En la mitosis los microtúbulos ensamblan el aparato mitótico ...

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En la mitosis los microtúbulos ensamblan el aparato mitótico ...

En la mitosis los microtúbulosensamblan el aparatomitóticotico, estructura que es esencial para distribuir elmaterial genético en las células cde la nueva generación.n.


El aparato mitótico se ensambla a partir de centrosomas, que en célulasen interfase ocupa una posición perinuclearnúcleo


La matriz fibrosa pericentriolar contiene numerosas copias delcomplejo γ-TuRC (gamma-tubulin ring complex)El complejo γ-TuRC consiste de proteínas que estabilizan un anillode subunidades de tubulina γ a partir del cual se ensamblan losheterodímeros α/β. Los microtúbulos ensamblados a partir delcentrosoma poseen una polaridad uniforme, con su extremo derápido crecimiento (+) distal.


El aparato mitótico consiste de tres tipos de microtúbulosfuncionalmente distintos: astrales, del cinetocoro y polaresLos MTs astrales irradian desde el centrosoma (en amarillo) y contribuyen a la separación de los polos yal posicionamiento del huso. Los MTs del cinetocoro (en rojo) forman ramilletes (fibras del cinetocoro)que anclan los polos a los cinetocoros de los cromosomas. Los MTs polares (en azul) se interdigitan en elecuador del huso y permiten generar fuerzas que regulan la separación de los polos.Lodish et al., 2004


‣ formación del huso‣ captura y alineamiento de cromosomas‣ transporte de cromátides hacia los polosno solo depende de microtúbulos sinotambién de moléculas motoras


El rol esencial de kinesinas en el ensamble del huso mitótico ha sidoexaminado in vitro a partir de extractos de huevos de XenopusLa inactivación de la kinesina bipolar Eg5 con la droga monastrol produce un husomonopolar. Los microtúbulos se marcaron empleando tubulina unida a rodamina (enrojo). El DNA se marcó con Hoechst (azul).+ monastrolhuso normalhuso monopolarT. Mitchison lab


La estructura y dinámica del aparato mitótico depende de la actividadcoordinada y combinatorial de diferentes motoresDineínas corticales que actúan sobre los MTs astrales y kinesinas-C (-) que actúan sobre los MTs polaresantiparalelos de la zona media generan fuerzas opuestas que determinan la longitud del huso.+profaseLa asociación de kinesinas bipolares (+) a los MTs antiparalelos en la zona mediacontribuye a una posterior elongación del huso hasta alcanzar un estado estacionario.prometafase/metafaseSharp et al, Nature 2000


La ruptura del balance de fuerzas entre motores de distintapolaridad altera la longitud del husoEn las figuras se muestran los husos mitóticos de células delevadura marcadas con un anticuerpo anti-tubulina (en verde)husos normalessobre-expresiónde kinesina-Csobre-expresión dekinesinas bipolares(B) células de levaduras normales(C) células que sobreexpresan la kinesina-C Kar3p, de polaridad (-) exhiben el acortamiento del huso.(D) células que sobreexpresan la kinesina bipolar Cin8p, de polaridad (+) revelan el alargamiento del huso.


En profase, los microtúbulos de los centrosomas duplicados incrementanel dinamismo e invaden el centro de la célulaLos complejos Cdk-ciclinas mitóticas (= MPF) incrementan el dinamismo de los microtúbulos duranteprofase mediante la fosforilación y activación de catastrofinas y la inactivación de MAPs estabilizadoras.Los MTs de metafase son másdinámicos que los de interfase (FRAP)Las catastrofinas son proteínas que se unen a los extremos (+) de los MTsy promueven la depolimerización del extremo (+). En contraste, las MAPsse asocian a la pared de los MTs y disminuyen la inestabilidad dinámica.


Ruptura de la envoltura nuclear Captura de cinetocoros por microtúbulosdel huso Alineamiento de cromosomas en la placa ecuatorial


La inestabilidad dinámica de los microtúbulos y la actividad demotores (+) son esenciales para la captura de los cinetocorosInestabilidad dinámica de los microtúbulosRol de motores de polaridad (+): CENP-ECENP-E: centromeric protein-E, es unakinesina asociada al cinetocoro quecontribuye al posicionamiento de loscromosomas en la placa ecuatorial.Lodish et al., 2004


