento de bases Watson-Crick.
Cik
Diferencias:
1) Uso de ribonucleótidos (en lugar de desoxirribonucleótidos) para la síntesis.
2) U reemplaza a T como base complementaria para las A.
3) Síntesis del RNA de novo (sin cebador).
4) Se transcribe sólo una parte discreta del genoma, no el genoma completo.
5) No existe actividad correctora de pruebas en la síntesis del RNA.
38

RNA mensajero
Procariotas
Eucariotas
39

RNA mensajero eucariotico
Exon Exon Exon Exon Exon
Cap 5’ (7-metilguanosina)
40

Estructura del RNA transferente
Reconocimiento
Complejo
Ribosómico
i
Reconocimiento
aminoacil-tRNA
sintetasa
74-95 nts
D: Dihidroxiuridina; ψ: Pseudouridina
41

Estructura del 16s-rRNA
RNA ribosomal
Procariotas
Eucariotas
42

+1
Hebras codificante y molde
Upstream
Downstream
Unidades transcripcionales: Promotor, codificante y terminador
43

Promotor Bacteriano
40-50 pb
Distancia
Conservada:
17 (+/- 1) pb
-35: Frecuencia de
transcripción
(Nº de copias por entrada
complejo RNA Pol)
-10: Fidelidad de
transcripción (copias se
inician siempre en el +1)
Complejo Cerrado
Complejo Abierto
44

Transcripción en Procariotas
Complejo RNAP
45

Transcripción en Procariotas
Complejo cerrado-abierto
Complejo RNAPol abierto
protege desde -40 a +3 (+/-3)
46

Terminador Procariótico
Procesos rho-independiente y rho-dependiente.
A
Distancia
Conservada
(40 pb)
B
A y B: repeticiones invertidas
47

RNAs y RNA polimerasas en eucariotes
48

Complejo de Transcripción en Eucariotas
Complejo eucariótico de transcripción.
49

Elementos en:
-cis: secuencias ADN
(elementos de respuesta)
-trans: proteínas
(factores de transcripción)
50

Síntesis y procesado de hnRNAs
51

Variantes de Splicing
52

Promotores alternativos (GK)
53

I. Biología Molecular del Material
Genético
Tema 4: Control de la Expresión Génica.
54

DONDE SE INICIA Y TERMINA LA TRANSCRIPCION
55

Control de la transcripción en Procariotas
Factores σ
alternativos
Operón lac
56

Factores generales de
transcripción:
•TFIID: 2 subunidades (TBP y
1complejo de 10 TAFs)
•TFIIB: (1 proteína) media la
interacción entre TFIID y la
Polimerasa
•TFIIF: (4 proteínas) estabiliza el
complejo DNA-TBP-TFIIB.
•TFIIE: (4 proteinas) regula TFIIH
y en conjunto promueven la
formación la adición ió del primer
nucleotido del RNA.
•TFIIH: es el complejo de mayor
tamaño (9 subunidades) actividad
helicasa y de reparación de DNA.
Dominio CTD
La RNA polimerasa (12
subunidades) requiere de estos
factores:
•Posicionar correctamente la
enzima
•Para regular su actividad
60

II. Tecnología del DNA recombinante
Tema 5: Enzimas utilizadas en el manejo del ADN.
63

Enzimas comúnmente utilizados en biotecnología
• Nucleasas: mellan, cortan o degradan DNA.
• Ligasas: unen moléculas de DNA.
• Enzimas modificadoras: Añaden o eliminan
grupos (T4PNK, CIAP, Transferasas, etc).
• Polimerasas: sintetizan DNA o RNA, o bien
completan la síntesis de moléculas previas.
65

Nucleasas
• Enzimas que degradan el Ácido nucleico hidrolizando el
enlace fosfodiester que une un nucleótido al siguiente.
Pueden actuar en hebra doble ó hebra sencilla.
• Exonucleasas: actúan sobre los extremos del DNA,
habitualmente de forma no específica de secuencia.
• Endonucleasas: actúan sobre enlaces internos de la
molécula de DNA. También pueden ser específicas de una
secuencia concreta. En este caso, se denominan
endonucleasas de restricción.
66

Nucleasas
• DNAsa I Endonucleasa que hidroliza DNA de hebra doble ó
hebra sencilla mediante corte en pirimidinas (C ó T).
Utilizada para experimentos en donde sólo debe haber RNA
p.ej.: retrotranscripción, ensayos de interacción DNAs-
Proteína (footprinting).
• Nucleasa S1 de Aspergillus oryzae degrada DNA de forma
exonucleolítica, procesiva y no específica de secuencia.
• Ribonucleasa A: Endoribonucleasa que actúa sobre el RNA
Ribonucleasa A: Endoribonucleasa que actúa sobre el RNA
de cadena sencilla degradándolo mediante corte en
pirimidinas (C ó T). Usada para eliminar RNAs de minipreps.
67

Nuclease and Source
Substrates, Activity and Uses
Exonuclease III
(E. coli)
Removes mononucleotides from the 3' termini of duplex DNA. The preferred substrates are DNAs with blunt
or 5' protruding ends. It will also extend nicks in duplex DNA to create single-stranded gaps. In works
inefficiently on DNA with 3' protruding ends, and is inactive on single-stranded DNA.
Used most commonly to prepare a set of nested deletions of the termini of linear DNA fragments.
Mung Bean Nuclease
(Mung bean sprouts)
Nuclease BAL 31
(Alteromonas)
Digests single-stranded DNA to 5'-phosphorylated mono or oligonucleotides. High concentrations of enzyme
will also degrade double-stranded nucleic acids.
Used to remove single-stranded extensions from DNA to produce blunt ends.
Functions as an exonuclease to digest both 5' and 3' ends of double-stranded DNA. It also acts as a singlestranded
endonuclease that cleaves DNA at nicks, gaps and single stranded regions. Does not cleave internally
in duplex DNA.
Used for shortening fragments of DNA at both ends.
Nuclease S1
(Aspergillus)
The substrate depends on the amount of enzyme used. Low concentrations of S1 nuclease digests singlestranded
DNAs or RNAs, while double-stranded nucleic acids (DNA:DNA, DNA:RNA and RNA:RNA) are
degraded by large concentrations of enzyme. Moderate concentrations can be used to digest double-stranded
DNA at nicks or small gaps.
Used commonly to analyze the structure of DNA:RNA hybrids (S1 nuclease mapping), and to remove singlestranded
extensions from DNA to produce blunt ends.
Ribonuclease T1
(Aspergillus)
An endonuclease that cleaves RNA at 3' phosphates of guanine residues, producing oligonucleotides terminal
guanosine 3' phosphates.
Used to remove unannealed regions of RNA from DNA:RNA hybrids.
68

Enzimas de
Restricción
Corte cohesivo
Corte romo
Eco RI
HaeIII
69

Enzimas de Restricción
Vista lateral
Vista Superior
EcoRI con DNA unido
70

Extremo 5’ protuberante
Enzimas de Restricción
Extremo 3’ protuberante
Extremo romo
71

Enzimas de Restricción:
Nomenclatura
Género
Especie
Cepa
Orden
EcoRI
Secuencias de reconocimiento palindrómicas
72

Enzimas de Restricción: Tipos
73

Endonucleasas de Restricción Tipo II
Reconocen una secuencia concreta de nucleótidos: La
secuencia frecuentemente es palindrómica y de una longitud
típica de 6 nucleótidos (variando desde 4 a 20 nucleótidos).
Un mismo enzima puede cortar más de una secuencia
específica: Hinf1 corta en la secuencia GANTC.
Extremos compatibles y actividad estrella.
Caracterizadas centenares de endonucleasas de restricción:
Hay disponible ibl software específico online que permite
determinar las endonucleasas que cortan una secuencia
concreta de ADN.
74

