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Animales transgénicos<br />
155<br />
<strong>PRODUCCION</strong> <strong>DE</strong> <strong>ANIMALES</strong> <strong>TRANSGENICOS</strong><br />
G. Brem, U. Berg & H.D. Reichenbach<br />
Introducción<br />
En genética molecular moderna se desarrollaron métodos adecuados que permiten trabajar específicay<br />
repetidamente con ADN, como portador de la información genética. Esas técnicas de genética<br />
molecular abren en la producción animal nuevas perspectivas, dado que es posible por primera vez<br />
trabajar directamente a nivel génico, ello significa la posibilidad de aislar, secuenciar, recombinar y<br />
transferir genes individuales. El espectro de aplicaciones de esas técnicas no está desarrollado<br />
ampliamente. Sin embargo es posible pronosticar que el futuro de la producción animal será afectado<br />
directamente y que los métodos de la producción animal convencional serán complementados y<br />
posiblemente también parcialmente reemplazados (ver capítulo XIX).<br />
Transferencia de genes significa transferencia e integración del ADN recombinado in vitro y su<br />
estructura acoplada al genoma del receptor. Si la estructura de ADN se integra en el genoma del<br />
receptor, éste se denomina transgénico. El producto de ese transgen, una proteína codificada por el<br />
ADN transferido, es el producto transgénico. Con la ayuda de la transferencia de genes se pretende<br />
lograr que una determinada cualidad en el organismo receptor sea modificada o una nueva sea<br />
incorporada. Además se espera que el transgen integrado en el genoma sea transmitido a la herencia a<br />
fin de establecer una línea transgénica.<br />
En la extensa definición original sólo se habla de animales transgénicos cuando se comprueba que el<br />
transgen se hereda en forma estable y se exprime. Pero en la actualidad se ha establecido en el<br />
lenguaje cotidiano emplear el término: animal transgénico a partir del momento en el cual se puede<br />
comprobar la presencia del nuevo gen en un individuo, al cual se ha practicado la transferencia génica.<br />
Por otra parte en producción animal la transferencia de genes es sólo interesante cuando la estructura<br />
génica es transmitida a la descendencia, de forma tal de establecer líneas transgénicas en la población.<br />
El ADN recombinado en las estructuras génicas puede tener origen en los más variados organismos<br />
donantes, debido a la uniformidad en la estructura básica de la doble cadena de ADN. Junto con el ADN<br />
procariótico de origen viral o bacteriano el ADN de los organismos eucarióticos representa una fuente<br />
inagotable para la transferencia génica.<br />
No debe olvidarse, sin embargo, que especialmente para la expresión de transgénicos pueden<br />
establecerse fuertes interacciones dependientes del origen y del receptor del ADN. Fue observado, por<br />
ejemplo, que la expresión de las estructuras génicas que contienen aún componentes procarióticos,<br />
puede ser reducida o incluso suprimida en animales mamíferos. Además se ha observado que es de<br />
gran importancia para la expresión si los componentes estructurales del gen son de origen genómico o<br />
provienen del ADNc. De esa forma puede observarse que de los trangenes que contienen intrones se<br />
produce en promedio 10-100 veces más ARNm que de transgenes que contienen solamente ADNc<br />
(BRINSTER y col., 1988).<br />
A continuación se hará referencia exclusivamente a la producción de bovinos y otros animales<br />
transgénicos de interés productivo y no a la transformación genética de células procarióticas o<br />
eucarióticas. Con la producción de un organismo transgénico se pretende que el transgen esté presente<br />
en todas las células somáticas y sobre todo también en las células reproductivas del animal. Dado que<br />
no existe hasta el momento método alguno que permita transformar en forma completa un organismo ya<br />
formado genéticamente, se practica la transferencia génica tan temprano en el desarrollo del animal<br />
como es posible. El momento más apropiado es el estado embrionario temprano, es decir el estadio<br />
unicelular (ovocito fecundado = cigoto), con poco número de células (blastómeros) o en los estadios de<br />
mórula o blastocisto como máximo. Ello significa que los métodos de obtención, manipulación y<br />
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transferencia de esos estadios tempranos deben estar establecidos y disponibles en las especies<br />
mamíferas.<br />
Se disponen en la actualidad de varios métodos prometedores de transferencia génica. Los tres más<br />
importantes son:<br />
- La microinyección de ADN en el pronúcleo del cigoto<br />
- La transferencia de ADN a través de vectores retrovirales<br />
- Producción de quimeras transgénicas a partir de células y embriones transformadas genéticamente.<br />
La técnica más empleada en la actualidad es sin dudas la microinyección de ADN. a pesar de que las<br />
otras dos cuentan, junto a algunas limitaciones, con una serie de ventajas no despreciables.<br />
Lamentablemente la técnica que emplea células embrionales primordiales no fue desarrollada aún y la<br />
aplicación de vectores retrovirales lo es en forma muy incompleta como para ser utilizadas en los<br />
animales domésticos.<br />
El camino más próximo para la transferencia de ADN en el núcleo celular es la microinyección directa<br />
de una solución de ADN en el citoplasma del núcleo o en el pronúcleo (foto 1). GORDON y col. (1980)<br />
indicaron por primera vez que la microinyección de una solución de ADN en el pronúcleo es un camino<br />
practicable para la transferencia génica en mamíferos. Después de la microinyección de ADN clonado<br />
en el pronúcleo de ovocitos fertilizados de ratón fue posible encontrar esas secuencias virales en partes<br />
desarrolladas de los fetos. Poco tiempo después se indicó, en otros trabajos, que genes eucarióticos<br />
intactos podían incorporarse a los fetos. Fue posible establecer también la presencia del transgen en<br />
animales adultos como así también la transmisión a la descendencia.<br />
