Evaluación del potencial probiótico de bacterias ácido lácticas para ...

C. Cueto y S. Aragón / Scientia Agropecuaria 1(2012) 45 - 50incluso supera las muertes violentas o porcánceres combinados. En países desarrollados,el 70% de la población está enriesgo de desarrollar enfermedades deorigen cardiaco (Roth, 2010), la cual seencuentra sin tratamiento a pesar de queéste es económico y de fácil acceso, por loque se están promoviendo actividades deprevención, que incluyen disminuir el usode tabaco, realizar actividad física yconsumir alimentos saludables.Entre los alimentos saludables están losenriquecidos con microorganismos probióticoscomo bacterias ácido lácticas (BAL),y se ha visto que uno de los principalesbeneficios sobre la salud del consumidorprobablemente sea la reducción decolesterol sérico (Pereira et al. 2003).Se han realizado algunos estudios de cepasbacterianas con potencial reductor decolesterol y conocido algunos mecanismosque logran esta reducción como son ladesconjugación de las sales biliares poracción de la enzima hidrolasa (BSH) (E.C.3.5.1.24) activa en muchas especies BAL(Lye et al., 2010) y la absorción delcolesterol en el lumen intestinal. Laadsorción de colesterol incrementa sudemanda para la síntesis de nuevos ácidosbiliares o por reducción de la solubilidaddel colesterol. Algunos autores hanreportado la capacidad de las bacterias deincorporar a la membrana o adherircolesterol a la superficie, reduciendo ladisponibilidad para su absorción intestinaly posterior pase a la sangre (Belviso et al.,2009).El presente estudio evaluó el potencialprobiótico, de cinco BAL aisladas dematrices lácteas de productos autóctonoscolombianos, para adsorber colesterol ydesconjugar las sales biliares, a través depruebas in vitro como con posterioraplicación a nivel industrial en el diseño ydesarrollo de productos alimenticios.2. Material y métodosAislamientos de cepas de LactobacillusSe realizaron aislamientos de cepas deLactobacillus a partir de nueve muestras de-46-suero costeño, provenientes de losdepartamentos de Sucre y Córdoba(Colombia) (Cueto et al., 2007). Comoreferencia se utilizaron las cepasLactobacillus acidophilus ATCC 4356(Liong y Shah, 2005) y Lactobacillusfermentum ATCC 9338 (Gardiner et al.,2002) provenientes del cepario de laFacultad de Ingeniería de la Universidadde La Sabana (Chía, Cundinamarca,Colombia). Los aislamientos se conservarona -80°C en caldo Man RogosaSharpe (MRS) y 30% de glicerol (v/v). Lasbacterias fueron incubadas 24 h en medioMRS en condiciones aeróbicas a 37°C,antes de realizar los ensayos.Simulación de tolerancia a jugo gástricoy sales biliaresLa resistencia a pH 2.0 y la tolerancia asales biliares se determinó según métodologíapropuesta por (Guo et al., 2010). Seajustó el pH a 2.0 del caldo MRS con HCl6M, se inoculó 100 µL del microorganismoa evaluar, se incubó por 2 h a 37°Cy se realizó un recuento inicial en placa delcultivo y uno después de las 2 h deincubación. La tolerancia a sales biliares serealizó enriqueciendo el caldo MRS con0.3% sales biliares (Sigma B8756) einoculando 100 µL de la cepa a evaluar, seincubó por 2 h a 37°C y se realizó unrecuento en placa inicial del cultivo y unodespués de las 2 h de incubación. Elporcentaje de supervivencia fue calculadomediante la siguiente ecuación (1):Donde N 1 representa el total de célulasviables después del tratamiento y N 0 elnúmero inicial microorganismos inoculados(Bao et al., 2010).Determinación de la resistencia a antibióticosde importancia epidemiológicaSe realizó la prueba de difusión agar, concepas cultivadas en caldo MRS a 37°Cdurante 8 h y recogidas las células porcentrifugación. Se evaluó la sensibilidad delas células a antibióticos vancomicina ycefoxitin en placa, incubación a 37°C por