Endonucleasas de Restricción Tipo II
Frecuencia de los cortes: Estadísticamente, la frecuencia de
corte sería una vez cada 4 n nucleótidos (n= número de
nucleótidos en la secuencia reconocida). Esto sería 1/256,
1/1024 y 1/4096 para n= 4, 5 y 6.
Se observa que el número de sitios de corte es menor: fago λ
(49Kb) tiene 6 sitios BgII, 5 sitios BamH1 y solo 2 sitios SalI.
Se demuestra que los nucleótidos no se distribuyen al azar.
Mapas de Restricción: mediante digestión con varias
endonucleasas de restricción se puede caracterizar un ADN.
75

Organización estructural del genoma viral
Bacteriófagos, Animales y Vegetales.
DNA y RNA virus
Cadena doble (dos hebras) o sencilla (una hebra).
Molécula lineal o circular.
76

Análisis de restricción del bacteriófago λ: Construcción
de un mapa de restricción en DNA Lineal
Reproducibilidad de resultados
• Xba1 2 fragmentos (1 corte) 24.0, 24,5 Kb
• Xho1 2 fragmentos (1 corte) 15.0, 33.5 Kb
• Kpn1 3 fragmentos (2 cortes) 1.5, 17.0, 30.0 Kb
• Xba1+Xho1 3 fragmentos (2 cortes) 9.0, 15.0, 24.5 Kb
• Xba1+Kpn1 4 fragmentos (3 cortes) 1.5, 6.0, 17.0, 24.0 Kb
XhoI
XbaI
15 9.0 24.5
XhoI XbaI
KpnI
KpnI
Kb
Restricción
ió
completa
15 9.0 6.0 1.5 17 Kb
77

Construcción de un mapa de restricción en DNA
circular (digestiones completas)
A) Digestiones sencillas
B) Digestiones sencillas
y dobles
78

Análisis de restricción del bacteriófago λ:
Construcción de un mapa de restricción en DNA lineal
Kpn1 en condiciones limitantes (restricción parcial: 0, 1 ó
2 cortes) genera en un ADN lineal 6 fragmentos:
1.5, 17.0, 18.5, 30.0, 31.5 y 48.5 Kb
KpnI
KpnI
2 cortes
1 corte
1corte
1 corte
1 corte
0 cortes
1.5 Kb
17.0 Kb
18.5 Kb
30.0 Kb
31.5 Kb
48.5 Kb
79

Construcción de un mapa de
restricción en DNA circular
(digestión parcial de PstI)
80

DNA Ligasas
• En la célula (eucariota y procariota), tienen como función
corregir las discontinuidades en la hebra de DNA causadas en
el mecanismo de replicación de la hebra retardada del DNA,
por la reparación de errores en la replicación o bien por
agresiones externas al DNA: químicas, físicas, etc.
• Su papel p en la biotecnología es el de catalizar la unión de
fragmentos distintos de DNA, tanto si son romos, como si son
cohesivos. Favorecen la formación del enlace covalente
fosfodiéster entre 3’-OH y 5’-fosfato.
81

Clonaje cohesivo (EcoRI)
82

Acción de las DNA ligasas
Reparación de mella en la replicación
(fragmentos de Okazaki)
83

Acción de las DNA ligasas
Si la Tª de la reacción es mayor
que la Tm de los extremos
cohesivos, no hay ligación: Tª y
tº de reacción habitual: de 16ºC
2ha4ºCO/N.
84

Acción de las DNA ligasas
Electroforesis en gel de
agarosa
85

Fosfatasa alcalina
A) Defosforilación del vector
OH OH
OH OH
OH OH
B) Ligación inserto-vector
OH
OH
OH
OH
OH
OH
Inactivación de CIAP: 75 ºC durante 10 minutos en presencia de 5 mM EDTA
86

T4 Polinucleótido quinasa (DNA y RNA)
Reacción preferente
Reacción minoritaria
Propósito:
Fosforilación de adaptadores.
Marcaje radiactivo de oligonucleótidos.
87

T4 Polinucleótido quinasa (DNA y RNA)
88

Transferasa terminal (mamíferos)
DNA Polimerasa que cataliza la adición de nucleótidos al extremo 3’ de un ADN
(extremo 3’ colgante, romo, en DNA lineal o doble).
Propósito: Facilitar los ensayos de clonación cuando no hay extremos compatibles
89

Adaptadores Sintetizados Químicamente
Ejemplo: Adaptadores XbaI-EcoRI.
EcoRI
EcoRI
Siguiente paso: Ligación en vector previamente linearizado con
EcoRI y defosforilado con Fosfatasa alcalina.
90

RNA Polimerasas de Bacteriófagos (Transcripción in vitro)
1.-Generación de Ribosondas
marcadas radiactivamente.
2.-Expresión dirigida de proteínas
(transcripción-traducción
acopladas in vivo/ in vitro).
Sp6, T7 y T3 RNA Polimerasas
sólo reconocen sus promotores de
origen viral (incorporados al
vector). RNA Polimerasa de E. coli
no reconoce esos promotores.
Nombre de la RNA Polimerasa Hospedador del fago Secuencia del promotor
T7 RNA polimerasa Escherichia coli TAATACGACTCACTATAGGG
T3 RNA polimerasa Escherichia coli AATTAACCCTCACTAAAGGG
SP6 RNA polimerasa Salmonella typhimurium AATTTAGGTGACACTATAGAA
91

Expresión dirigida de
proteínas in vivo (bacteria)
Transcripción-traducción
acopladas in vitro (sistema
libre de células)
92

DNA Polimerasas: Fragmento Klenow
Subtilisina
1.- Síntesis 5’-3’ de DNA de doble hebra a partir de DNA de hebra sencilla:
Generación de sondas marcadas.
93

DNA Polimerasas: Fragmento Klenow
2.- Rellenado de extremos 3’ recesivos para generar extremos romos (síntesis 5’-3’).
3.- deleción de extremos 3’ protuberantes para generar extremos romos (exo 3’-5’).
Alternativa a Klenow: T4 y T7 DNA Polimerasas.
94

DNA Polimerasas
termoestables
Polimerasa
Taq
Pfu
Vent
3'->5'
Exonucleasa
No
Si
Si
Fuente y Propiedades
De Thermus aquaticus. Su vida media a 95 ºC es de
1.6 horas. Mayor tasa de error (10 -4 -10 -5 )
De Pyrococcus furiosus. Tiene la menor tasa de error
de todas las DNA polimerasas termoestables
conocidas. Menor tasa de error (10 -6 ).
De Thermococcus litoralis; También conocida como
Tli polimerasa. Si vida media a 95 ºC es de
aproximadamente 7 horas. Tasa de error intermedia.
95

Retrotranscriptasas (DNA Polimerasa RNA dependiente)
1.-Generación de cDNAs
de doble hebra para
construir genotecas de
expresión.
2.-Generación de cDNAs
de cadenas sencilla con
los que realizar RT-PCR.
96

II. Tecnología del DNA recombinante
Tema 6: Técnicas de análisis de ácidos nucleicos.
97

Propiedad de
soga rígida
(soluciones
viscosas)
Desnaturalización
del dsDNA e hipercromicidad
Desnaturalización
reversible
DNA rico
en G+C
DNA rico
en A+T
Integridad de cada cadena e
hipercromicidad a 260 nm
Desnaturalización por incremento de
temperatura, o por descenso en la
concentración de sal
98

Concepto de Hibridación
99

Hibridación In Situ
Estudio de expresión génica en el desarrollo.
Embrión de pollo, marcado por hibridación in situ con sondas
cRNA para HNF-17
Estudio de cromosomas
100

101

Electroforesis en geles de agarosa
102

TRANSFERENCIA
103

Técnica Southern:
Transferencia e
hibridación
104

Interpretación de
un experimento
de Southern
105

Northern
106

Electroforesis en geles de acrilamida
107

Western: Transferencia
108

109

Western: Resultado
1 2 3 4 5 M
Gel SDS-PAGE
Filtro nitrocelulosa
110

Secuenciación
enzimática
111

Secuenciación enzimática
(con nucleótido radiactivo)
112

Secuenciación Automática
(con cebador marcado con fluorocromo tetrametilrodamina)
113

