virus - Coag

“SITUACIÓN SANITARIA Y RETOS CIENTÍFICOS DE LAAPICULTURA ESPAÑOLA”COAG, Salamanca.Noviembre 2011

AGENDA PARA HOY• Una reflexión sobre la problemática actual• Resumen de los trabajos realizados por nuestro grupo• Nuestras propuestas para el futuro• Conclusiones

Últimos años: problemas• Descenso en el número de abejas presentes en las colmenas.• Problema presente en España desde 2003-2004 (otoño-Invierno). Desde 2005-2006 durante todo el año.• Ninguna causa principal aparente.• Fenómeno denominado Síndrome de despoblamiento de lascolmenas (SDC).VanEngelsdorp y cols., 2009

Síndrome de Despoblamientode las Colmenas (SDC)Desaparición de abejas en lacolmena dejando, en muchoscasos, abundante presenciade miel y cría

Falta debiodiversidadPesticidasFragmentacióndel habitatDisminucióndeNutrientesAlteraciónclimática

CAUSAS1Factores deRiesgo AFactores deRiesgo PHábitatAgentesInfecciosos yParasitarios2Sistema InmuneMetabolismoCiclo BiológicoSistema NerviososCentral comportamiento)3Síndrome deDespoblamiento de ColmenasEFECTOS

Factores deRiesgoF. Producción F. Ambientales• Localización• Bioseguridad• Manejo• Movimientos Nacionales• Importación• Tratamientos• Proximidad deExplotaciones• Nº Colmenas / HaNi• Fragmentación Hábitat• Pérdida de EspeciesVegetales• Presencia Monocultivos• Alteración Climática• Uso de Pesticidas• Urbanización• Contaminación Atmosférica• Degradación Hábitat• Pérdida de Usos del Suelo• Antenas o TendidosEléctricos• Enemigos NaturalesParámetrosde ExpresiónI.FI.BNe

PERDIDA DE HABITAT

PATÓGENOS

Objetivos4. Estudio del sistema inmune de las abejas. Puesta apunto de técnicas para la valoración y estimulaciónde la respuesta inmune1. Desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular(específicas, sensibles y cuantitativas) para losprincipales virus de las abejas. Estudio de nuevosvirus (metagenómica)2. Estudio epidemiológico de la distribución de losprincipales virus de las abejas en España3. Desarrollo de un análisis epidemiológico y defactores de riesgo que afectan a las abejas en España

POR QUE RT-PCR ?• Técnica que detecta el ácido nucleico del virusHUELLA (E)• Aumenta elnúmero departículas del virus(S) hasta obtenermillones de copiasy podervisualizarlas:http://www.thetriplehelix.org/ConvencionalTiempoReal

EN QUE ESTA BASADA LA PCR ?

PCR

1.DESNATURALIZACIÓN3.ELONGACiÓN2.ANILLAMIENTO5’3’3’5’

VisualizarMétodo convencional:Método nuevo:Kukielka et al. 2007

Diagnóstico de virus de abejaAdaptación de técnicas moleculares basadas en RT-PCR en tiempo real para eldiagnóstico de ABPV, CBPV, KBV e IAPVRT-PCRs real time:Más sensiblesPermiten cuantificarEn un paso: Más rápidasVentajas del SYBR Green: se intercala en la doblehebra del ADNLa más barata de los fluoróforosFácil de usarLos mismos reactivos sirven para analizar cualquierfragmento

Diagnóstico de virus de abejaMejora de la sensibilidad de las PCR SYBR® con un nuevo protocoloDetecta hasta 10 -4 Ejemplo: CBPVDetecta hasta10 -6Protocolo antiguoProtocolo nuevo

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Cuantificación viralPuesta a punto de la PCR cuantitativa de ACTINA: gen de referenciaObtención de los estándares de los virus acuantificar

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Estudio epidemiológicoEstudio epidemiológico para la detección de 7 virus de abejas

Estudio EpidemiológicoDistribución geográfica de 7 virus de abejas: resultados 2005-20101 positivo1 positivo13 positivosNIAPV• En todas las CCAAmuestreadas se hanencontrado virus• Los virus encontradosen mayor número demuestras son BQCV yDWV• Primera detección enEspaña de IAPV

