Trichinellosis: Respuesta Inmune y actualización en el diagnóstico ...

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Trichinellosis: Respuesta Inmune y
actualización en el diagnóstico inmunoserológico
15 min. Investigador de la Cátedra de Inmunología, tiva encapsulada en el músculo del animal
Facultad de Farmacia y Bioquímica-UBA. infectado. Estas larvas infectivas o
musculares (LM) son liberadas en el
Bioquímico de Planta MANLAB, Área Inmu- estómago por acción de las enzimas
En el siguiente articulo el Dr. noserología y Autoinmunidad. digestivas y transportadas al intestino
Guillermo G. Nuñez, docente e investigador
delgado en donde penetran en las
de la Cátedra de Inmunología, de la Facultad
vellosidades. Allí, estas larvas se transde
Farmacia y Bioquímica de la Universidad E-mail: forman en vermes adultos (VA) machos y
de Buenos Aires (UBA) nos describe el ciclo guillermo.nunez@genesis-manlab.com.ar
hembras, los cuales copulan y al cabo del
evolutivo del parasito de la trichinellis, una
cuarto o quinto día post-ingesta la hembra
enfermedad parasitaria transmitida por la
comienza a eliminar pequeñas larvas vivas
ingesta de carne cruda o insuficientemente
(larvas recién nacidas, LRN), que por vía
cocida de animales domésticos, y destaca la Introducción
circulatoria sanguínea y linfática llegan a los
importancia que tiene el uso simultáneo de
músculos estriados en donde crecen y se
dos técnicas inmunoserológicas que
La trichinellosis es una infección desarrollan para dar lugar a la LM
emplean diferentes antígenos para arribar a parasitaria ampliamente distribuida en el encapsulada en la denominada célula
un diagnóstico precoz de esta peligrosa mundo producida por nematodes del nodriza. Este ciclo se completa luego de los
enfermedad ya que permitirián aplicar una género Trichinella y cuya enfermedad en el 20 días post-infección. Las LM encapsuladas
terapia antiparasitaria más eficiente. hombre se caracteriza por un síndrome pueden así vivir durante años, habiéndose
También nos detalla los resultados febril, mialgias, eosinofilia elevada, edema observado en algunos casos, la calcificación
prometedores que se han logrado al periorbital, síndrome oculopalpebral, de la cápsula y la muerte de la larva (Villella,
desarrollar metodologías que permiten la edema facial y ocasionalmente diarrea. Esta 1970). El ciclo de vida se esquematiza en la
d e t e c c i ó n d e c o p r o a n t í g e n o s , enfermedad es una zoonosis parasitaria Figura 1.
coproanticuerpos e inmunocomplejos en transmitida por alimentos, específicamente
materia fecal, tanto en modelos por carne de animales domésticos. En Respuesta inmune
experimentales como en pacientes Argentina, se produce principalmente por el
provenientes de brotes epidémicos y el consumo de carne de cerdo o jabalí cruda o
Dado que el ciclo de vida del
desarrollo también de una técnica de insuficientemente cocida y sin el adecuado parásito posee tres fases (intestinal,
Inmunoperoxidasa (IPO), como una control sanitario o no tratada por métodos sistémica y muscular), se evidenciarán
alternativa para aquellos laboratorios que que podrían prevenir la transmisión del distintos fenómenos inmunológicos en las
n o c u e n ta n c o n m i c ro s c o p i o d e parásito (cocción, congelación, irradiación). tres fases, a saber:
fluorescencia y personal entrenado para tal Diferentes especies de Trichinella están
fin (aunque no disponible en el mercado). comprometidas en la enfermedad en el Fase intestinal:
mundo, pero en la Argentina, la especie La respuesta inmune montada contra T.
encontrada hasta el momento es Trichinella spiralis es una combinación de respuestas
spiralis (Venturiello y col., 2007).
dirigidas contra los diferentes estadios del
Dr. Guillermo G. Nuñez
parásito los cuales son antigénicamente
Ciclo evolutivo del parasito
diferentes (Philipp y col., 1981). Numerosos
Bioquímico. Doctor de la Universidad de
cambios celulares tienen lugar en el
Buenos Aires. Docente Autorizado e
El hombre consume la larva infec- intestino produciéndose un aumento
Bioanálisis I Nov · Dic 11

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significativo en el número de células observándose cambios en las poblaciones respuesta no es totalmente efectiva debido
caliciformes, mastocitos y eosinófilos, junto celulares incluyendo la mastocitosis e a la rápida evolución de los estadios
con una alteración y pérdida de células hiperplasia críptica. Sin embargo se ha parasitarios y a su reclusión final en músculo
epiteliales y alteraciones morfológicas de descripto que cuando se trabaja con esquelético, evadiendo de esta manera la
las vellosidades intestinales (Weatherly, ratones knock out para la iNOS la expulsión respuesta inmune efectora (Venturiello y
1983). Los cambios celulares, junto con el de los vermes de la mucosa se produce en col., 2007).