En la actualidad la técnica de producción de ratones transgénicos fue introducida con éxito en muchos<br />
laboratorios y se pusieron en práctica estudios para determinar la regulación de la expresión génica y el<br />
efecto biológico del gen. Como ya fue mencionado, la microinyección de ADN en el pronúcleo de<br />
cigotos o en los núcleos de embriones bicelulares es el método de elección para la transferencia génica<br />
en los animales domésticos. La amplia experiencia obtenida en experimentos con ratones constituyó sin<br />
duda una base adecuada para el desarrollo de la técnica en los animales de interés zootécnico. Debe<br />
aclararse, sin embargo, que debido al desigual desarrollo embrionario temprano y especialmente a la<br />
diferente morfología de los embriones de animales domésticos se produjeron algunos problemas. Por<br />
ejemplo, las estructuras nucleares de las especies bovina, porcina y hasta cierto grado de la ovina y<br />
caprina no pueden ser observadas con el microscopio o sólo con dificultad debido a los gránulos<br />
citoplasmáticos oscuros. Para la observación del núcleo los embriones ovinos requieren un microscopio<br />
de interferencia según NOMARSKI, los embriones bovinos y porcinos deben ser centrifugados para<br />
exponer el núcleo. Tampoco se contaba con suficientes conocimientos prácticos sobre como se debía<br />
establecer el tiempo óptimo para la obtención, microinyección y transferencia de los embriones para<br />
contar con las mejores posibilidades en el éxito de la transferencia génica.<br />
La producción de mamíferos transgénicos puede dividirse básicamente en 6 fases:<br />
1. Clonado de las estructuras génicas y producción de la solución inyectable de ADN.<br />
2. Preparación de los animales donantes y obtención de los ovocitos o embriones.<br />
3. Exposición de los pronúcleos y microinyección del ADN.<br />
4. Transferencia de los embriones inyectados al oviducto o, después de un cultivo temporal, al útero<br />
de receptoras.<br />
5. Comprobación de la integración en los animales nacidos y, si es posible, primeras evaluaciones de<br />
la expresión del transgen en los niveles de trascripción (ARN) y translación (proteína).<br />
6. Producción de descendencia transgénica por medio de métodos convencionales y evaluación de<br />
eventuales mutaciones presentes a través de la formación de líneas homocigotas (test de<br />
homocigosis).<br />
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Hasta el momento se sabe que, en principio, toda molécula de ADN puede microinyectarse en el<br />
genoma de un mamífero. El largo del fragmento de ADN a introducir por medio de los vectores de<br />
clonado no debe superar el límite máximo de 50 kb (clones cosmidios). En otros numerosos<br />
experimentos de transferencia génica se demostró que es posible alcanzar fragmentos mucho más<br />
largos. De esta forma no es raro observar, en animales transgénicos, fragmentos de varios 100 kb o<br />
aún más de 1 000 kb de largo, como consecuencia de la concatemerización de los fragmentos<br />
inyectados.<br />
Evidentemente la inyección de ADN lineal conduce a tasas superiores de integración. En cambio<br />
moléculas con forma de espiral o "supercoiled" parecen integrarse con una frecuencia<br />
significativamente menor (BRINSTER y col., 1985). También es mejor cuando los fragmentos de ADN<br />
no son cortados romos ("blunt") sino cuando conservan terminales sobresalientes.<br />
Las soluciones de ADN para microinyección deben estar absolutamente libre de partículas<br />
contaminantes, para evitar el taponado de la pipeta de microinyección o la lesión de los cigotos<br />
inyectados. Ello establece que todas las soluciones deben ser filtradas (filtros de 0,2 µm) y que todos<br />
los recipientes, con los cuales el ADN toma contacto deben ser enjuagados previamente con agua<br />
filtrada. Sólo en casos aislados se inyecta la totalidad del vector, dado que ADN procariótico puede<br />
provocar problemas de expresión. Después de la restricción el vector y el ADN de inserción son<br />
separados, en la regla, por medio de electroforesis. El fragmento deseado es aislado del gel, lavado y<br />
colocado en una solución buffer. Inmediatamente después se establece la concentración de ADN de tal<br />
manera que por cada pl (10 -12 ) estén contenidos, según la aplicación, varios cientos de copias de la<br />
estructura génica. En fragmentos de ADN un largo de 5-8 kb corresponde a una concentración de 1-2<br />
µg de ADN/ml. No fue encontrada una correlación entre cantidad del ADN inyectado y el número de<br />
copias integradas. La solución preparada de ADN se fracciona y conserva por medio de congelación<br />
(BRENIG, 1987).<br />
La frecuencia de integración en la producción de mamíferos transgénicos es influenciada por: la pureza,<br />
la forma, el tipo de terminales, la concentración y la solución buffer del ADN. De ello se concluye que ya<br />
durante la preparación de la solución de inyección del gen, se establecen importantes condiciones para<br />
el éxito de la transferencia génica.<br />
Recolección de los embriones<br />
Los animales donantes son tratados con gonadotrofinas, con diferentes programas de superovulación<br />
según la especie, inseminados o servidos dos veces. La obtención de los cigotos se lleva a cabo a<br />
través del lavaje del oviducto en un lapso de 12-24h después de la inseminación. El lavaje de oviducto<br />
puede llevarse a cabo mediante cirugía con el animal en narcosis o después del sacrificio. Debe tenerse<br />
especial cuidado, que el oviducto sea seccionado del cuerpo del animal dentro de los 15 min de<br />
desangrado. Los oviductos son lavados con una solución de PBS. Con ayuda de una lupa<br />
estereoscópica se aíslan los ovocitos o embriones de la solución obtenida del lavaje y se colocan en<br />
medio fresco. Las células del cumulus, que eventualmente pudiesen quedar adheridas, pueden<br />
eliminarse con un tratamiento de hialuronidasa o por medio de pipeteo. Los embriones son cultivados in<br />
vitro hasta el momento de la inyección.<br />
La eficacia de los programas de transferencia génica con animales domésticos es, en promedio,<br />
claramente menor que con el ratón. Como se puede observar en la tabla 1 ello se debe al bajo número<br />