Secuenciación Automática
(con cuatro fluorocromos diferentes)
114

Cromatograma
115

Reacción en cadena de la Polimerasa
116

Ecuación del
:
+ =
117

Componentes de la PCR:
1. DNA molde.
2. Oligonucleótidos.
3. DNA dep.-DNA polimerasa.
4. Desoxinucleótidos.
118

Diseño de oligonucleótidos
Características principales de los oligonucleótidos usados en PCR:
1. Tamaño entre 15 y 25 nucleótidos.
2. Temperatura de melting entre 50 y 65 ºC
3. Contenido en G+C entre un 40% y un 60%
4. Sin apareamientos internos por autocomplementariedad.
5. Sin apareamientos 5’-3’ entre los oligos de la misma pareja por
complementariedad de secuencia en los extremos.
6. Evitar 3 o más de 3 purinas o pirimidinas seguidas en el extremo
3’ del oligo
7. Cálculo de Tm: 2x(A+T)+4x(G+C) en grados centígrados.
119

RT-PCR
mRNA completo
(variante larga)
Variante de splicing
(variante corta)
M C+ C-
T1 T2 T3 T4
Completo
Variante 1
Variante 2
Detección de variantes de Splicing tejido-específicas
120

II. Tecnología del DNA recombinante
Tema 7: Vectores de clonación.
121

Un experimento de DNA recombinante generalmente
presenta el siguiente esquema:
1.- El DNA de un organismo donador se extrae, se corta con endonucleasas de restricción y
se liga a otro DNA (vector de clonación) para formar una nueva molécula de DNA
recombinado (construcción de DNA).
2.- Esta construcción vector de clonación-DNA insertado se transfiere y mantiene dentro de
una célula hospedadora. La introducción del DNA en la célula hospedadora se denomina
transformación.
3.- Aquellas células que han tomado la construcción de DNA (células transformadas) se
identifican y seleccionan, separándolas de aquellas que no contienen la construcción.
4.- Si es necesario, la construcción de DNA puede manipularse para asegurarnos que la
proteína que es codificada por la secuencia del DNA clonado va a ser producida por la
célula hospedadora.
122

Plásmidos usados en tecnología del ADN recombinante
Propósito: clonación general y construcción de genotecas.
1.- Pequeño tamaño (3-5 Kb).
1. Pequeño tamaño (3 5 Kb).
2.- Elementos indispensables: ori, MCS, marcadores (resistencia/metabólicos) y otros.
3.- Número de copias (control de replicación estricto/relajado).
4.- Transmisibilidad: Conjugación (operón traF) y movilidad (oriT).
5.- Compatibilidad de distintos plásmidos en la misma bacteria.
123

Nomenclatura: p: plásmido. BR: iniciales
de los investigadores que lo crearon (F.
Bolivar y R. Rodríguez). 322 distingue
este plásmido de otros desarrollados en el
mismo laboratorio (pBR325, 327, 328,
etc).
4361 pb; genes de resistencia a
ampicilina (Amp r ) y a tetraciclina (Tet r ).
Único sitio de corte BamHI, HindIII y
SalI dentro del gen Tet r ; Único sitio de
corte Pst I en el gen Amp r ;Únicositiode
corte EcoRI que no está dentro de
ningún DNA codificante.
Origen de replicación pMB1 (similar al
ColE1) que sólo funciona en Escherichia
coli.
Alto número de copias.
No puede ser transferido a otra bacteria
(no conjugable ni movilizable).
MAPA DE RESTRICCION de pBR322
124

SELECCION NEGATIVA DE CLONES EN pBR322
Filtro de
Nitrocelulosa
125

Serie pUC
(Universidad de California)
Selección Blanco/Azul con X-Gal:
α-complementación
126

α-COMPLEMENTACIÓN
Genoma Bacteriano o bien Plásmido F’
p
o
Plásmido pUC
p
RNApol
o
Modificación del Operón lac en plásmido
α
127

SELECCION DE CLONES EN pUC POR α-
COMPLEMENTACIÓN
128

Plásmidos usados en tecnología del ADN recombinante
Fagémido pBluescript
Selección Blanco/
Azul con X-Gal
129

Clonación en
extremos cohesivos
(Eco RI)
130

Clonación en extremos
romos (HaeII)
5’ ACGATGGCCACGAT 3’
3’ TGCTACCGGTGCTA 5’
HaeIII
5’ ACGATGG CCACGAT 3’
3’ TGCTACC GGTGCTA 5’
DNA ligasa
5’ ACGATGGCCACGAT 3’
3’ TGCTACCGGTGCTA 5’
131

Transformación de Bacterias por Plásmidos
132

Transformación de Bacterias por Plásmidos
133

TRANSFORMACION
CON VECTORES DE
EXPRESION
V t d ió
Vectores de expresión
procarióticos (T7) y
eucarióticos (CMV)
134

Vectores pET de
expresión
Además de los elementos
indispensables: ori, MCS,
marcadores (resistencia
/metabólicos), presenta un
promotor de T7 que promueve
la transcripción del inserto, y
secuencias RBS que facilitan
su traducción
135

Producción y purificación de proteína
recombinante en E. coli
Proteína
Genoma bacteriano
modificado
Vector
Proteína
136

Producción de anticuerpos policlonales
137

Transcripción-traducción acopladas in vitro (sistema libre de células)
Producción de proteínas tóxicas para E.coli
138

Vectores para genotecas: Bacteriófago λ y Cósmidos
Vector sin recombinar
Vector recombinante
Stuffer
R: diana de restricción
139

Bacteriófago λ: ciclos
lítico y lisogénico
140

Bacteriófago λ
20 Kb 9 Kb
Stuffer
141

Bacteriófago λ como vector de inserción
142

Bacteriófago λ como vector de reemplazamiento
143

Cósmidos
144

Amplificación del clon via ciclo lítico
145

Vectores de Clonación:
Estudio de genes aislados (Lambda, cos) y construcción de mapas físicos (AC’s)
Vector
Tamaño
máximo
inserto
Nº Aprox. de
clones necesarios
en la genoteca
Ventajas
Desventajas
lambda 20 kb 5 x 10 5 Facilidad para construir
genotecas.
Insertos relativamente
estables.
Facilidad para construir
cósmido 45 kb 2 x 10 5 genotecas.
Facilidad para obtener
DNA de los clones.
YAC 1 Mb 10 4 Requiere pocos clones.
Se requieren menos clones
PAC ~120 kb 10 5 que para los cósmidos.
Estable.
BAC > 500 kb 5 x 10 4 Requiere pocos clones.
Muy estable.
Requiere muchos clones.
Dificultad para obtener
DNA de los clones.
No siempre estable.
Muy propenso al
reordenamiento.
Dificultad para construir.
Origen de replicación en
copia única, por lo que es
difícil obtener DNA.
Origen de replicación en
copia única, por lo que es
difícil obtener DNA.
146

Cromosoma artificial de bacteria (BACs)
Basado en el factor F de E.coli
Selección positiva
Selección negativa
Bajo nº de copias
Resistencia a cloranfenicol
Bajo nº de copias
Origen de Replicación
Replicación direccional
147

Cromosoma artificial derivado del bacteriófago P1 y del
plásmido pUC (PACs)
pMB1
Inserto
sacB: enzima levanosucrasa
de Bacillus, con actividad
tóxica para E.coli
Inserto
148

Cromosoma artificial de levadura (YACs)
149

CEN: secuencia
centromérica
TEL: secuencia
telomérica
Selección
levadura
Selección
bacteria
ori
bacteria
Cromosoma
artificial de
levadura (YACs)
Selección
levadura
Selección
levadura
150

II. Tecnología del DNA recombinante
Tema 8: Estrategias de clonación y
construcción de genotecas
151

Genoteca de
DNA genómico
1er paso:
construcción de una genoteca
representativa.
2do paso:
aislado de clones de nuestro
interés (screening).
Genoteca de
cDNA
3er paso: subclonación de
fragmentos seleccionados.
152

Genotecas de Expresión (cDNA):
Representativas cuando respeta el porcentaje de representación original de
cada mRNA en la célula: ni se pierden los bajamente expresados ni se
sobrerepresentan los muy expresados.
153