Estudio epidemiológicoComparación con otros paísesComparación orientativa:distintos tamaños de muestraESPAÑA(Kukielkaet al.,2008,2009)FRANCIA(Tentcheva etal., 2004;Blanchard etal., 2008)AUSTRIA(Berenyi etal., 2006)HUNGRÍA(Forgách etal., 2007)URUGUAY(Antúnez etal., 2006)BRASIL(Teixeira etal., 2008)ALEMANIA(Siede etal., 2008)BQCV 71 % 86 % 30 % 54 % 10 % - -DWV 79 % 97 % 91 % 72 % 91 % 20.3% -IAPV 0’2 % 14 % - - - 37% -KBV 4 % 17 % 0 % 0 % 0 % - -SBV 0’8 % 86 % 49 % 2 % 10 % 27.1% 70%ABPV 0 % 58 % 68 % 37 % 9 % - -CBPV 12 % 28 % 10 % 0 % 47 % - -

Primera descripción de IAPVen España• Primera descripción de IAPV en Españaen 2008 (Kukielka y Sánchez-Vizcaíno,2010)• Virus muy similar a KBV se añade alestudio virológico• Descrito como potencial indicador delSDC (Cox-Foster y cols., 2007)Nocorroborado en España• Realización del estudio filogenético delas secuencias encontradas paraaveriguar su origen

Primera descripción de IAPVen EspañaEstudio filogenético de lassecuencias del nuevo virusencontrado: IAPV44755726416739364536243319 516561709589967132-SPAIN Andalucia7144-SPAIN Andalucia7133-SPAIN Andalucia7369-SPAIN Andalucia7142-SPAIN AndaluciaSPAIN Navarra7365-SPAIN Andalucia7364-SPAIN Andalucia7154-SPAIN Andalucia777135-SPAIN Andalucia7145-SPAIN Andalucia7130-SPAIN Andalucia7150-SPAIN AndaluciaEU604010 France 2008EU604007 France 2008EU604008 France 20087157-SPAIN AndaluciaEU604006 France 2008EU604009 France 2008 5EU436446 Australia 2008EU122347 Australia 2007EU436456 AustraliaEU436448 Australia 2008EU122348 Australia 2007EU122357 USA 2007100EU122358 USA 2007Las muestras de EU436427 Andalucía Canada 2008 y Navarra no tienen77 EU122349 Australia 200799 EU436432 USA 200861el mismo origen filogenético que la de ValenciaEU436447 USA 20080.0258946466617481323871FJ821506 SPAIN Valencia 2008FJ754324 China 2009EU436455 IsraelEU122350 USA 2007EU122361 USA 2007EU218534 USAEU436443 USA 2008EU122362 USA 2007EU122356 USA 2007AY275710-KBVAF150629-ABPVDos linajesdiferenciados: europeoy americano, que a suvez contienensecuencias de origendistante (comercio??)Relación de las muestrasde Navarra y Andalucíacon las muestrasprincipalmente de FranciaRelación de la muestra deValencia con muestras deEEUU, Asia y AustraliaKukielka et al., 2010

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Detección de nuevos virusMetagenómicaEstudio de la composición genética completa deuna muestra, permitiendo identificar material genéticoexógeno (p.ej.virus) Ideal para virus que no se pueden cultivar: virus de abeja Puede estudiar todos los virus de abeja de una muestraPuesta a punto del protocolo de laboratorioColaboración con otros grupos de investigación

1. ¿QUÉ ES LAMETAGENÓMICA?Queremos detectar nuevos patógenos (virus). Para ello utilizamosun método con el cual se elimina el ADN y ARN del hospedador,conservando los ácidos nucleicos del virus seguido por unaamplificación masiva de los mismos y posterior secuenciación.?Utilizamos tejidos de abejas conlesiones o sintomatología.Y la pirosecuenciación como métodode secuenciación.

NUESTRAS MUESTRASMuestras Utilizadas• Abejas procedentes de Navarra (colmenar depequeño tamaño, 25 colmenas)• Positivo a Parálisis aguda israelí (IAPV), descritocomo indicador del Síndrome deDeespoblamiento de las Colmenas (SCD)• Sospecha de virus asociados a IAPV que influyanen la aparición o no de síntomas.• Trabajamos con tejido (macerado)

RESULTADOS“Smears” indican la presencia de materialgenético distinto al de la abejaPrimera detección en Europa del:Aphid lethal paralysis virus (ALPV)

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Estudio epidemiológicoDiseño y realización de una encuesta epidemiológica sobre la presenciade virus de abeja• Preguntas sobre la localización,el manejo el y estatus sanitario delas colmenas• Realización de 284 encuestas en losmuestreos de España• Realización de 96 encuestasepidemiológicas en las colmenasmuestreadas en Andalucía

Estudio epidemiológicoDesarrollo de una herramienta informática para codificar lainformación de las encuestas epidemiológicas