de cigotos que pueden inyectarse por donante, a las bajas tasas de preñez y sobrevivencia embrionaria<br />
y a la menor frecuencia de integración. Para la producción de un animal transgénico se deben emplear,<br />
en general, más donantes y receptoras de animales de interés zootécnico que con ratones o conejos.<br />
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Brem & col.<br />
Microinyección de ADN<br />
Para la microinyección es necesario contar con una mesa de trabajo estable. El lugar de trabajo<br />
comprende un microscopio invertido, dos micromanipuladores para las pipetas de sostén y de<br />
inyección y un aparato de inyección. La presión de inyección puede ser regulada con ayuda del aparato<br />
de inyección accionado por medio de un pedal. Sobre la platina del microscopio se encuentra una<br />
cámara de inyección que contiene el medio y los embriones a tratar. Los embriones bovinos y porcinos<br />
son centrifugados 3 min a 15 000 g (WALL y col., 1985). A través de la centrifugación se desplazan los<br />
gránulos citoplasmáticos oscuros hacia un polo, los núcleos y pronúcleos se hacen visibles en el medio<br />
del embrión.<br />
Tabla 1: tasas de éxito en programas de transferencia génica en diferentes animales de<br />
experimentación e interés productivo<br />
Especie murina leporina porcina ovina bovina<br />
Embriones inyectados por<br />
donante (S) 15 20 20 4 7<br />
Número de receptoras por<br />
cada donante (E) 2 2 2 1,5 1<br />
% Preñez 60 50 50 40 30<br />
% Animales nacidos/<br />
embriones inyectados 10-20 10 5-8 15 10<br />
% de integración (animales<br />
transgénicos/ animales<br />
nacidos) 15 10 10-15 5-10 5-10<br />
% Animales<br />
transgénicos/embriones<br />
inyecta-dos y transferidos 2 1 0,5 0,5-1 0,5<br />
Número de animales<br />
necesarios (S+E) por<br />
c/animal transgénico 10 15 20 40 40<br />
A pesar de ese tratamiento la inyección de esos embriones es más difícil que la de embriones de ratón<br />
o conejo.<br />
Para la inyección se fija el embrión mediante vacío a la pipeta de sostén de tal forma que el (pro-)<br />
núcleo se haga bien visible. La pipeta de inyección tiene un diámetro de 1 a 2 µm y es llenada con la<br />
solución de ADN. Para la inyección, la pipeta es introducida por medio del micromanipulador a través de<br />
la zona pelúcida, la membrana celular y (pro-) nuclear. La inyección con un volumen de 1-2 pl de la<br />
solución de ADN aumenta el volumen del núcleo más del 50%.<br />
Transferencia de los embriones<br />
Después de un cultivo temporal, los embriones inyectados son transferidos mediante cirugía a oviductos<br />
de receptoras sincronizadas. La sincronización de las receptoras se lleva a cabo a través de un<br />
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tratamiento hormonal específico de especie. Antes de la transferencia de los embriones tratados se<br />
controla la reacción ovárica de la hembra receptora. Sólo son empleadas aquellas receptoras que<br />
respondieron al tratamiento hormonal con el número adecuado de folículos, que depende de la especie<br />
tratada.<br />
En la especie bovina se procede a cultivar los embriones in vivo o in vitro durante varios días, a fin de<br />
evitar la trabajosa intervención de la transferencia al oviducto (BERG y BREM, 1989). La finalidad es<br />
cultivar los embriones de una o dos células hasta el estadio de mórula y transferir éstas directamente en<br />
el útero de las receptoras. Para el conejo, cerdo, oveja y cabra el cultivo intermedio no es necesario,<br />
dado que en esas especies incluso la transferencia uterina se lleva a cabo mediante cirugía.<br />
Comprobación de la integración y la expresión<br />
Después de la transferencia génica sólo es posible en casos aislados determinar la integración del gen<br />
a través de cambios de fenotipo en los animales nacidos. Incluso aún cuando la estructura génica<br />
empleada permita esperar algún efecto, debe llevarse a cabo la comprobación de la integración del gen<br />
presente independientemente del fenotipo. Ello se debe a que la estructura génica integrada no siempre<br />
se exprime en los animales positivos. Para la comprobación de la integración génica se disponen de<br />
varios métodos. El material de evaluación lo constituyen células con núcleo, que se toman de los<br />
órganos o fluidos corporales. Normalmente se toman las pruebas del tejido de la punta de la cola o de la<br />
sangre. De ellas se aisla el ADN, que no requiere que sea especialmente de alto peso molecular, como<br />
lo es en el caso de los bancos de reservas genómicas.<br />
La lisis completa del tejido se logra a través de un tratamiento con proteinasa K-buffer a 55 C. La<br />
extracción se logra con cloroformo fenolado. Con acetato de Na y etanol se provoca la precipitación que<br />
aumenta con la centrifugación. Inmediatamente después se determina la concentración con ayuda de<br />
un espectrofotómetro, a partir de alícuotas diluidas.<br />
La exacta y más segura comprobación de la integración de las estructuras génicas se puede llevar a<br />
cabo por medio del método Southern-Blot. Aproximadamente 20-30 µg de ADN genómico de alto peso<br />
molecular es hidrolizado completamente con enzimas de restricción adecuadas. Después de la división,<br />
la mezcla de fragmentos de ADN es separada electroforéticamente en gel-agarosa horizontal. Un<br />
marcador aplicado al mismo tiempo permitirá la determinación del tamaño de los diferentes fragmentos<br />
de ADN. Los fragmentos separados son transportados a filtros de celulosa o a membranas de Nylon<br />
según el método de SOUTHERN (1975). El ADN, separado en el gel de agarosa, es transportado -<br />
después de la desnaturalización alcalina- a la nitrocelulosa o membrana de nylon que se encuentran<br />
directamente sobre agar por medio de capilaridad con ayuda de un buffer de transferencia. Con ADN<br />
genómico, el Blot puede terminar al cabo de 10-16 h. El tiempo de transferencia de ADN puede<br />
reducirse a menos de una hora con aparatos de vacío o de electro-Blotting. En un método rápido de<br />
evaluación de un número grande de pruebas de ADN se transporta una alícuota de ADN<br />