Obtención de RNA mensajero
154

Obtención de cDNAss: cebado
155

Genotecas de Expresión (cDNA)
cDNAds
Ligación
Amplificación
Titulación
cDNAds
156

Amplificación del clon via ciclo lítico
157

Genotecas:
Titulación
158

Genotecas de
DNA genómico (λ y Cos):
Representativas cuando poseen un
número de clones entre 3 y 10
veces superior al mínimo (tamaño
genoma/capacidad vector)
Ligación
Amplificación
Titulación
159

Genotecas de DNA genómico (λ y Cos)
Empaquetado preferente de
los recombinantes con
tamaño adecuado
160

161

Genotecas:
Titulación
162

Búsqueda en Genotecas: Screening (resumen)
163

Búsqueda en Genotecas: Screening (I)
164

Búsqueda en Genotecas: Screening (II)
165

Búsqueda en Genotecas: Screening (III)
166

Búsqueda en Genotecas: Screening (IV)
167

Selección de clones positivos
por hibridación
168

Selección de clones positivos
por hibridación
169

Selección en Genotecas de Expresión (cDNA) por anticuerpos
170

Paseo cromosómico (Genotecas de DNA genómico)
171

Paseo cromosómico (Genotecas de DNA genómico)
172

Clonación in silico
173

Bibliografía
Banco de datos
Previamente
descrita
Secuencia
Generada en el
laboratorio
Genotecas,
Productos de
PCR, Segmentos
aislado por ERs
y clonados, etc
Análisis
Algoritmos y filtros
Fiabilidad estadística
Local (software instalado)
Recursos en red (software remoto)
Predicción
Diseño experimental
Contraste predicción-resultados
Aplicabilidad
174

II. Tecnología del DNA recombinante
Tema 9: Mutagénesis y elementos transponibles
175

176

177

178

179

Transposición
Directa (Simple)
• Salta desde un sitio en el
ADN a otro sitio distinto.
• Mecanismo de cortar y
pegar
180

Transposones sencillos
• Secuencias de inserción o elementos IS
• De tamaño < 2,000 bp, E. coli contiene 8 copias de IS1 y 5 copias
de IS2.
Repeticiones
terminales cortas
e invertidas
Gen de la Transposasa, genes reguladores
Repeticiones directas
en el ADN huésped
181

Transposones Compuestos
• Contienen genes en la región central, mas dos módulos del
tipo IS (tanto en la misma orientación como invertidas)
• Los transposones compuestos pueden transportar todo tipo de
secuencias de ADN en su region central
182

Transposones Compuestos
183

Transposones más complejos (Tn)
• Transportan genes que no sólo están implicados
en la transposición (ej. genes de resistencia a
antibióticos)
• Tamaño > 2,000 pb
184

1. Transposición Conservativa
(~corta-y-pega)
El elemento se desplaza de un sitio a otro.
Transposable Element
Target
Excision & Integration
Donor
Recipient
http://www.public.iastate.edu/~jzhang/Transposition.html
185

2. Transposición replicativa
(~copia-y-pega)
El elemento transponible es copiado, de
modo que una copia queda en el lugar de
origen y la otra es desplazada.
Transposable
Element
Replication
Target
Integration
ti
Donor
Recipient
186

Retrotransposones
1. El DNA del elemento móvil es transcrito para
dar RNA.
2. Este RNA se retro-transcribe para dar cDNA,
que se inserta en el nuevo sitio.
Transcription
Target
RNA
Reverse Transcription
cDNA
Integration
Donor
187

188

Los efectos de los elementos transponibles
dependen de su localización final
189

PCR
Modificar los extremos de un DNA
(p. ej. Introduciendo dianas de restricción)
Mutagénesis dirigida
190

191

192

193

194

III. Modificación genética de organismos y
sus aplicaciones biotecnológicas
Tema 10: Aplicaciones medioambientales de los
microorganismos modificados genéticamente
195

Transferencia
de genes en
animales
Cultivo de
Células
Vegetales
Diagnósticos
Fármacos
Anti-cáncer
Solución de
crimenes
Tecnología
del ADN
Bancos de
ADN, ARN
Proteínas
Mapas de
Genomas
completos
Biología
Molecular
Ingeniería Genética
.
Marcadores
Síntesis de
Sondas de
ADN
Síntesis de Nuevas
Clonación
Proteínas
Producción de
Nuevas
Localización
Proteínas humanas
Plantas y
de desórdenes
Animales
genéticos
Nuevos
Alimentos
Nuevos
Antibióticos
Recursos humanos
químicos raros
Terapia
Génica
196

Biotecnología Ambiental
Consiste en el uso de microorganismos vivos para el
tratamiento y control de la contaminación.
Los microorganismos pueden utilizar compuestos
orgánicos e inorgánicos muy diversos como fuente de energía.
Estos compuestos son biodegradados a compuestos más
simples. La biodegradación d ió puede ser aprovechada para
producir diferentes compuestos o productos de utilidad.
Como los compuestos sencillos resultantes de la
biodegradación muchas veces son inocuos o menos tóxicos
que los compuestos que inicialmente se metabolizan, se
pueden emplear estas actividades microbianas en la
biorremediación de la contaminación.
197

Biorremediación
• Procedimiento que se aplica a la recuperación de una zona
terrestre o acuática contaminada, mediante la utilización de
seres vivos (o alguna de sus partes o productos).
• En la Biorremediación in situ en unos casos se
estimula la actividad degradativa de los microorganismos allí
presentes mediante adición de nutrientes (Bioestimulación),
y en otros se aportan microorganismos foráneos -bien
naturales o bien modificados genéticamente- poseedores de
determinadas propiedades útiles para la degradación del
contaminante concreto (Bioincremento).
• En la Biorremediación ex situ, el contaminante es
transportado a plantas de procesamiento donde es
metabolizado por microorganismos degradadores
especializados.
198

199

200

Tipos de técnicas de Biorremediación
-Compostaje: residuos de todo tipo son depositados en
contenedores para ser degradados por microorganismos
-Biorremediación enzimática: se añaden a la zona afectada
enzimas degradativos purificados, o bien ciertas bacterias
modificadas genéticamente capaces de secretar estos enzimas.
-Biorremediación microbiana: se utilizan micro- organismos
que degradan o transforman los compuestos tóxicos en otros de
menor impacto ambiental
-Fitorremediación: se emplean especies vegetales capaces
de eliminar xenobióticos, o compuestos naturales altamente
tóxicos. Así, se han comenzado a investigar plantas y especies
arbóreas específicamente capacitadas para retener metales
pesados.
-Biolixiviación: solubilización de metales valiosos a partir de
matrices complejas que utilizan la acción directa o indirecta de
microorganismos.
201

Fenotipos microbianos aprovechables en
aplicaciones ambientales
-Resistencia R i t i a iones metálicos
Volatilización ió de mercurio
Mineralización de organometálicos
Biosensores para metales
-Bioacumulación de met. pesados
-Surfactantes y emulsificantes
-Biodegración de hidrocarburos
-Biodegradación de compuestos
alquílicos y haloaromáticos
-Biodegradación de heterociclos
Insolubilización de metales tóxicos
Recuperación de metales preciosos
Recuperación de hidrocarburos pesados
Degradación de aceites y disolventes
Mineralización de herbicidas, pesticidas
e insecticidas
Eliminación azufre orgánico de
combustibles fósiles
202

Biodegradación del petróleo
• Es una mezcla muy compleja de compuestos químicos.
• Muchas bacterias y hongos son capaces de metabolizar
componentes del petróleo.
• La dificultades principales estriban en el bajo contenido
de nitógeno y fósforo que presenta el petróleo, y en la
naturaleza tóxica de muchos de sus componentes.
• Se requiere también mucho aporte de oxígeno.
• La biotecnología suele actuar en estos casos
• La biotecnología suele actuar en estos casos
favoreciendo el desarrollo de los microorganismos
degradadores autóctonos mediante suministro de N y P
preferentemente en mezclas oleofílicas.
203