desarrollo de inmunidad, son dependientes forma normal.
de linfocitos T (Perrudet-Bandoux y col.,
Fase sistémica:
1980). Dentro de las modificaciones que
sufre la mucosa intestinal durante la
Se ha demostrado que durante la
infección, se describe también una FIGURA 1: Ciclo biológico de Trichinella primoinfección por T. spiralis se produce
variación en el número de células de Paneth spiralis una modificación en la proporción de
(Kamal y col., 2001). Estas células secretoras
se encuentran en la base de las criptas de
Lierberkhün y se caracterizan por poseer
gránulos con alto contenido de lisozima,
criptidinas, IgG e IgA. Debido a estas
características se les ha otorgado a estas
células un efecto antibacteriano aunque su
rol en las parasitosis es aún desconocido.
Ingestión de carne cruda o
insuficientemente cocida infectada
con LARVAS MUSCULARES vivas encapsuladas
Penetración en fibras musculares.
Formación de la cápsula.
Maduración a LARVAS
MUSCULARES (17-21 días)
Generación de LARVAS
RECIEN NACIDAS (4º-5º día)
y diseminación por el
torrente sanguíneo
Digestión de la cápsula
en el estómago y liberación
de las larvas (1-2 horas)
Implantación de las larvas
en intestino. Muda a
VERMES ADULTOS (48 horas).
Fecundación
diferentes poblaciones celulares del
hospedador y se sintetizan secuencialmente
anticuerpos específicos para los tres
estadios del parásito (Ogilvie y De Savigny,
1982). Las características inmunológicas
más importantes de la infección son el
aumento de los niveles séricos de inmuno-
globulinas, particularmente de IgE, y la
eosinofilia, siendo estos dos últimos
parámetros consecuencia de la polarización
y mantenimiento de la respuesta inmune
hacia el fenotipo Th2.
Numerosos estudios se han llevado
a cabo para dilucidar cuáles son los eventos
inmunoregulatorios que conducen al
rechazo del verme del intestino. Durante las
Expulsión de los vermes adultos del intestino
primeras horas de la infección se produce
Se sabe que sueros obtenidos luego
(15-60 días dependiendo de la especie
una respuesta con citoquinas de tipo Th0 y
de hospedador parasitado)
de pocas semanas de infección presentan
Th1 tanto en ratas (Ramaswamy y col.,
anticuerpos dirigidos contra la cutícula de la
1996) como en ratones (Ishikawa y col., Además de los cambios celulares a LRN. Estos anticuerpos son capaces de
1998), sin embargo, poco tiempo después nivel del epitelio intestinal existe un opsonizar a la larva activando células
comienza a predominar una respuesta de aumento en la síntesis de IgA e IgE en fluido efectoras que dan muerte a la misma
tipo Th2, la cual es esencial para dar fin a la intestinal. Se postula a la IgA como una mediante el mecanismo de citotoxicidad
fase intestinal de la infección. Tanto la IL-4 inmunoglobulina fundamental en la fase celular dependiente de anticuerpo (CCDA)
como la IL-13 son suficientes para facilitar el intestinal de la parasitosis ya que actuaría mediante la secreción, por parte de células
desarrollo de una respuesta inmune de tipo disminuyendo la fecundidad de los VA efectoras (e.g. eosinófilos) de proteínas
protectiva (Urban y col., 2000). No está aún hembra y a la IgE como inmunoglobulina tóxicas y radicales libres del oxígeno
claro cómo las células Th2 promueven el responsable del rechazo de los VA (Bell, (Gansmüller y col., 1987). Trabajos
rechazo de los vermes de la mucosa 1998). recientes han demostrado también al
intestinal aunque las citoquinas y otros
pulmón como un sitio de retención y
mediadores solubles liberados por los A pesar de que se desencadena una muerte parasitaria (Gentilini y col., 2011).
mastocitos podrían ser los responsables. respuesta inmune celular y humoral,
Lawrence y col. (2000) demostraron que el proceso multifactorial que incluye varios Fase muscular:
óxido nítrico participa en el mecanismo de isotipos de anticuerpos, factores del
inflamación del epitelio intestinal, complemento y mediadores solubles, la Durante la fase muscular de la
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parasitosis humana se producen cambios Diagnóstico Indirecta (IFI), que emplea como antígenos
fenotípicos en la población de linfocitos T.