desnaturalizado y lavado en forma grosera, a una membrana soporte bajo presión negativa e<br />
inmediatamente después se híbrida con una prueba marcada radioactivamente. Con el método descrito<br />
por BRENIG y col. (1989) puede comprobarse la estructura génica en el ADN del animal hospedador en<br />
25-30 h. Con el reemplazo de la marcación radioactiva por un método de luminiscencia química puede<br />
ahorrarse más tiempo.<br />
Después de la desnaturalización y neutralización se continúa la transferencia de los fragmentos<br />
separados del gel al filtro de nitrocelulosa. Los fragmentos de ADN utilizados en la prueba son<br />
marcados radioactivamente. Ello puede llevarse a cabo mediante translación "nick" u oligopriming.<br />
Los filtros de nitrocelulosa son pre-hibridizados con ADN no específico e hibridizados posteriormente<br />
con ADN radioactivo. Después de un lavado astringente abundante, los filtros son expuestos a un film<br />
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Brem & col.<br />
radiográfico con una película reforzadora durante un tiempo determinado a 80 o C. Una alternativa al<br />
uso de sustancias radioactivas es la aplicación de dUTP biotinilado (LANGER y col., 1981) para el<br />
marcado de fragmentos. Biotina tiene una fuerte afinidad a la avidina, la cual por su parte puede<br />
acoplarse a indicadores adecuados (anticuerpos, enzimas, colorantes). De esta forma se pueden<br />
identificar también las cantidades más pequeñas de complejos biotina/ADN.<br />
En el método Southern-Blot la elección de la o las enzimas y de las pruebas de hibridación tiene una<br />
importancia definitiva. En los casos más adecuados hay una enzima cuyos dos lugares de división en la<br />
estructura génica están separados entre si en forma suficiente para usar el fragmento ubicado entre<br />
medio como grupo de hibridación. Si para la división del ADN se emplean los lugares de corte<br />
marginales, en los cuales el fragmento fue separado del vector, aparecen en el análisis Southern-Blot,<br />
junto con el o los fragmentos esperados con el tamaño correspondiente a la estructura génica, dos<br />
fragmentos en lo general más largos.<br />
El análisis de patrones ("pattern") de tal naturaleza permite sacar algunas conclusiones sobre la<br />
integración. Se sabe que, en muchos animales transgénicos, no sólo se integra una copia de la<br />
estructura génica inyectada. Varias copias son frecuentes en dependencia de los lugares marginales,<br />
concatómeros unidos al genoma en forma de "head to tail", "head to head" o "tail to tail". De la misma<br />
forma no es un fenómeno extraño que se pierdan algunas bases en terminales sobresalientes de los<br />
fragmentos, durante la integración. De esta forma desaparecen los lugares de división en los terminales<br />
5'-3'- en los fragmentos integrados de ADN. Si se divide el ADN genómico con enzimas de restricción,<br />
que cortan al final de la estructura génica, se separan los concatómeros del interior del fragmento de<br />
ADN en forma precisa y esperada. Sin embargo, dado que los lugares de corte en las terminales se<br />
pierden, se originan en las posiciones 5'-3'- fragmentos más grandes. Ello es así porque en ambas<br />
copias marginales del genoma se encuentran aún las secuencias hasta los próximos lugares de<br />
fragmentación en la cadena de ADN, apropiados para las enzimas de restricción. El largo de esas<br />
copias génicas marginales es casual y depende de la presencia de lugares de división adecuados en la<br />
zona de integración del ADN genómico. En casos relativamente escasos la integración de la estructura<br />
génica se produce no solamente en un lugar sino en dos o más. En casos favorables puede<br />
comprobarse su existencia por medio de análisis Southern-Blot. Con frecuencia esto no se logra en el<br />
primer animal receptor, pero sí después de la segregación del transgen en la descendencia. Se supone<br />
que para la expresión de las estructuras génicas la pérdida de bases marginales en general no tiene<br />
importancia.<br />
Si se emplean en la transferencia génica secuencias homólogas, es decir fragmentos de ADN<br />
provenientes de la misma especie, el análisis Southern-Blot debe planearse cuidadosamente. En esos<br />
casos la comprobación específica de la integración génica sólo es posible mediante la correcta<br />
selección de adecuadas enzimas de restricción, de lo contrario la diferenciación entre el ADN endógeno<br />
y el transferido es difícil. Dado que, sin embargo, sólo en casos excepcionales se elige el mismo orden<br />
de regiones no trasladadas promotoras y estructurales del gen y del genoma, se adecuan<br />
especialmente los lugares entre ambos genes como pruebas de hibridación. A pesar de ello ocurren<br />
también en esos casos señales a través de la hibridación cruzada de las pruebas con secuencias<br />
genómicas, que deben ser consideradas en el análisis. De vez en cuando se observan en las pruebas<br />
de integración patrones de integración inesperados. En esos casos el complejo patrón de restricción,<br />
que no responde al original, se puede determinar mediante un análisis de restricción y Southern.<br />
El número de estructuras génicas integradas en el genoma se determina por medio del análisis Dot-blot.<br />
El mismo no es una técnica de transferencia capilar, dado que el ADN es aplicado a la membrana de<br />
soporte mediante una máscara perforada. La electroforesis no es necesaria y la calidad del ADN no<br />
necesita ser tan buena como para el análisis de Southern-Blot. El ADN desnaturalizado es aplicado,<br />
lavado, horneado e hidrolizado. A través de la cuantificación densimétrica se calcula aproximadamente<br />
el número de copias del transgen (tamaño del genoma haploide = 3 . 10 9 pb).<br />
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Una técnica desarrollada hace pocos años, la reacción PCR (Polymerase Chain Reaction, capítulo XV),<br />
puede emplearse para evaluar si un animal es transgénico en un tiempo relativamente corto y con poco<br />
material celular. Cuando se pretende localizar el lugar de integración en el cromosoma se puede llevar a<br />