Biodegradación del petróleo
204

Biodegradación del petróleo
205

Biorremediación de vertidos de petróleo
206

MICROORGANISMOS DEGADADORES DE PETRÓLEO
Su cantidad y diversidad depende de la exposición de las aguas a los HC
Velocidad de degradación:
HC saturados> aromáticos ligeros> aromátiocs de alto PM> asfaltenos, resinas
207

CONDICIONES MÁS APROPIADAS PARA LA EFICACIA EN
LA DESCONTAMINACIÓN DE VERTIDOS DE PETRÓLEO
208

Estrategias para la biorremediación del vertido
209

ACCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SOBRE EL
PETRÓLEO
210

FACTORES FUNDAMENTALES PARA LA
DEGRADACIÓN DE PETRÓLEOS
211

Ventajas de la biorremediación de vertidos
de petróleo
• Generalmente provoca pocos cambios físicos en el medio
• Cuando se usa correctamente no produce efectos adversos
significativos
• Puede ser útil para eliminar algunos de los compuestos tóxicos del
petróleo
• Ofrece una solución mas simple y completa que las tecnologías
mecánicas
• Menos costosa que otras tecnologías
212

Desventajas de la biorremediación
de vertidos de petróleo
. En muchos tipos de vertidos su efectividad id d no ha sido evaluada
• Su aplicación en el mar es muy difícil
• Tiempo de actuación necesariamente muy largo
• Su aplicación tiene que ser específica y diferente para cada lugar
contaminado
• Su optimización requiere información sustancial acerca del lugar
p q g
contaminado y las características del vertido
213

PAPEL DE LOS METALES EN PROCESOS BIOLÓGICOS
214

Detoxificación enzimática de metales
pesados por microorganismos
Pb 2+ : Secuestro con fitoquelatinas
Cd 2+ , Me 2+ : Secuestro con metalotioneínas
Co 2+ : Secuestro con otras metaloproteínas
Hg 2+ : Organomercuriales: Rotura del enlace Hg-C y reducción
para producir Hg(0), que es volátil
Ag + : Formación de depósitos insolubles de Ag(0) or Ag 2 S
215

216

Genes de resistencia al mercurio
Hg 2+ : componentes del operón de
resistencia al mercurio en TN501
(merRTPAD)
MerP, MerT: transportador
MerA: reductasa del mercurio
MerR, MerD: regulador de la
expresión
Genes en otros operones:
MerB: liasa de organomercuriales
MerF, MerC: varios transportadores
Cisteínas activas
Ruta del mercurio
217

Estructura de algunos operones mer bacterianos
218

Papel de las fitoquelatinas
Pb2+:
Plomo (ycadmio) pueden ser secuestrados por péptidos ricos en cisteínas: ití
PCn = (γ-Glu-Cys)n-Gly Fitoquelatinas
hPCn = (γ-Glu-Cys)n-β-Ala Homofitoquelatinas
Las fitoquelatinas se encuentran en plantas, hongos y algas.
Son citoplásmicas, y en plantas se encuentran sobre todo en las raíces
219

Modificación genética de plantas para su uso en
fitoremediación
Comparación de plantas silvestres (a y b) con
cuatro líneas transformadas independientes más
resistentes al cadmio (c-f)
La biosíntesis de CISTEÍNA está regulada por
metales tl pesados. Cuando la planta absorbe b metales tl
pesados, éstos desencadenan la biosíntesis de
cisteína, necesaria para la producción de
fitoquelatinas, que se unen a los metales pesados y
los detoxifican.
Se han modificado plantas de Arabidopsis thaliana
para que sinteticen mayor cantidad de cisteína
mediante la sobreexpresión de uno de los genes
implicados en el proceso, lo que aumentaría su
capacidad de destoxificar más cantidad de metales
pesados. El resultado son plantas que toleran, a la
vez, cadmio, arsénico y mercurio.
Al utilizar estos procedimientos, hay que evitar
que las plantas que han acumulado metales
entren en la cadena alimentaria.
220

Detoxificación enzimática de metales
pesados
Cd 2+ , Me 2+ :
Son secuestrados por unas proteínas denominadas metalotioneínas.
La unión de metales a metalotioneínas es un mecanismo general tanto
de bacterias como de eucariotes inferiores, plantas y animales. Esta
unión protege a las células de los efectos que producen los metales
libres (unión a grupos –SH, activación de O 2 ).
Se trata de proteínas muy pequeñas (6000-7000) con un alto contenido
en Cys (alrededor de 20) y capacidad de unión a hasta 7 iones
metálicos.
221

Cluster A
Hsa MT 1A
Hsa MT 4
Ncr MT
Homología de secuencias entre diferentes
metalotioneínas
MDPNCSCATGGSCTCTGSCKCKECKCNSC
MDPRECVCMSGGICMCGDNCKCTTCNCKTC
GDCGCSGASSCNCGSGCSCSNCGSK
Ath MT 1A-like MADSNCGCGS SCKCGDSCSCEKNYNKEC
Cluster B
Hsa MT 1A
Hsa MT 4
DNCSCGS NCSCGSNCNC
KKSCCSCCPMSCAKCAQGCICKGASEKCSCCA
RKSCCPCCPPGCAKCARGCICKGGSDKCSCCP
222

Cluster A en las metalotioneínas de
rata
223

Cluster B en las
metalotioneínas de rata
224

Cambios genéticos en rutas metabólicas
de los microorganismos
A) Evolución natural de rutas biodegradativas:
Las bacterias se caracterizan por sufrir una rápida y contínua evolución, que
sucede tanto por mutaciones como por transferencia de genes entre
estirpes distintas. De ese modo se han podido propagar nuevas rutas
metabólicas que degradan xenobióticos como compuestos clorados o
nitratos.
B) Evolución dirigida de rutas catabólicas:
-Por presión selectiva:
Serealizaenquimiostato, sustituyendo gradualmente la fuente de carbono
natural por el xenobiótico.
-Mediante transferencias genéticas in vivo:
Se trata de expandir rutas metabólicas mediante adición de enzimas nuevos
por transducción, conjugación o transfromación.
-Mediante técnicas de ingeniería genética:
Se introducen genes clonados con sistemas de regulación conocidos para
completar una ruta preexistente o, incluso, para crear una ruta nueva.
225

III. Modificación genética de organismos y
sus aplicaciones biotecnológicas
Tema 11: Ingeniería genética de bacterias para
aplicaciones no-contenidas
226

Ingeniería genética de microorganismos para
aplicaciones no-contenidas
La evaluación de riesgos requiere el desarrollo de sistemas modelo
(microcosmos) que simulen los escenarios donde las cepas
recombinantes se aplicarían, en los que se considerarán los
parámetros:
• Capacidad del microorganismo para implantarse y sobrevivir
• Efecto de las condiciones ambientales sobre la capacidad
degradativa de los microorganismos modificados
I t fi i ló i éti d l i i bi t
• Impacto fisiológico y genético del microorganismo recombinante
sobre el ecosistema nativo: En este aspecto, el parámetro más
importante es la frecuencia de transferencia horizontal de los genes
recombinantes a otros organismos nativos
227

Tres tipos de transferencia horizontal de genes
228

Transposones con marcadores no antibióticos
para aplicaciones no-contenidas
229

230

Biosensores
• Los biosensores son dispositivos analíticos que incluyen un
componente biológico (un enzima, un anticuerpo, una suspensión
de células enteras,etc.) acoplados a sistema transductor que
convierte la señal biológica en una señal eléctrica.
• Su aplicabilidad e interés reside en el hecho de su especificidad y
de su elevada sensibilidad: por ello, los biosensores se utilizan
actualmente de froma muy generalizada para tratar de detectar muy
diversos tipos de contaminantes aunque se presenten en
concentraciones ínfimas.
231

232

233

234

235

236

Nanotecnología
•La nanotecnología consiste en el diseño caracterización,
producción y aplicación de estructuras, dispositivos y sistemas
mediante el control del tamaño y la forma a una escala
nanométrica (10-9μ).
•La nanociencia es el estudio de los fenómenos y la
manipulación de materiales a escala atómica, molecular y
macromolecular, a las que las propiedades difieren
significativamente de éstos a mayor escala (Royal Society, 2004).
237