cortes de crióstato de LM, el ELISA y la
Las células mononucleares de sangre El diagnóstico de casos aislados de Inmunoelectrotransferencia (IETB). Estas
periférica secretan citoquinas de tipo Th2 e trichinellosis humana resulta difícil dado dos últimas metodologías emplean como
IFN cuando éstas son estimuladas con un que las manifestaciones clínicas son antígeno los denominados Productos de
extracto crudo de LM. Los linfocitos comunes a otras enfermedades (intoxi- Excreción-Secreción de la LM (PES), que son
presentes en esta población celular son cación alimentaria, gripe, reumatismo, obtenidos mediante cultivos in vitro del
predominantemente CD8+, produciéndose dermatomiositis, etc.). parásito. Al ser los PES una preparación
además un descenso concomintante del
antigénica de mayor pureza, la especificidad
recuento de linfocitos T CD4+ (Gomez En trichinellosis podemos hablar de de estas técnicas resulta ser mayor.
Morales y col., 2002). tres tipos de diagnóstico, a saber: Asimismo, la sensibilidad de estas técnicas
es superior ya que se trata de reacciones
Antigenos parasitarios -Diagnóstico de sospecha: dado por el inmunológicas de interacción primaria,
contexto epidemiológico, clínico y los datos donde, el empleo de sistemas de alta
Los anticuerpos sintetizados de laboratorio como la leucocitosis (15.000- afininidad como el sistema avidina-biotina
durante las diferentes fases de la infección 50.000/mm3), la hipereosinofilia (mayor a empleado en la IET logra incrementar aún
por T. spiralis están dirigidos contra dos 500 eosinófilos/mm3), la hipergamma- mas la sensibilidad analítica de la técnica
grupos diferentes de proteínas obtenidas globulinemia y la elevación de enzimas (Nuñez y col., 2000).
de homogenatos larvales (Takahashi, 1997). musculares como la creatinfosfoquinasa, la
Un grupo de antígenos que contienen lactato dehidrogenasa y la aldolasa Dado que cuando el paciente acude
fosforilcolina (FC) induce una respuesta (Murrell y Bruschi, 1994). a la consulta médica y hay sospecha clínica
durante la fase intestinal tardía, -Diagnóstico confirmatorio: se basa en la de trichinellosis (presencia de mialgias,
aproximadamente dos semanas p.i. detección de anticuerpos séricos dirigidos eosinofilia, elevación de enzimas
mientras que el segundo grupo de contra el estadio parasitario de LM. Los musculares) ya han transcurrido al menos
antígenos induce una respuesta cuatro o métodos actualmente empleados son la 20 días post-infección, a diferencia de otras
cinco semanas p.i., cuando las LM ya se inmunofluorescencia indirecta (IFI), el ELISA enfermedades infecciosas, no resulta
encuentran en músculo esquelético. Este y la inmunoelectrotransferencia (IET) imprescindible la detección de IgM
último grupo de antígenos ha sido (Nuñez y col., 2000; Costantino y col., específica ya que al momento, el switch de
denominado TSL-1 (Appleton y col., 1991), 2001). inmunoglobulinas ya ha tenido lugar y
siendo los anticuerpos anti-TSL-1 relevantes -Diagnóstico de certeza: basado en la encontraremos en el suero altos niveles de
para el serodiagnóstico (Denkers y col., detección de las LM en músculo mediante IgG específica. En aquellos casos en donde
1991). Estudios inmunohistoquímicos han biopsia y técnicas histoquímicas. Cabe haya una fuerte sospecha clínica y
demostrado que los antígenos TSL-1 se destacar que esta metodología posee baja epidemiológica (e.g. ingesta de derivados
encuentran presentes en la cutícula de la sensibilidad (Murrell y Bruschi, 1994). de cerdo) y los anticuerpos aún no sean
LM, en los gránulos de los esticocitos así
detectables se recomienda la toma de una
como también en los productos de Los métodos inmunoserológicos segunda muestra a los 15 días a los efectos
excreción-secreción del parásito (PES). El rol antiguamente empleados incluian a la de evaluar una posible seroconversión. En la
de estos antígenos en el parasitismo por T. Hemaglutinación Indirecta (HAI), la TABLA 1 se indican los valores de
spiralis aún no ha sido totalmente Floculación de la Bentonita (FB) y la desempeño de las tecnicas actualmente
dilucidado. Contrainmunoelectroforesis (CIEF). Estas empleadas. Cabe destacar, finalmente, que
reacciones utilizaban como antígeno se ha demostrado que el uso simultáneo de
Los antígenos TSL-1 comparten un parasitario un homogenato total de la LM dos técnicas inmunoserológicas que
epitope glucídico al cual se le atribuye su (único estadio adecuado para realizar el empleen diferentes antígenos, permite
inmunodominancia (Denkers y col., 1991). diagnóstico de esta parasitosis). Estos arrivar a un diagnóstico mas precoz,
Este epitope se encuentra formado por una médodos, poseían una sensibilidad permitiendo así el establecimiento de una
familia de estructuras tri- y tetraantenarias epidemiológica y analítica limitadas dado terapia antiparasitaria mas eficiente, que si
N- unidas con residuos subterminales de N- que se trata de reacciones de interacción bien no logrará erradicar las larvas que ya se
acetil galactosamina (GalNAc) que se secundaria, donde el nivel de anticuerpos encuentren en músculo estriado, tenderá a
encuentra unida por uniones tipo a N- circulantes requeridos para que dichas reducir la carga parasitaria de los vermes a
acetilglucosamina (GlcNAc) (Reason y col., reacciones sean positivas debe ser elevado. nivel intestinal.