cabo una hibridación in situ de los cromosomas en metafase. El término hibridación in situ se emplea<br />
también para la comprobación directa de ADN y ARN en muestras de tejidos congelados.<br />
La especificidad para la expresión de un gen o estructura génica en un tejido se establece, entre otros,<br />
a través de su promotor. Por esa razón, para la evaluación de la transcripción correcta de una<br />
estructura génica inyectada se aisla el ARN de los tejidos en los cuales se espera la mayor expresión.<br />
La preparación del ARN se lleva a cabo según los protocolos de CHIRGWIN y col. (1979) y GLISIN y<br />
col. (1974), los cuales se basan en la lisis celular y desnaturalización proteica con isotiocianato de<br />
guanidina. El ARN es transferido a filtros de nitrocelulosa o de nylon (THOMAS, 1980) como para el<br />
análisis Southern-Blot o a geles desnaturalizados de agarosa/formaldehido, después de su<br />
desnaturalización con glioxal o dimetilsulfóxido (DMSO).<br />
Para recabar información sobre cantidad, estructura o porcentaje de síntesis se llevan a cabo tests con<br />
nucleasa S1 y ribonucleasa o ensayos de extensión del iniciador ("primer"). En el análisis S1 (SHARP y<br />
col., 1980) o el test de la protección de la ribonucleasa (CHAMBERLIN y RYAN, 1982) se emplean<br />
pruebas de cadenas simples, complementarias con el ARN que se pretende evaluar. Con ese método<br />
se pueden estudiar los puntos terminales 5'- y 3'- como así también la cantidad específica de ARN.<br />
Después que se pudo comprobar que la estructura génica microinyectada se transcribe correctamente,<br />
se debe evaluar la translación. Se analiza en primer lugar si la proteína correspondiente se sintetiza y,<br />
de ser así, en que cantidad. Para ello se disponen de métodos colorimétricos o electroforéticos en gel<br />
con coloración posterior (Comassie-Blue, plata) del gel o transporte a filtros de nitrocelulosa o<br />
membranas de nylon (Western-Blot). Además pueden emplearse métodos clínicos de diagnóstico<br />
(radioinmunoensayo, ELISA), los cuales están disponibles en parte en forma de kit. Para más<br />
información sobre esos métodos consultar la literatura siguiente: LOWRY y col., 1951; BRADFORD,<br />
1976; PETERSON, 1977; PETERSON, 1979; OAKLEY y col., 1980 HAMES & RICKWOOD, 1981;<br />
MOEREMANS y col, 1985; DARBRE, 1986; MOEREMANS y col., 1986; SALINOVICH & MONTELARO,<br />
1986.<br />
Herencia del transgen<br />
Un requisito indispensable para la aplicación de la transferencia génica en producción animal es que el<br />
gen transferido se transmita a la descendencia. Para ello es necesario que el animal receptor del gen<br />
(microinyectado) posea en todas o, al menos, en parte de sus células reproductivas el transgen.<br />
Lamentablemente se conoce poco sobre los caminos moleculares y biológicos que se suceden en la<br />
integración de un ADN inyectado. Por ejemplo, no se conoce exactamente cuando se lleva a cabo la<br />
integración y si ésta permanece estable en todas las células durante el desarrollo posterior del embrión.<br />
En ensayos de evaluación de animales nacidos transgénicos y especialmente en aquellos de<br />
producción de descendencia transgénica se ha observado que a pesar de la inyección del ADN, en el<br />
pronúcleo embrionario pueden originarse mosaicos.<br />
Mosaicos son animales originados por diferentes líneas, que provienen de un cigoto pero que poseen<br />
diferentes genotipos. Mosaicos transgénicos poseen células que contienen el transgen y otras que no lo<br />
tienen. Ello puede conducir a problemas en la formación de descendencia transgénica cuando en las<br />
células gonadales de los progenitores no está presente el transgen. Según las experiencias obtenidas<br />
se puede esperar que aproximadamente 30% de los animales receptores primarios del gen (por medio<br />
de microinyección) son mosaicos y que no transmitirán el transgen a su descendencia en la frecuencia<br />
esperada de 50%.<br />
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Brem & col.<br />
La herencia de animales transgénicos, en los cuales la estructura génica inyectada se integró en forma<br />
estable y se transmite a la descendencia, responde a las leyes mendelianas, dado que en general la<br />
integración del gen se produce en un solo lugar en un cromosoma. De acuerdo a la definición se<br />
describe a este tipo de animales como transgénicos heterocigotas. Sin embargo este término no es el<br />
adecuado, dado que falta el alelo correspondiente al transgénico en el cromosoma homólogo. Como es<br />
de esperar, 50% de la descendencia debe poseer el transgen. Sin embargo, si las gónadas son<br />
mosaicos de líneas transgénicas y no transgénicas, el porcentaje de descendencia transgénica variará<br />
entre 0-50% de acuerdo a la participación cuantitativa de ambas líneas celulares. Los mosaicos se<br />
originan sólo en la generación F0. Los animales transgénicos de la generación F1 y posteriores poseen,<br />
si son positivos, la estructura génica en todas las partes del cuerpo y células de la hilera germinal. Se<br />
ha observado, no obstante, que la integración no siempre permanece estable a través de las<br />
generaciones.<br />
La observación de que un transgen no permanece estable sino que puede perderse no fue aclarada en<br />
forma suficiente. Aún más frecuente que la inestabilidad de la integración es la gran variabilidad de la<br />
expresión del transgen, de forma tal, que en el curso de las generaciones, se presentan todas las<br />
formas posibles de variación: aumento, disminución o ausencia de expresión. Aún dentro de grupos de<br />
hermanos enteros se observó variabilidad de la expresión del transgen entre animales positivos. Las<br />
razones para ello no han sido aclaradas, seguramente desempeña el fenómeno conocido como<br />
"imprinting" un rol de importancia. A través de la diferente metilación, la expresión de un gen depende<br />
de su origen materno o paterno.<br />
La comprobación de varios lugares de integración en el genoma de animales transgénicos ocurre con<br />
relativa poca frecuencia. Si los lugares de integración están tan alejados entre sí, que pueden conducir<br />