Estudio epidemiológicoIdentificación de factores de riesgo asociados apresencia de virus en Andalucía13 Factores de riesgo encuestados en 48 colmenares de AndalucíaAnálisis de los 5 factores de riesgo ligados al manejo más importantes y conmejor calidad de datos:-

Estudio epidemiológicoIdentificación de factores de riesgo asociadosal manejo y producción con la presencia devirus en AndalucíaPresencia de 1o más virusBQCVDWVCo-infecciónBQCV-DWVIAPV

Estudio epidemiológicoRealización de muestreos anuales para la detección de 7 virus de abejas•Pretende describir la distribución de los virus en la CCAA de Andalucía (1ª CCAA encenso y 2ª en producción)•Es el muestreo a partir del cual se pondrá a punto la cuantificación viral junto conmuestras con SDC de otras zonas de España ver la implicación de los virus en el SDC•Las encuestas epidemiológicas de este estudio aclararán los posibles factores deriesgo asociados a la presencia de virus96 muestras analizadasen todas las provinciasandaluzas en 2010Monitorización anualde los 7 virus de abejas

Estudio epidemiológicoRealización de muestreos anuales para la detección de 7 virus de abejas:resultadosComparaciónorientativa: distintostamaños de muestraN = 500 N = 96ESPAÑA(Kukielkaet al.,2008,2009)Andalucía2010BQCV 71 % 67%DWV 79 % 26%IAPV 0’2 % 14%KBV 4 % 2 %SBV 0’8 % 0 %ABPV 0 % 0 %CBPV 12 % 0 %

Estudio del Sistema InmuneGran importancia: Marcador clave para entender el papel de algunos factoresTodos los factores que se estudian como posibles causas de SDC puedenafectar al SI, por tanto, el estudio del SI posiblemente aclare el origen de laspérdidas por el SDCObjetivo: Poder valorar la respuesta inmune (inmunosupresión) y su reacciónfrente a infecciones virales

Inmunidad celularPRECURSOR CELULARFagocitosisFunción desconocidaMELANIZACIÓNTipos de hemocitos(Pseudoplusia includens)(A) Prohemocitos,(B) Esferulocitos,(C) Oenocitos,(D) Granulocitos,(E) Plasmatocitos.Scale bar=50 μmCélulascristalNakahara y cols., 2010RECONOCIMIENTOORGANISMOS EXÓGENOSMELANIZACIÓNENCAPSULAMIENTOFAGOCITOSISFAGOCITOSISENCAPSULAMIENTO(Lamelocitos)MELANIZACIÓN: cascada enzimáticaque da como resultado formaciónnódulos de melanina que encapsulanbacterias, protozoos, parásitos ynematodos

Sistema inmune:trabajos en cursoEstudio del SI : extracción de hemolinfa.Caracterización celular y funcional de lasprincipales células. Caracterización y estudiode inmunosupresión frente a mitógenos yantígenos .Evaluación de la RI frente a mitógenos yvirus: cambios funcionalesInfección in vivo con cantidades conocidas devirus DWV en larvas de abejas

Sistema inmune: trabajo encursoEstudio del SI de abejas sanasExtracción de hemolinfa

Caracterización celularEstudio del SI de abejas sanasFrotis de hemolinfa. TinciónGiemsa

Conclusiones• Hemos desarrollado y adaptado nuevas técnicas diagnósticassensibles y específicas que permiten la cuantificación deinfecciones virales en abejas. Tenemos herramientasdiagnósticas para virus.• Hemos establecido por primera vez las prevalencias de los 7principales virus que afectan a las abejas en España eidentificado por vez primera IAPV y ALPV• Hasta ahora no hemos encontrado factores de riesgo ligadaa la presencia viral. Mayores esfuerzos deben ser realizadospara definir mejor los factores de riesgo.• Se están poniendo a punto diferentes técnicas para lacaracterización y cuantificación de la respuesta inmune enabejas.

Visión Global1Factores deRiesgo AFactores deRiesgo PHábitatEpidemiologíaAgentesInfecciosos(VIRUS) yParasitarios23Sistema InmuneMetabolismoCiclo BiológicoSistema NerviosoCentral(Comportamiento)EFECTOSSíndrome deDespoblamiento de Colmenas

Futuro1. Identificación y posterior Integraciónepidemiológica de todos los factores de riesgo y suAnálisis.2. Conocer el papel de los virus en las pérdidas depoblación apícola mediante cuantificación viral yestudios de infección in vivo.3. Continuar desarrollando técnicas de valoración delsistema inmune. Inmunosupresión.4. Correlación epidemiológica y estudios de campo.

Contactohttp://www.sanidadanimal.infojmvizcaino@visavet.ucm.es

GRACIAS