1994). Todas las antenas poseen un residuo Por otra parte, al emplearse extractos
terminal de 3,6-dideoxi-D-arabinohexosa, crudos de la LM, la especificidad tendía a ser En un intento por arrivar a un
denominada tivelosa (Wisnewski y col., baja debido a fenómenos de inmuno- diagnóstico temprano de la parasitosis (esto
1993). Contrariamente a los antígenos que rreactividad cruzada con otros agentes es, antes de que las LM alcancen el músculo
poseen tivelosa, los antígenos que poseen infecciosos. estriado, donde los antiparasitarios no
FC en su estructura no se encuentran en los
tienen efecto) se ha intentado desarrollar
PES sino en las estructuras internas del En la actualidad, las reacciones técnicas para la detección de antígenos
parásito. empleadas para la detección de la circulantes por diversas metodologías
parasitosis son la Inmunofluorescencia (ELISA, DELFIA, etc), sin embargo, las
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sensibilidades obtenidas no han sido
M.L., Diamante, M.A., Venturiello, S.M. (2001).
óptimas debido principalmente a la
Diagnosis of human trichinellosis. Pitfalls in the
dependencia de la respuesta de la técnica
use of a unique immunoserological technique.
Parasite (8):2: S144.
con la carga parasitaria, la formación de TABLA 1: Performance de los metodos
- Denkers E.Y., Hayes C.E., Wassom D.L. (1991).
inmunocomplejos, etc. Prometedores inmunoserológicos mas empleados para la
Tr i c h i n e l l a s p i ra l i s : I n f l u e n c e o f a n
resultados fueron obtenidos sin embargo, al detección de trichinellosis immunodominant, carbohydrate-associated
desarrollar metodologías que permitan la
determinant on the host antibody response
detección de coproantígenos, coproan- ELISA IFI IET repertoire. Experimental Parasitology 72:403.
ticuerpos e inmunocomplejos en materia Sensibilidad (%) 96.0 96.3 93.5 - Gansmüller A., Antenuis A., Venturiello S.M.,
fecal, tanto en modelos experimentales Especificidad (%) 99.0 96.0 100 Bruschi F., Binaghi R.A. (1987). Antibody-
como en pacientes provenientes de brotes Indice Youden 0.950 0.893 0.935 dependent in vivo cytotoxicity of newborn
Trichinella spiralis: nature of the cells involved.
epidémicos (Nuñez y col., 2003; Nuñez y
Parasite Immunology 9:281.
col., 2006). Finalmente, se ha desarrollado
- Gentilini M.V., Nuñez G.G., Roux M.E.,
también (aunque no disponible en el Bibliografia Venturiello, S.M. Trichinella spiralis infection
mercado) una técnica de Inmunoperoxidasa
rapidly induces lung inflammatory response. The
(IPO), como una alternativa para aquellos - Appleton J.A., Bell R.G., Homan W., van Knapen lung as the site of helminthocytotoxic activity.
laboratorios que no cuentan con F. (1991). Consensus on Trichinella spiralis Immunobiology 2011. En prensa.
antigens and antibodies. Parasitology Today
microscopio de fluorescencia y personal
- Gomez Morales M.A., Mele R., Sanchez M.,
7:190.
entrenado para tal fin (Ben y col., 1997).
Sachinni D., De Giacomo M., Pozio E. (2002).