Capturados los cinetocoros los cromosomas se transportana la placa ecuatorial en movimientos oscilatoriosLos movimientos oscilatorios resultan de la actividad de: a) motores asociados al cinetocoro y a los polos yque poseen distinta polaridad; b) motores unidos a la cromatina que se translocan hacia el extremo (+)de los MTs polares y empujan los brazos de los cromosomas hacia la placa de metafase; c) eventosde polimerización y depolimerización del extremo (+) de los MTs del cinetocoro.(c)(b)chromokinesinas son kinesinas-N asociadasa los brazos de los cromosomas.Lodish et al., 2004


El cinetocoro es un complejo multiproteico ensamblado sobrela región de heterocromatina centromérica de los cromosomasMCAK es una kinesina-M asociada ala capa externa del cinetocoro y quedepolimeriza el extremo (+) de MTs.Proteínas de control ocheckpoint mitóticotambién se localizanen el cinetocoro.CENP-E es una kinesina (+) asociadaa la corona fibrosa del cinetocoro quecontribuye a anclar el MT alcinetocoro.(MCAK: Mitotic Centromere-Associated Kinesin)Lodish et al., 2004


Excepto en levaduras el centrómero usualmenteconsiste en secuencias de DNA repetidasDNA centromérico de S. cerevisiaeAlberts et al., 2002


En metafase los cinetocoros de las cromátides hermanasanclan microtúbulos de polos opuestosmicroscopía electrónica debarrido de cromosoma de metafaseInmunolocalización de cinetocoros (rojo)centrómerosMTscromosomascromátides


En Metafase los microtúbulos de los cinetocoros exhibenun estado dinámico de "treadmilling"Demostración experimental del treadmilling. Se muestra un huso mitótico ensamblado in vitro.Los MTs se marcaron con tubulina-rodamina (rojo) y los cromosomas con Hoechst (azul). Lamarca verde representa una fracción de tubulina-fluoresceína activable por un pulso de luz.Note que la fluoresceína activada se desplaza hacia el polo izquierdo.DNAmicrotúbulos1.5minfotoactivación de lafluoresceína unida a latubulina medianteun pulso de UVsuministrado dentro dela región marcada (verde)En el "treadmilling" la adición de subunidades detubulina en el extremo (+) es balanceada por eldesensamble de subunidades en el extremo (-).2.5min


El “treadmilling” de MTs de metafase también puede visualizarse enkimografías empleando “trazas” de tubulina fluorescenteLa técnica consiste en agregar a la preparación de tubulina que va a formar el huso “trazas”de tubulina fluorescente (rojo), de modo que cuando ésta se incorpora a los microtúbuloscon baja frecuencia, genera un patrón de marcas o “speckles” fluorescentes.ABCkimografíapendiente de la línea formadapor la posición de las trazas adistintos tiempos.tubulinafluorescentedistancia*En (A) se esquematiza un microtúbulo marcado con trazas de tubulina fluorescente (en rojo). En (B) se muestra una fotografíadel huso donde se visualizan las marcas o “speckles” fluorescentes. El cambio de posición de las marcas fluorescentesindividuales en función del tiempo puede visualizarse si se analiza una franja o “slice” correspondiente a distintos tiempos y queseon alineadas después de la videomicroscopía (asterisco) (C). La distancia recorrida por las marcas fluorescentes se empleapara calcular la velocidad de translocación de la tubulina en los microtúbulos (~ 0.75 μm/min).Mitchison & Salmon, Nature Cell Biol 2001


tracción de los cinetocoros hacia los polosAnafase A: acortamiento de la fibra del cinetocoro en ambos extremos de los MTsAnafase B: separación de los polos por acción de kinesinas bipolares


Transición metafase anafaseseparación de las cromátidesmetafaseanafase


Distintas fuerzas gobiernan el movimiento de los cromosomasdurante la anafaseANAFASE A: Depolimerización de losMTs de los cinetocoros en los cinetocorosy en los polos.ANAFASE B: Deslizamiento entre MTsantiparalelos polares en el plano ecuatorial mediadopor kinesinas (+). También fuerzas de tracciónejercidas por dineínas corticales.


