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Herramientas moleculares utilizadas enMedicina GenómicaDr. Miguel Angel Déctor CarrilloM en C María del Carmen Barboza Cerda


COMPLEMENTARIDADDE LOS ACIDOS NUCLEICOSNATURALESTraducciónCodón-AnticodónSplicingTerminación de la transcripción


Hibridación de ácidos nucleicosQUE SE BUSCA• Secuencias de DNA (genes)• Deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, inversiones,duplicaciones, expansión de repetidos, metilación, inestabilidadcromosómica, pérdida de heterogenicidad, inestabilidad demicrosatélites, conversión génica, aneuploidias, etc.• Expresión de genes (transcritos)• Presencia, ausencia, procesamiento, nivel, localizacióntemporal y espacial


Hibridación de ácidos nucleicos• Apareamiento complementario de bases entre dos ácidosnucléicos de cadena sencilla– DNA/DNA– RNA/RNA– DNA/RNA


SondasSegmento de ácido nucléico que seemplea para detectaruna secuencia antiparalela entre una mezclaTipoDNA RNA OligonucleótidoOrigenDNA basado en células,clonación o PCRTranscripción del insertode DNA clonado envectores apropiadosSíntesis químicaCaracteristicasdel materialde inicioPor lo general cadena doble(0.1kb a cientos de kb paraclonas convencionales, 0.1kb>20kb para productos de PCR)Cadena única, casi siemprehasta unos cuantos milesde nucleótidos de largoCadena única; por lo general15-50 nt de largoMarcajeSíntesis de DNA(DNApol)Transcripción in vitro deDNA clonado (RNApol)Marcado final(cinasa de polinucleótido)


Tipos de marca• Radioactiva– dNTPs marcados en posición con 32 P/ 33 P– muy sensible– contaminante– vida media corta del isotopo35S-CTP32P-ATP 32P-ATP• No Radiactiva– dNTPs marcados con biotina odigoxigenina– menor sensibilidad– menor cociente señal/ruido


Desoxiguanina-fluororforoDeoxicitidina-Alexafluor488


Principio básico del ensayo de hibridación


Rigor de hibridación(astringencia)


Métodos de ensayos de hibridación• Hibridación en fase líquida• Hibridación en soporte sólido– Dot blot y Slot blot– Southern blot– Northern blot• Hibridación in situ


Hibridación en fase líquidaDETECCIÓN


ENSAYO DE PROTECCION A NUCLEASASRPA (ensayo de protección a RNasas)


Hibridación Southern blot


DIAGNOSTICO MEDIANTE SOUTHERN BLOTMetiladas5.7kb5.3kb5.2kbNoMetiladas3.2kb2.8kb


Hibridación Dot-blot y Slot-blot


Hibridación Northern blot


Hibridación en fase sólida(esquema general)


Hibridación in situ


FISH


Herramientas moleculares• PCR• Secuenciación• Microarreglos


PCR• Amplificación directa de un gen o unfragmento de DNA, o indirectamente de unRNA (cDNA)• Conocer la secuencia de una parte de laregión de DNA o RNAOBJETIVOAmplificar DNA


PCR


Aplicaciones de la PCR• Clonación acelular de fragmentos de DNA• Detección de secuencias sin purificación previa• Secuenciación de ácidos nucleicos• Detección de polimorfismos de secuencia• Rastreo de mutaciones• Tipificación de DNA para transplantes• Diagnóstico de enfermedades genéticas• Detección de genes relacionados con el cáncer• Identificación de individuos (paternidad, forense, arqueológico, evolutivos)• Detección de microorganismos infecciosos• Detección de células tumorales


Microarreglos


Secuenciación

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