a recombinaciones al azar, pueden originarse más de 50% de descendencia transgénica. De un animal<br />
transgénico con dos tipos de integración independientes puede esperarse que el 75% de la<br />
descendencia hereden el transgen, 25% recibirá uno de ambos transgenes y otro 25% ambos tipos en<br />
su genoma. El 25% restante no será transgénico. A través del apareamiento de animales transgénicos<br />
heterocigotas se obtiene, en casos normales, 50% de transgenes heterocigotas, 25% de homocigotas y<br />
25% de negativos.<br />
El azar de la integración génica en los animales transgénicos primarios (F0) puede conducir a la<br />
integración en el sector de un gen de importancia para el desarrollo del feto. Mientras un alelo intacto en<br />
el cromosoma homólogo de animales heterocigotas esté presente, no se producen problemas como<br />
consecuencia de esa mutación por inserción. Una excepción la constituyen posiblemente los efectos<br />
génico-aditivos, cuya integración en un lugar génico determinado tienen como consecuencia una<br />
reducida expresión de la característica endógena aditiva. Del apareamiento de animales heterocigotas<br />
que tienen una mutación de inserción no es posible obtener descendencia transgénica homocigota. Si el<br />
gen afectado por la mutación de inserción es esencial para el desarrollo del feto no nacerán animales<br />
transgénicos homocigotas. Antes de la reproducción de animales transgénicos debe evaluarse si los<br />
animales son libres de mutaciones de inserción, a fin de evitar un aumento de la carga letal. Dichas<br />
mutaciones de inserción pueden ser interesantes en investigación básica.<br />
Para la producción animal la aparición de mosaicos y mutantes de inserción tiene como consecuencia<br />
que para la introducción de un gen determinado en una población, un solo animal transgénico no es<br />
suficiente. Independientemente de la alta tasa de consanguinidad que se pueda generar, las<br />
posibilidades de producir una línea transgénica con un solo animal son reducidas.<br />
Para que una línea transgénica pueda tener éxito y aplicación en la práctica deberían cumplir las<br />
siguientes condiciones:<br />
- Transmisión estable del transgen a la descendencia.<br />
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163<br />
- Ausencia de mutaciones de inserción y la posibilidad de producir animales transgénicos<br />
homocigotas.<br />
- Expresión estable del transgen y efecto biológico positivo sobre la característica deseada.<br />
De ello se desprende que se deben producir como mínimo 5-10 animales transgénicos primarios (F0)<br />
para producir, con una probabilidad suficientemente alta, líneas que respondan a las exigencias<br />
establecidas.<br />
Programa de transferencia génica en el bovino<br />
Después que se informó por primera vez, en el año 1985 (HAMMER y col., 1985; BREM y col., 1985),<br />
sobre la exitosa aplicación de la transferencia génica en los animales domésticos (cerdo, oveja, conejo)<br />
se intensificaron los esfuerzos en los años siguientes para mejorar la metodología y los genes. Mientras<br />
que la tasa de integración no aumentó sensiblemente, en algunos ensayos se pudo mejorar la<br />
expresión a través del empleo de genes optimizados. La eficacia de un programa de transferencia<br />
génica depende de una serie de factores, como la habilidad en la manipulación embrionaria, el tipo y<br />
duración del cultivo in vitro, la calidad de la transferencia de los embriones, la edad de las receptoras<br />
empleadas y la sincronicidad entre donantes y receptoras.<br />
El esquema de desarrollo de un programa de transferencia génica se inicia con la selección,<br />
estimulación e inseminación (natural o artificial) de las donantes (fig. 1). La obtención de los cigotos se<br />
lleva a cabo por medio de la matanza o cirugía de las donantes, 75-97 h después del celo. Los<br />
embriones son centrifugados para exponer los pronúcleos (WALL, 1985). Junto con embriones de una<br />
célula se emplean para la inyección también embriones con 2 blastómeros. Una forma alternativa para<br />
la obtención de embriones para la microinyección de ADN en el bovino es la producción in vitro de<br />
embriones (ver capítulo XI).<br />
En la actualidad este método biotecnológico desplaza a la obtención in vivo de los embriones. La<br />
producción y el cultivo in vitro presentan las ventajas de ser más económicos, se evita la intervención<br />
quirúrgica de las donantes y receptoras como así también de los animales empleados para el cultivo<br />
temporal. Otra ventaja de la producción in vitro es la posibilidad de determinar el estadio del pronúcleo<br />
con mayor precisión. Ello permite la inyección de un mayor número de embriones. Después de la<br />
microinyección los embriones se cultivan in vitro o in vivo en el oviducto de receptoras temporales. La<br />
desventaja del último método se basa en las reducidas tasas de recuperación de los embriones como<br />
así también en su trabajosa ejecución. Los problemas de falta de desarrollo de los embriones<br />
producidos in vitro, a partir de los estadios de 8 y 12 células, pudieron resolverse con la aplicación del<br />
cocultivo de los embriones con células de la granulosa y del oviducto. Los embriones microinyectados<br />
son transferidos en los días 6-7 de desarrollo, momento en que alcanzan los estadios de mórula o<br />
blastocisto, en forma no quirúrgica a receptoras sincronizadas.<br />
LOHSE y col. (1985) informaron sobre el primer ensayo de transferencia génica en el bovino. Los<br />
autores inyectaron en ovocitos fertilizados una estructura génica TQ (timidin quinasa) y demostraron<br />
que 30% de los embriones indicaban una actividad TQ de 2 desviaciones estándar por encima de los<br />
controles. LOSKUTOFF y col. (1986) lograron 3 preñeces de la transferencia de 43 cigotos y 17<br />
embriones de dos blastómeros inyectados. En otro estudio McEVOY y col. (1990) obtuvieron 569<br />
ovocitos de 52 vaquillonas superovuladas (5,1 embriones de una y dos células por cada donante) por<br />
medio de laparotomía en la línea media. Los pronúcleos fueron observados en 71% de los casos<br />
después de 3 min y 81% después de 5 min de centrifugación a 13000 g, 62 y 60% de ellos se<br />