Evidencia experimental del acortamiento de los MTs de loscinetocoros en el extremo (+).Experimentos de fotodestrucción (photobleaching) de la fluorescencia revelan la depolimerizaciónde los MTs en el cinetocoro, evento que no requiere de ATP y actividad motora.regiónfotodestruídaGorbsky et al JCB 1988


El acortamiento de los MTs del cinetocoro también es demostradoempleando proteínas fluorescentes fotoactivablesTubulina conjugada a fluoresceína fotoactivable es microinyectada en células e incorporada al husoen metafase. Al comienzo de la anafase, la fluoresceína es activada (zona verde). Note que latubulina activada se pierde al mismo tiempo que los cromosomas migran hacia los polos.MCAK es una kinesina asociada al cinetocoro quepromueve la depolimerización del extremo (+) de losMTS. CENP-E es una kinesina que mantiene unidoslos cromosomas a los MTs durante su acortamiento.Zhai et al JCB 1995


Kinesinas inducen el desensamblede los MTs en el cinetocoroy en los polosLas kimografías demuestran que la kinesina KLP10A esrequerida para el flujo de tubulina fluorescente hacia los polos.La inhibición de KLP10A con un anticuerpo, inhibe el flujo.Kinesinas-M, como por ejemplo MCAK,XKCM1, KLP10A y KLP59C, se unen alos extremos de los MTs e inducen eldesensamble.polepoleEn estas kimografías de MTs con trazas de tubulina-rodaminase demuestra que la kinesina KLP59C es requerida para elmovimiento de los cinetocoros (en verde). La inhibición deKLP59C con un anticuerpo, inhibe el efecto de “pac-man”.disassemblydisassemblyRogers et al, Nature 2004


En la anafase B el huso es elongado por la accióncoordinada de kinesinas y dineínasLa inactivación de las kinesinas-C (-), y la acción de las kinesinas bipolares (+) en conjuntocon dineínas corticales contribuyen a la separación de los polos en la anafase B.anafase BSharp et al, Nature 2000


Deslizamiento entre microtúbulos antiparalelosen la zona media del huso


Resúmen de las distintas funciones de las proteínas motoras en la mitosisMotores (+) unidos a los brazos de los cromosomas(cromokinesinas) transportan a los cromosomashacia la placa ecuatorial.Motores (-) anclados a lacorteza celular (dineínas)contribuyen a elongarel huso.La movilidad del cinetocoroinvolucra dos tipos de motores:1) motores (-) asociados ala corona fibrosa traccionanlos cromosomas hacia los polos;2) motores en el interior delcinetocoro promueven eldesensamble de los MTs y elanclaje de los cromosomasal extremo (+).(2)(2)(1)


(División n del citoplasma)Dos mecanismos aseguran que la citoquinesis ocurra al finalizar la mitosis:1. La inactivación de Cdk-ciclinas M mediada por APC-Cadh1.2. La asociación de MTs antiparalelos en la región central del huso que esrequerida para el ensamble del anillo contráctil.


La citoquinesis comienza durante la anafase


El primer cambio morfológico visible de la citoquinesis en una célulaanimal es la aparición de un surco en la superficieMicroscopía electrónica de barrido mostrando el surco de clivado enla superficie de una célula huevo de anfibio


La estructura molecular responsible del surco superficialde clivado es un anillo contráctil de actina y miosinaactinadobleinmunofluorescenciamiosina II


La miosina II es esencial para que ocurra la citocinesisEn etapas anteriores a la citocinesis la miosina II es inhibida por fosforilación mediada por CDK-ciclinas M.Durante telofase, la activación de la fosfatasa Cdc14 y del complejo APC-Cdh1 promueven la defosforilaciónde la miosina y su asociación con el anillo de actina. La contracción del anillo forma el surco de clivado.


Dos modelos proponen roles opuestos de los microtúbulosen la formación del anillo contráctilEl modelo de relajación astral propone que los microtúbulos astrales inhiben la contractilidad en laregión adyacente a la corteza de los polos. Esto permitiría que la contracción ocurra en la cortezaecuatorial de la célula. El modelo alternativo de la estimulación astral propone que los microtúbulosastrales suministran una señal positiva que induce la contracción en la corteza ecuatorial. Unprobable mediador de la contractilidad es la GTPasa Rho.↑Rho-GTP


La asociación de microtúbulos polares antiparalelos en la zona mediaes esencial para la citoquinesisLa asociación de MTs antiparalelos en la zona media del huso (en verde) y el ensamble del anillocontráctil es mediada por la kinesina ZEN-4. La unión de ZEN-4 a los MTs es inhibida porfosforilación mediada por Cdk-ciclinas M. En telofase, la fosfatasa Cdc14 dispara la degradación delas Cdks-ciclinas M y defosforila a ZEN-4.APCCdh1Cdk-M ZEN-4 Cdc14MLCmicroscopía electrónica de barrido mostrandodos células a punto de finalizar la citocinesismicroscopía electrónica de transmisión mostrandoel cuerpo mediomatrizdensaMTs de lazona media

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