238

Nanomateriales:
Fullerenos y nanotubos de carbono
•Fullerenos:
–Recuperan su forma tras someterse a alta presión
–No interacción entre ellos
•Nanotubos de carbono:
–Gran resistencia mecánica
–Flexibles alrededor de su eje
–Gran eficacia como conductor
239

Nanomateriales:
Fullerenos y nanotubos de carbono
Una o varias capas de grafito plegadas sobre si mismas
240

241

Nanobiotecnología
•Objetivos:
–Uso herramientas de nanotecnología para resolver
problemas biológicos y biotecnológicos
–Uso de biomoléculas para resolver problemas
nanotecnológicos: ej. combinar biomoléculas con nuevos
nanomateriales
•Multidisciplinar (físicos, químicos, bioquímicos,
biólogos moleculares, ingenieros y médicos).
242

Nanobiotecnología
1. Biosensores y nanoelectrónica.
2. Inmovilización de enzimas en nanoestructuras.
3. Uso de herramientas nanotecnológicas para
estudiar biomoléculas.
4. Nanomedicina.
243

DESARROLLOS ACTUALES Y FUTUROS DE LA
BIONANOTECNOLOGÍA
•Poder celular: Ya existe una nanomáquina sumamente compleja y que opera con
un motor. En ella una proteína actúa como motor giratorio de la célula de una
bacteria, que fue conectada a un “nanopropulsor”, que se alimenta por el ATP
•Plástico vivo: Manufactura de nuevos tipos de plásticos, producidos por
biosíntesis en vez de síntesis química: los nuevos materiales son “cultivados” por
bacterias a partir de fuentes no petroquímicas, revolucionando una importante
industria multinacional.
•Glóbulo olímpico: se está desarrollando un glóbulo rojo artificial capaz de
transportart 236 veces más oxígeno hacia los tjid tejidos que los glóbulos l rojos
naturales. El glóbulo artificial, llamado “respirocito” mide un micrón (1000
nanómetros) de diámetro y cuenta con una nanocomputadora integrada, que puede
ser reprogramada a control remoto mediante señales acústicas externas.
244

245

246

III. Modificación genética de organismos y
sus aplicaciones biotecnológicas
Tema 12: Clonación y expresión de genes en
plantas
247

Ejemplos de genes de interés para clonar en
vegetales
• Gen que codifica una proteína que protege a la
planta porque inactiva determinados pesticidas.
• Gen que codifica una proteína de alto valor
nutricional.
• Gen que codifica proteínas bacterianas que son
tóxicas para insectos.
248

Agallas de corona producidas por
Agrobacterium
249

Agrobacterium
250

El plásmido Ti como vector en la integración de
ADN foráneo en células vegetales
251

252

CONSTRUCCION PARA LA EXPRESION DE UN
TRANSGEN EN PLANTAS
253

ESTRATEGIA PARA LA EXPRESION DE UN
TRANSGEN EN PLANTAS
254

Mapa del plásmido Ti de Agrobacterium
255

Inserción de resistencia a antibióticos
256

257

Selección de tejidos transformados
Se utilizan placas con un medio selectivo –conteniendo un antibiótico o un
herbicida. Las plántulas supervivientes deben contener también el transgen
258

259

260

III. Modificación genética de organismos y
sus aplicaciones biotecnológicas
Tema 13: Transferencia directa de genes en
plantas. Aplicaciones
http://cerezo.pntic.mec.es/~jlacaden/Ptransg3.html
p 261

Técnica biolística
262

Planta de tabaco que expresa el gen de la
luciferasa de luciérnaga
263

Planta de tomate a la que se le han introducido
genes de resistencia a larvas de insectos
264

265

NUMERO DE LIBERACIONES APROBADAS EN USA (2002)
266

267

Principales cultivos transgénicos
•Maíz
Bt
•Algodón
Bt
•Patatas
Bt
•Soja
“Roundup
Ready”
•Maíz
“Roundup
Ready”
•Algodón
“Roundup
Ready”
•Maíz
“Liberty
Link”
•Algodón
BXN
268

Maíz, algodón y patatas Bt
Se ha introducido el gen bt , que codifica una toxina de Bacillus
thuringensis que actúa selectivamente sobre lepidópteros
269

Soja “Roundup
Ready”
Resiste al herbicida “Roundup” que puede aplicarse
en cualquier etapa del crecimiento
Las plantas transgénicas
resistentes a los herbicidas se
venden junto con el herbicida
correspondiente.
Así, las plantas «Roundup
Ready» de Monsanto,
toleran al herbicida
«Roundup» (glifosato),
270

Tomate “Flavr
savr”
Se ha inhibido la producción del enzima poligalacturonasa. Previene
el ablandamiento y permite un mayor contenido de sólidos solubles
Usos:
Ketchup y salsas para pasta
Escaso consumo fresco
271

Area dedicada a cultivos transgénicos
entre 1996 y 2000
táreas
Millones de hec
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1996 1997 1998 1999 2000
272

Las empresas que dominan el cultivo
de los OGMs
Las siguientes 5 compañías, colectivamente
controlan el 75 % de las patentes y el 100%
de los productos agro biotecnológicos.
Los Cinco Gigantes Genéticos:
Pharmacia (Monsanto), DuPont,
Syngenta, Bayer y Dow.
273

Países que han utilizado semillas
transgénicas (uso comercial, año 2000)
Estados Unidos 30’300.000 ha 68%
Argentina 10’000.000 ha 23%
Canadá 3’000.000 ha 7%
China 500.000 ha 1%
Australia 200.000 ha

Peligros inherentes a la técnica
• 1. El no entender las interconexiones de la red
genética.
Ningún gen actúa aisladamente. La transferencia de un gen
en otro genoma conlleva siempre efectos colaterales.
Las plantas transgénicas tienen mayor potencial de
provocar alergias.
Se pueden crear nuevas toxinas.
El proceso de la ingeniería genética incrementa el nivel de
la inestabilidad genética en el organismo resultante.
275

Peligros inherentes a la técnica
• 2. La transferencia horizontal de genes y la
recombinación
El hecho de que cada vez existan más bacterias patógenas
resistentes a antibióticos se debe a la eficiencia de la
transferencia horizontal.
Antibióticos más usados: Penicilina G, Calgene,
Estreptomicina, Espectoninomicina.
276

Peligros inherentes a la técnica
• 3. El escaso conocimiento de la variabilidad
del genoma
El genoma está cambiando continuamente.
Secuencias de ADN se desplazan, amplifican,
invierten, intercambian creando fluidez tanto a
escala evolutiva como en el desarrollo. En el
ambiente se puede inducir cambios en el ADN.
277

Impactos y riesgos ecológicos
a. Riesgos en la preservación de la biodiversidad
(silvestre y agrícola)
• Afectan la perviviencia de organismos beneficiosos.
• Por efecto cascada, afectan a otros organismos de la
cadena trófica
• Los cultivos tradicionales pueden entrar en desuso y
conducir a erosión genética.
• Algunas variedades tradicionales pueden convertirse en
super malezas.
278

Impactos y riesgos ecológicos
b. Contaminación genética
• Contaminación global, maíz StarLink: Caso más
importante de contaminación genética de un OGM
no autorizado para consumo humano
• Contaminación en México entre un 3 y un 10 %
sobre los maíces criollos. (Chapela. Universidad de
Berkley)
279

Impactos y riesgos ecológicos
c. Resistencia i aplaguicidas id y herbicidas
id
• Los cultivos Bt crean resistencia en insectos
a las toxinas Bt.
• Super malezas: Departamento de USA de
agricultura reconoce el problema.
d. Impacto en especies no objetivo
• Mariposas Monarca.
• Micro y macro organismos benéficos del
suelo.
280

La evolución de una capacidad mejorada de
convertirse en maleza depende de:
-si los híbridos pueden reproducirse en la naturaleza
-si se puede producir hibridación
-si uno o varios alelos de la planta doméstica confieren
ventaja selectiva a la mala hierba.
La mejor manera de comprobar si se produce hibridación
espontánea es crear parcelas experimentales de cosecha
y de plantas silvestre en condiciones que simulen las de
los campos de cultivo reales y sus áreas marginales. El
flujo génico se puede medir rastreando en la progenie de
la silvestre marcadores de la doméstica.
281