desarrollaron 24h después del cultivo. Como consecuencia de la microinyección degeneraron 20% de<br />
los cigotos. Embriones de una y dos células (n = 108) fueron transferidos a 46 receptoras. Al día 55<br />
fueron detectadas 20 hembras (43%) con 32 fetos, 17 de las cuales parieron (37%). Uno de los 27<br />
terneros nacidos fue transgénico. La tasa de sobrevivencia de los embriones de uno y dos blastómeros<br />
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164<br />
Brem & col.<br />
fue de 22 a 36%. CHURCH y col. (1986) informaron que se desarrollaron 111 embriones de 852 cigotos<br />
bovinos inyectados con el gen de la fetoproteína alfa, de los cuales se identificaron 4 que integraron el<br />
gen. Después de la inyección de 1161 cigotos con 3 diferentes estructuras génicas y la transferencia de<br />
641 (55%) la tasa de nacimiento fue de 10,5% (126) frente a 43% del grupo control. De los 126<br />
embriones inyectados y transferidos integraron el ADN 7 terneros. BIERY y col. (1988) informaron sobre<br />
la tasa de detección de los pronúcleos después de la centrifugación de 1325 cigotos a 15000 g durante<br />
4 min. Después de la microinyección y el cultivo in vivo en oviducto de oveja durante 6 días, se<br />
recuperaron 84% de los embriones, de los cuales 21% se desarrollaron hasta los estadios de mórula y<br />
blastocisto.<br />
La integración del ADN se registró en 4 fetos. ROSCHLAU y col. (1988) obtuvieron, luego de la<br />
castración de las donantes, 513 cigotos de oviductos que fueron inyectados con 3 diferentes estructuras<br />
génicas virales. En 14 de 44 embriones, de dos semanas de edad, fue posible comprobar la presencia<br />
del ADN; 5 embriones exprimieron el gen. De la transferencia de 43 embriones a 23 receptoras<br />
resultaron 14 preñeces y nacimientos. La integración del ADN bGH inyectado se comprobó en 1 ternero.<br />
En ensayos propios (REICHENBACH, 1989) se compararon diferentes sistemas de cultivo in vivo con<br />
cultivos in vitro. Las tasas de desarrollo obtenidas se detallan en la tabla 2. De ello se concluye que de<br />
las 3 especies obtenidas, el cerdo fue menos y el conejo fue el más adecuado para el cultivo de los<br />
cigotos. Lo destacable de este estudio fue que los sistemas de cultivo in vitro empleados (BERG y<br />
BREM, 1989) fueron comparables a los mejores resultados obtenidos in vitro, considerando los<br />
embriones cultivados y los transferidos.<br />
Tabla 2: Tasas de recuperación y desarrollo de los cigotos y embriones cultivados in vivo e in vitro<br />
después de la inyección génica (REICHENBACH, 1989)<br />
Cultivo<br />
temporal<br />
Embriones<br />
transferidos<br />
de 1 y 2<br />
células<br />
(a)<br />
n<br />
Embriones<br />
Recuperados<br />
(b)<br />
n<br />
(b/a)<br />
%<br />
Embriones desarrollados<br />
>1 división mórulas/blastocistos<br />
celular<br />
(c)<br />
n<br />
(c/b)<br />
%<br />
(d)<br />
n<br />
(d/b)<br />
%<br />
(d/a)<br />
%<br />
in vivo<br />
vaca<br />
8 Mi<br />
3 K<br />
183 66 93<br />
48<br />
51<br />
73<br />
24<br />
27<br />
26<br />
56<br />
17<br />
14<br />
18<br />
29<br />
9<br />
21<br />
in vivo<br />
cerda<br />
3 Mi<br />
1 K<br />
79<br />
29<br />
22<br />
12<br />
28<br />
41<br />
7<br />
5<br />
7<br />
5<br />
3<br />
2<br />
14<br />
17<br />
4<br />
7<br />
in vivo<br />
coneja<br />
4 Mi<br />
2 K<br />
82<br />
41<br />
46<br />
31<br />
56<br />
76<br />
28<br />
21<br />
28<br />
21<br />
13<br />
14<br />
28<br />
45<br />
16<br />
34<br />
in vitro<br />
5 Mi<br />
4 K<br />
123<br />
71<br />
123<br />
71<br />
100<br />
100<br />
63<br />
43<br />
63<br />
43<br />
18<br />
21<br />
15<br />
30<br />
15<br />
30<br />
Mi = Microinyectados<br />
K = no microinyectados (controles)<br />
Tres grupos de trabajo: en Texas (U.S.A, MASSEY, 1990), en Leiden (Holanda, KRIMPENFORT y col.,<br />
1990) y en Munich (República Federal de Alemania) publicaron el empleo exitoso de los embriones<br />
bovinos producidos in vitro hasta el nacimiento de terneros (tabla 3). Los primeros terneros<br />
transgénicos, producidos con el empleo de embriones producidos in vitro, nacieron en 1991<br />
(KRIMPENFORT y col., 1991). Como se señala en la tabla 3, 1% de los ovocitos recolectados culmina<br />
en terneros después de la fertilización, microinyección, cultivo y transferencia de los embriones tratados.<br />
A pesar de ello las ventajas de la producción in vitro de embriones superan al sistema de producción in<br />
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165<br />
vivo. En el futuro la producción de animales transgénicos se desarrollará, con seguridad, apoyada en la<br />
producción in vitro de los embriones, porque se considera que la eficacia de las diferentes etapas<br />
mejorará en los próximos años.<br />
Tabla 3: Microinyección de ADN en embriones producidos in vitro según diferentes autores<br />
Texas, USA<br />
MASSEY, 1990<br />
Leiden, Holanda<br />
KIMPENFORT y<br />
col., 1991<br />
Munich, Alemania<br />
resultados propios,<br />
1989, 1991/92<br />
Pasos n % n % n %<br />
Maduración de<br />
los ovocitos 2408 - 2297 - 686 -<br />
Microinyección<br />
de los ovocitos 858 36 1154 50 496 72<br />
Embriones<br />
transferidos 49 6 129 11 60 12<br />
Gestaciones/<br />
Terneros 12 24 21* 21 12 26<br />
* 2 terneros transgénicos<br />
Dado que las receptoras significan el mayor costo de un programa de transferencia génica, empleando<br />
la producción in vitro de embriones, se trabaja intensamente en el diagnóstico de la integración del gen<br />
ya sea durante la gestación (a través de la recolección y análisis de las células embrionarias) o, mejor<br />
aún, en los embriones de 6-7 días de edad, por medio del diagnóstico de PCR (capítulo XV).<br />
Foto 1: Microinyección de ADN en el pronúcleo de un cigoto de<br />
ratón<br />
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166<br />
Brem & col.<br />
Bibliografía<br />
BERG, U. AND BREM, G. 1989. In vitro production of bovine blastocysts by in vitro maturation and fertilization<br />
of oocytes and subsequent in vitro culture. Zuchthyg. 24: 134-139.<br />
BRADFORD, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein<br />
utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.<br />
BREM, G., BRENIG, B., GOODMAN, H.M., SEL<strong>DE</strong>N, R.C., GRAF, F., KRUFF, B., SPRINGMANN, K., HAN<strong>DE</strong>LE,<br />
J., MEYER, J., WINNACKER, E.L., KRÄUßlICH, H. 1985. Production of transgenic mice, rabbits and pigs by<br />
Microinjection into pronuclei. Zuchthygiene 20, 251-252.<br />
BRENIG, B. 1987. Klonierung mikroinjizierbarer Genkonstrukte und deren Nachweis in transgenen Tieren. - Ein<br />
Beitrag zur Nutzung transgener Tiere in der Tierzucht. Diss. med. vet., München.<br />
BRENIG, B., MÜLLER, M. and BREM, G. 1989. A fast detection protocol for screening large numbers of transgenic<br />
animals. Nucl. Acids Res. 17: 6422.<br />
BRINSTER, R.L., ALLEN, J.M., BEHRINGER, R.R., GELINAS, R.E. and PALMITER, R.D. 1988. Introns increase<br />
transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 836-840.<br />
BRINSTER, R.L., CHEN, H.Y., TRUMBAUER, M.E., YAGLE, M.K. and PALMITER, R.D. 1985. Factors affecting<br />
the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:<br />
4438-4442.<br />
CHAMBERLIN, M. and RYAN, T. 1982. Bacteriophage DNA-dependent RNA polymerase. In: The Enzymes, Vol.<br />
XV P. (Boyer, Ed.) Academic Press, NY: 87-108.<br />
CHIRGWIN, J.M., PRZYBYLA, A.E., McDONALD, R.J. and RUTTER, W.J. 1979. Isolation of biologically active<br />
rebonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochem. 18: 5294-5299.<br />
CHURCH, R.B. 1986. Embryo Manipulation and gene Transfer in domestic animals. Tibtech 5: 13-19.<br />
CHURCH, R.B., McPRAE, A. and McWHIR, J. 1986. Embryo Manipulation and gene Transfer in Livestock<br />
Production. Proc. 3rd World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Lincoln, Nebraska<br />
16.-22.07.<br />
DARBRE, A. 1986. Analytical methods. En: Practical Protein Chemistry, A handbook (A. Darbre ed.) Wiley-Liss.,<br />
N. W., 227-335.<br />
GLISIN, V., CRKVENJAKOV, R. and BYUS, C. 1974. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.<br />
Biochem. 13, 2633-2637.<br />
GORDON, J.W., SCANGOS, G.A., PLOTKIN, D.J., BARBOSA, A. and RUDDLE, F.H. 1980. Genetic<br />
transformation of mouse embryos by microinjection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384.<br />
HAMMER, R.E., PURSEL, V.G., REXROAD, C.E., WALL, R.J., BOLT, D.J., EBERT, J.M., PALMITER, R.D. and<br />
BRINSTER, R.L. 1985. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 315:<br />
680-683.<br />
HAMES, D.B. and RICKWOOD, D. 1981. Gel electrophoresis of proteins. IRL Press, Washington, D. C.<br />
KRIMPENFORT, P., RA<strong>DE</strong>MAKERS, A., EYESTONE, W., Van der SCHANS, A., Van den BROEK, S., KOOIMAN,<br />
P., KOOTWIJK, E., PLATENBURG, G., PIEPER, F., STRIJKER, R., De BOER, H. 1991a. Generation of<br />
transgenic dairy cattle using "in vitro" embryo production. Biotechnol. 9: 844-847.<br />
LANGER, P.R., WALDROP, A.A. and WARD, D.C. 1981. Enzymatic synthesis of biotin-labelled polynucleotides.<br />
Novel nucleic acid affinity probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633-6637.<br />
LOHSE, J.K., ROBL, J.M. and FIRST, N.L. (1991). Progress Towards Transgenic Cattle. Theriogenology 23: 205.<br />
LOSKUTOFF, N.M., COREN, B.R., BARRIOS, D.R., BESSONDO, E., BOWEN, M.J., STONE, G. and KRAEMER,<br />
D.C. 1986. Gene Microinjection in Bovine Embryos Facilitated by Centrigugation. Theriogenology 24, 168<br />
LOWRY, O.H., ROSEROUGH, N.J., FARR, A.L. and RANDALL, R.J. 1951. Protein measurement with the Folin<br />
phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.<br />
MASSEY, J.M. 1990. Animal production industry in the year 2000. J. Reprod. Fert. Suppl. 41: 199-208.<br />
McEVOY, T.G., SRACK, M., BARRY, T. and KEANE, B. 1987. Direct Gene Transfer by Microinjection.<br />
Theriogenology 27: 258.<br />
MOEREMANS, M., De RAEYMAEKER, M. and De MEY, J. 1985. Sensitive colloidal metal (gold or silver) staining<br />
of protein blots on nitrocellulose membranes. Anal. Biochem. 145, 315-321.<br />
Biotecnología de la Reproducción<br />
www.reprobiotec.com
Animales transgénicos<br />
167<br />
MOEREMANS, M., De RAEYMAEKER, M., DANEELS, G. and De MEY, J. 1986. FerriDye: Colloidal iron binding<br />
followed by Perls' reaction for the staining of proteins transferred from sodium dodecyl sulfate gels to<br />
nitrocellulose and positively charged nylon membranes. Anal. Biochem. 153: 18-22.<br />
OAKLEY, B.R., KIRSCH, D.R. and MORRIS, N.R. 1980. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting<br />
proteins in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 105: 361-363.<br />
PETERSON, G.L. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally<br />
applicable. Anal. Biochem. 83: 346-356.<br />
PETERSON, G.L. 1979. Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowry, Rosebrough, Farr and<br />
Randall. Anal. Biochem. 100: 201-220.<br />
POWELL, B.C. and ROGERS, G.E. 1990. Cyclic hair-loss and regrowth in transgenic mice overexpressing an<br />
intermediate filament gene. EMBO, 9: 1485-1493.<br />
REICHENBACH, H.-D. 1989. Zur Behandlung früher Embryonalstadien vom Rind. Diss. med. vet., München.<br />
ROSCHLAU, K., ROMMEL, P., GAZARYAN, K.G., ANDREEWA, L., ROSCHLAU, D., HÜHN, R., ZACKEL, B.,<br />
STRAUSS, M., SCHWERIN, M. 1988. Microinjection of various vectors into pronuclei of bovine zygotes. Proc.<br />
Intern. Congress Reprod. and Fertility, Dublin.<br />
SALINOVICH, O. and MONTELARO, R. 1986. Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to<br />
nitrocellulose after separation by SDS-Page. Anal. Biochem. 156: 341-347.<br />
SHARP, P.A., BERK, A.J. and BERGET, S.M. 1980. Transcription maps of adenovirus. Meth. Enzymol. 65:<br />
750-768.<br />
SOUTHERN, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.<br />
J. Mol. Biol. 98: 503-517.<br />
THOMAS, P.S. 1980. Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc.<br />
Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201-5205.<br />
WALL, R.J., PURSEL, V.G., HAMMER, R.E. and BRINSTER, R.L. 1985. Development of porcine ova that were<br />
centrifuged to permit visualization of pronuclei and nuclei. Biol. Reprod. 32: 645-651.<br />
Biotecnología de la Reproducción<br />
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