- Bell R.G. (1998). The generation and expression Increased CD8+ T-cell expression and a type Th2
Cabe destacar, que la IFI no es un metodo of immunity to Trichinella spiralis in laboratory cytokine pattern during the muscular phase of
comercial y que solo se practica en centros rodents. Advances in Parasitology 41:149. Trichinella infection in humans. Infection and
de referencia especializados que cuentan - Ben G.J.M., Malmassari S.L., Nuñez, G.G., Immunity 70:233.
con bioterios y la cepa parasitaria para la Costantino S.N., Venturiello S.M. (1997). - Ishikawa N. Goyal P.K., Mahida Y.R., Li K.F.,
preparacion de las improntas.
Evaluation of an enzymatic immunohis-
Wakelin D. (1998). Early cytokine response during
tochemical technique in outbreaks of human intestinal parasitic infections. Immunology
trichinellosis. Journal of Helminthology 71(4), 93:257.
299. - Kamal M., Wakelin D., Mahida Y. (2001). Mucosal
- Costantino S.N., Malmassari, S.L., Dalla Fontana, responses to infection with Trichinella spiralis in

19
mice. Parasite 8:S110. Parasitology 66:671. trichinellosis. Revista Farmacéutica Reviews
- Lawrence C.E., Paterson J.C., Wei, X.Q., Liew F.Y., - Philipp M., Taylor P.M., Parkhouse R.M., Ogilvie 149(2): 35.
Garside P., Kennedy M.W. (2000). Nitric oxide B.M. (1981). Immune response to stage-specific - Villella J.B. (1970). Life cycle and morphology.
mediates intestinal pathology but not immune surface antigens of the parasitic nematode En: Trichinosis in Man and Animals. Ed.: Gould
expulsion during Trichinella spiralis infection in Trichinella spiralis. Journal of Experimental S.E. Springfield, IL, p. 19.
mice. Journal of Immunology 164:4229. Medicine 154:210. - Weatherly N.F. (1983). Anatomical pathology.
- Murrell K.D., Bruschi F. (1994). Clinical - Ramaswamy K., Negrao-Correa D., Bell R.. En: Trichinella and trichinosis. Ed.: Campbell W.C.
Trichinellosis. En: Progress in Clinical (1996). Local intestinal immune responses to Plenum Press. New York, p. 173.
Parasitology. Ed.: Tsieh M.D. CRC Press, New York, infections with Trichinella spiralis. Real-time, - Wisnewski N. McNeil M., Grieve R.B., Wassom
p. 117. continuous assay of cytokines in the intestinal D.L. (1993). Characterization of novel fucosyl- and
- Nuñez G.G., Costantino S.N., Venturiello S.M. (afferent) and efferent thoracic duct lymph of tyvelosyl-containing glycoconjugates from
(2003). Immunoparasitological parameters of the rats. Journal of Immunology 156:4328. Trichinella spiralis muscle stage larvae. Molecular
intestinal phase of trichinellosis in rats. - Reason A.J, Ellis LA, Appleton J.A., Wisnewski N, and Biochemical Parasitology 61:25.
Parasitology, 126:321.
Grieve R.B., McNeil M., Wassom D.L., Morris H.R.,
- Nuñez G.G., Costantino S.N., Venturiello S.M. Dell A. (1994). Novel tyvelose-containing tri- and
(2006). Detection of coproantibodies and faecal tetraantennary N-glycans in the immunoimmune
complexes in human trichinellosis. dominant antigens of the intracellular parasite
Parasitology 134(5):723. Trichinella spiralis. Glycobiology 4:593.
- Nuñez G.G., Malmassari S.L., Costantino S.N., - Takahashi Y. (1997). Antigens of Trichinella
Venturiello S.M. (2000). Immunoelectrotransfer spiralis. Parasitology Today 13:104.
blot assay in acute and chronic human - Urban Jr. J.F. Urban J.F. Jr, Schopf L., Morris S.C.,
trichinellosis. Journal of Parasitology 86 (5): Orekhova T., Madden K.B., Betts C.J., Gamble
1121. H.R., Byrd C., Donaldson D., Else K., Finkelman F.D.
- Ogilvie B.M., De Savigny D. (1982). Immune (2000). Stat6 signaling promotes protective
response to nematodes. En: Immunology of immunity against Trichinella spiralis through a
parasitic infections. Eds.: Cohen, Warren. p. 265. mast-cell and T-cell-dependent mechanism.
- Perrudet-Badoux A., Boussac-Aron Y., Journal of Immunology 164:2046.
Ruitemberg E.J., Elgersma A. (1980). Preliminary - Venturiello S.M., Costantino S.N., Nuñez G.G.
studies on the course of Trichinella spiralis (2007). Alteraciones fisiopatológicas y relación
infection in athymic, nude rats. Journal of inmunológica hospedador-parásito en