EL MAIZ StarLink
Es uno de varios tipos de maíz Bt que han sido genéticamente modificados para
producir un insecticida dentro de la misma planta, de modo que se puedan reducir o
eliminar las aplicaciones externas de plaguicidas. Mientras que otros maíces Bt que
estaban en el mercado producían una toxina Bt llamada Cry1A(b), StarLink tiene
Cry9C, una versión ligeramente distinta de la proteína.
Como no se resolvió la cuestión de la
alergenicidad de Cry9C, se otorgó elpermiso
oficial para producir el cultivo siempre que no
fuera usado para consumo humano. Es decir,
se concedió una autorización “dividida”
Problemas con este tipo de autorización
Se encontraron fragmentos de la proteína Cry9C
en las mezclas para tacos de maíz de dos grandes
cadenas de comida mexicana, en una ciudad de
los EEUU .
282

MARIPOSAS MONARCA
283

MIGRACIÓN DE LAS MARIPOSAS MONARCA
284

TECNOLOGÍA “TERMINATOR” QUE IMPIDE REUTILIZAR
SEMILLAS SI SE UTILIZA UN INDUCTOR
285

SI NO SE AÑADE INDUCTOR LAS SEMILLAS PUEDEN
GERMINAR NORMALMENTE
286

Riesgos e impactos en la salud
humana
•Desarrollo de efectos tóxicos o
alergias
•Aceleración del fenómeno de
resistencia a antibióticos
Bacterias resistentes, por medio de
transferencia horizontal
•Pueden potenciar la
multiplicación i ió y generación de
nuevos organismos patógenos
287

ENSAYOS DE PLANTAS TRANSGENICAS
GESTION DE RIESGOS
INFORMACION GENERAL
MATERIAL, LUGAR, ENSAYO
1. MATERIAL IMPORTADO
STATUS REGULATORIO EN PAIS DE ORIGEN.
2. PROPOSITO DE LA LIBERACION
OBJETIVOS EXPERIMENTALES.
CRONOGRAMA.
PROTOCOLOS.
ANTECEDENTES.
288

INFORMACION GENERAL (Cont.)
3. OPERACIONES DE TRANSPORTE
VIA DE ENTRADA AL PAIS.
TRANSPORTES INTERNOS.
4. CANTIDAD Y TIPO DE MATERIAL A LIBERAR
5. LUGAR DE LA LIBERACION
UBICACION EXACTA.
CARACTERISTICAS EDAFOLOGICAS,
TOPOGRAFICAS, ...
6. DETALLES PARA AUDITAR LA LIBERACION
FECHAS
FECHAS.
INSTITUCIONES.
PERSONAS.
289

INFORMACION GENERAL (Cont.)
EL ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO
DESCRIPCION: CONCISA, BREVE, CONSISTENTE.
1. GENES PRINCIPALES
PROCEDENCIA (organismo).
CARACTERISTICAS QUE INTRODUCEN.
2. GENES AUXILIARES
PROCEDENCIA (organismo).
MARCADORES DE SELECCIÓN.
3. SECUENCIAS REGULATORIAS
PROMOTORES, TERMINADORES, ENHANCERS, ETC
4. OTROS ELEMENTOS GENETICOS INTRODUCIDOS.
290

INFORMACION REQUERIDA SOBRE
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
INCLUYEN LAS MEDIDAS PARA CONTENCION DEL
OGM EN TODAS LAS ETAPAS:
MOVIMIENTOS DE MATERIALES.
DESTINO DE LOS MATERIALES.
DISPERSION FINAL.
PROCEDIMIENTOS ANTE EVENTUAL ESCAPE.
291

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
DURANTE LA LIBERACION
1. UBICACION Y DESCRIPCION DEL LUGAR O
INSTALACION.
2. LOCALIZACION PRECISA
MAPAS DETALLADOS, LIMITES DE LA FINCA.
DISTANCIAS A CAMINOS Y LUGARES
TRANSITADOS.
3. CARACTERISTICAS
CONSTRUCTIVAS DE BIOSEGURIDAD.
NORMAS DE ACCESO.
4. PARCELAS
TAMAÑO Y NUMERO, DISEÑO.
PLANO DE SIEMBRA, SUPERFICIE.
292

INFORMACION COMPLEMENTARIA
EL ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO
1. INSTITUCION Y PERSONA QUE DESARROLLO O
PROPORCIONO EL OGM.
2. CARACTERISTICAS DEL OGM.
DIFERENCIAS FENOTIPICAS CON RESPECTO AL
NO-OGM. OGM
POLINIZACION CRUZADA CON:
PLANTAS DE LA MISMA ESPECIE.
PARIENTES AUTOCTONOS.
MECANISMOS DE DISEMINACION
PROPAGACION.
SUPERVIVENCIA.
LATENCIA.
293

POTENCIAL DE CONVERTIRSE EN MALEZA.
MALEZAS SEXUALMENTE COMPATIBLES.
EXISTENTES EN LA ZONA.
INTERACCIONES CON ORGANISMOS NO
VEGETALES, EN ECOSISTEMAS EN QUE SE
CULTIVA (INSECTOS, MAMIFEROS, ...).
TEJIDOS DE LA PLANTA ENQUESEESPERALA
EXPRESION DE LA CARACTERISTICA
INCORPORADA POR EL TRANSGEN.
PATRON DE HERENCIA DE LA CARACTERISTICA
INCORPORADA.
294

EFECTOS TOXICOS O PERJUDICIALES DEBIDOS A
LA CARACTERISTICA INTRODUCIDA (SALUD
HUMANA, ANIMAL, AMBIENTE).
SUSTENTABILIDAD: EFECTOS POTENCIALES EN
EL LARGO PLAZO, DERIVADOS DEL USO
EXTENSIVO (CULTIVO, PROCESAMIENTO,
O
CONSUMO).
295

III. Modificación genética de organismos y
sus aplicaciones biotecnológicas
Tema 14: Clonación y expresión de genes en
animales
296

Ratón al que se le ha introducido el gen
de la hormona del crecimiento humana
297

Introducción de copias funcionales de
un gen
Corrección
Génica
Expresión estable y regulada
apropiadamente
Recombinación homóloga
Vector + gen normal
Gen mutado
Genoma normal
Adición
Génica
+
Integración al azar
Expresión estable pero dependiente del
sitio de integración
Episoma
Expresión regulada pero no
estable
298

299

Peces
transgénicos
300

301

302

VISUALIZACIÓN AL MICROSCOPIO DE UNA
MICROINYECCIÓN
303

304

305

306

307

308

III. Modificación ió genética de organismos y
sus aplicaciones biotecnológicas
Tema 15: Inserción de genes exógenos en células
animales mediante recombinación homóloga.
Aplicaciones de las células troncales.
309

310

311

312

Oocitos maduros
313

Fecundación
• Cigoto humano con dos
pronúcleos (aún con la
cubierta pelúcida).
•Alas26hselcigotose
dividirá en 2 células
314

Fase Temprana de la
Embriogénesis
• Embrión humano de 4
células (38hs) totipotentes
• Blastómero
315

Fase Temprana de la Embriogénesis
• Mórula (masa
compacta de células)
C i d 12 16
• Contiene de 12 a 16
Blastómeros entre el
3° y 4° día
316

Fase Temprana de la
Embriogénesis
• La Implantación se da entre
la 1° y la 2° semana.
m.c.i.
• La gran cavidad contiene la
masa celular interna (m.c.i.)
que entre el día 15° y 18°
dará lugar a las 3 capas
germinales: Ectodermo,
Mesodermo y Endodermo,
d
constituyéndose la Gástrula
317

318

319

Inyección de células ES en el interior de
la masa del Blastocisto
320

Manipulación de células madre embrionarias
321

Offspring of 1st generation injected blastocyst
Black mouse -
no apparent ES cell
contribution
Chimeric i founder -
strong ES cell
contribution
Chimeric founder -
Chimeric founder
weaker ES cell
contribution
322

323

324

325

Utilización del gen que produce la proteina
verde fluorescente en mamíferos
326

327

Estudio de la actividad de un promotor con el
gen de la proteína verde fluorescente (GFP)
328

¿Qué son las células troncales
embrionarias (o células madre)?
• Son un grupo celular que se distingue por 3
características:
– Pueden dividirse dando nuevas copias de sí
mismas…
– Pueden diferenciarse en otros tipos celulares…
– Pueden acabar colonizando y originando nuevos
tejidos…
329

Algunas abreviaturas utilizadas…
• Células ES: Embryonic Stem cells (células
madre de origen embrionario)
• Células AS: Adult Stem cells (células
madre procedentes de tejido adulto)
• Células HS: Hematopoyetic Stem cells
(células madre procedentes de la médula
ósea)
330

Células Madre
Embrionarias (ES)
Día 0
Fecundación
Día 3
Trompas
Día 7
Previo a Implantación
m.c.i.
Embrión
Trofoblasto
Zigoto
Mórula
Blastocisto
Placenta
(óvulo fecundado)
Única
Célula
Totipotente
(varios Blastómeros)
Masa
Celular
Totipotente
(masa celular interna)
Masa
Celular
Pluripotente
Son Células
Madre
Embrionarias
in vitro
331

Células madre pluripotentes
332

Diferenciación de células HS
333

Función de las células…
• AS (células troncales adultas):
– Presentes en muchos tejidos adultos…
– Implicadas en regeneración de tejido dañado…
– Tienen gran plasticidad (capacidad de producir
tejidos de distinto linaje), pero…
– No son totipotentes, sino MULTIPOTENTES…
334

Función de las células…
• ES (Embionarias troncales):
– Células pluripotenciales procedentes de la Masa Celular
Interna de la blástula. Formará el embrión…
– Capacidad de diferenciarse a prácticamente cualquier tipo
de tejido…
– No pueden dar lugar, por sí solas, a un feto viable. Se
necesitan los tejidos extraembrionarios para el proceso de
gestación…
– En la práctica, se obtienen de embriones sobrantes de
clínicas de FIV y con más de 5 años de congelación…
335

Otros tipos de células madre…
• Células madre fetales, menos pluripotentes
que las células ES…
• Células de cordón umbilical, tras el
nacimiento…
• Células germinales embrionarias,
procedentes de la línea de producción de
espermatozoides y óvulos…
336

337

338

339

340

341

CONFIRMACION DE LA CLONACIÓN DE ANIMALES POR ANALISIS DE
POLIMORFISMOS EN EL ADN, MEDIANTE HIBRIDACIÓN MOLECULAR
En la secuencia de ADN existen polimorfismos que permiten distinguir de manera
inequívoca cada individuo en una población, e identificar clones
342

La reprogramación no es exactamente equivalente
a la fertilización
343

344

Clonación
terapéutica
345

Células Madre
Ingeniería de Tejidos y Órganos
Pretende lograr estructuras
tridimensionales organizadas :
• Reconstrucción de la vejiga.
• Arterias funcionales artificiales.
• Prótesis óseas biológicas.
• Células encapsuladas que liberan
sustancias terapéuticas.
346

EXPERIMENTACIÓN BASADA EN LA
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA
- Obtención de animales clónicos
- Obtención de animales knock-out
347

¿Cuál es la diferencia entre un animal
trasgénico y un knockout?
Transgénico
Knockout
Se añade DNA foráneo al
genoma
El DNA foráneo elimina o anula un
gen en el genoma
348

Balboa ha entrenado a un nuevo campeón.
Rocky VII:
KnockOut
Mouse
Próximo estreno en las
Próximo estreno en las
mejores salas.
349

Problemas de la recombinación homóloga
La recombinación no-homóloga
al azar es muy frecuente.
Este método no tiene mecanismo de selección
Solución: vectores de reemplazamiento
La construcción knock-out k contiene: 1) gen Neo R;
2) dos segmentos del gen diana; 3) el gen tk
La secuencia a intercambiar está interrumpida por
un gen de resistencia a neomicina
Las células ES se seleccionan por la integración de NeoR y
la no integración de tk* (NeoR+/ tk-) con gancyclovir
350

Vectores de reemplazamiento para generación de animales
knock-out
Resistencia a
Neomicina
Timidina
kinasa
Plásmido de
reemplazamiento
linearizado
Recombinación
homóloga
Integración al azar
Neo R
Neo R+ / tk - Neo R+ / tk +
tk convierte a gancyclovir en un tóxico que
mata a las células tk+
351

ANALOGIA ESTRUCTURAL ENTRE
ADENOSINA Y GANCICLOVIR
2’-Desoxiguanosina monofosfato
Ganciclovir:
Es reconocido como sustrato por la timidina kinasa
(enzima propia del virus del herpes), y es fosfoforilado
para producir ganciclovir-trifosfato.
El ganciclovir il i trifosfato f es un inhibidor competitivo ii
de la DNA polimerasa
352

Manipulación de células madre embrionarias
353

354

Problemas en la interpretación de experimentos con
animales knock-out
1 ) El Knockout mata al embrión temprano. No podemos deducir el
posible efecto que produciría en adultos
2) No se observa fenotipo. ¿Se trata de un gen redundante?
3) Fenotipo variable
4) Posible acción combinatoria de los genes –el modelo pinball.
.
Los Knock-outs por sí mismos no tienen por qué
decirnos lo que el gen hace en cada uno de los órganos
355

RIESGOS DE LA UTILIZACION DE ANIMALES
MODIFICADOS GENÉTICAMENTE
Para la salud del consumidor:
-Aparición de alergias a las proteínas producto de la modificación génica
Tras bastantes años del uso de las toxina de Bacillus thuringensis, en la
"agricultura biológica“, no se ha descrito un solo caso de alergia a ellas.
-Genes de resistencia a antibióticos
El grave problema de las resistencias a antibióticos se debe a la presión de
selección inducida por un uso incorrecto de los antibióticos en medicina humana
oanimal.
En muchos casos, los productos que se consumen no son los propios vegetales o
animales modificados, sino materiales elaborados, tales como la glucosa obtenida
del almidón del maíz o el aceite en el caso de la soja, materiales en los que no hay
ni DNA ni proteínas.
356

RIESGOS DE LA UTILIZACION DE ANIMALES
MODIFICADOS GENÉTICAMENTE
Efectos sobre el medio ambiente.
Los animales transgénicos pueden producir riesgos ecológicos reales, como
ocurre en el caso de los peces gigantes o de crecimiento acelerado, que exigen un estudio
detallado antes de su autorización
Riesgos agronómicos y socioeconómicos.
En el caso de la utilización de transgénicos con proteínas insecticidas, es posible
la aparición de fenómenos de resistencia en insectos diana, lo mismo que ha sucedido en el
caso de la utilización de insecticidas químicos. La gestión de este problema exige el
mantenimiento de áreas sembradas con plantas no transgénicas, para disminuir la presión
de selección y retardar la aparición de poblaciones resistentes.
Como es lógico, las semillas transgénicas son más caras que las tradicionales, y
además las empresas productoras intentan t evitar la práctica áti tradicional i de "autosuministro"
i t "
de semillas para años sucesivos. Aún así, los cultivos transgénicos son suficientemente más
rentables para que compensen el mayor gasto en la semilla. En el caso del algodón, el mejor
evaluado, el incremento de productividad se reparte casi por igual entre la empresa
biotecnológica y el agricultor, sin que se traslade prácticamente nada a los compradores, y
menos aún al consumidor
357

Clonación Reproductiva
Clonación verdadera
Transferencia del núcleo de una
célula adulta a un óvulo enucleado
Blastómero
Partición
Clones
Embrionales
Cultivo
in vitro
Clones
Adultos
Núcleo haploide
Paraclonación
Blastómero
Óvulo
enucleado
Clon
Nuevo
Blástómero
Clonado
Clones
Embrionales
Cultivo
in vitro
Clones
Adultos
358