C. Cueto y S. Aragón / Scientia Agropecuaria 1(2012) 45 - 5024 h y luego se determinó el diámetro deinhibición.Identificación molecular de cepas deLactobacillusLa extracción de ADN bacteriano serealizó mediante el Kit UltraCleanMicrobial DNA Isolation (Mo BioLaboratories). Se amplificaron 700 pb dela región 16s RNA, empleando losprimers: 27 F: 5`- GAG AGT TTG ATCCTG GCT CAG-3`, 787 R: 5´CTA CCAGGG TAT CTA AT - 3´ (Mori et al.,1997). Los amplímeros se secuenciaron yanalizaron bioinformáticamente mediantelos programas CLUSTALW y BLAST.Actividad de la enzima hidrolasa desales biliares (BSH)La actividad de la enzima BSH se realizósegún método de (Liong y Shah, 2005). Elcontenido de proteínas fue cuantificado porel método de ácido bicinconínico (Sigma),con lectura de absorbancia a 595 nm. Laconcentración de proteínas se calculóbasada en la curva de calibración conalbúmina 1 mg.L -1 .Adsorción de colesterolLa disminución de colesterol del medio decultivo se determinó siguiendo la propuestade Kimoto et al. (2002); se utilizócultivos en caldo MRS con 0.2% (p/v) detioglicolato, suplementado con 0.2% detauracolato y glucolato de sodio comosales biliares y con adición de una soluciónde colesterol para concentración final de70 µg.ml -1 .Análisis estadísticoLos ensayos fueron analizados portriplicado. Los resultados obtenidos seanalizaron mediante ANOVA a un nivel designificancia de 5% (p

C. Cueto y S. Aragón / Scientia Agropecuaria 1(2012) 45 - 50Del análisis de resistencia a pH 2.0 y toleranciaa sales biliares 0.3%, condicionesque afectan la supervivencia bacterianadurante su paso a través de un modelo invitro del tracto gastrointestinal durante las2 h que tarda la comida en atravesar elsistema (Urbanska et al., 2007), se observóque el 48.6% de las cepas estudiadasfueron capaces de sobrevivir a las condicionespropuestas por el estudio.De las cepas seleccionadas como microorganismoscon potencial probiótico, la cepaK72 fue la que presentó mayor toleranciaante las condiciones de pH 2.0 y salesbiliares 0.3%, disminuyendo en promedio2.1±0.2 unidades logarítmicas y la cepaque presentó menor tolerancia fue K11disminuyendo en promedio 4.9±0.2unidades logarítmicas. Los resultadospresentados en la Tabla 1 son consistentescon los reportados por (Vizoso et al.,2006), quienes evalúan el comportamientode las cepas de Lactobacillus aisladas deheces fecales en niños y en productoslácteos fermentados típicos de Kenia,observando una disminución entre 2 y 3unidades logarítmicas.Resistencia a antibióticos de importanciaepidemiológicaSe seleccionaron las 26 cepas que toleraronsimultáneamente las condiciones de pH 2.0y 0.3% de sales biliares para realizar elanálisis de resistencia a antibióticos ycinco cepas fueron sensibles antevancomicina y cefoxitín. Estas seidentificaron molecularmente medianteanálisis bioinformático; se obtuvieronsecuencias en promedio de 773.8± 36.6 pbde los amplímeros de la región 16S RNA.La totalidad de las cepas evaluadaspresentó homología del 87.3±3.3% frente aLactobacillus fermentum.La resistencia ante los antibióticos es uncreciente problema por ser fácilmentetransferible entre microorganismos.Hummel et al. (2007) reportan que laresistencia a cefoxitin genera mutacionespuntuales que confieren resistenciaadicional a las quinolonas obligando a loshospederos, el consumo de antibióticosnefrotóxicos. También importa prevenir lageneración de Enterococcus vancomicinaresistentes, agentes de infeccionesnosocomiales, quienes adquieren la resistenciapor mecanismos de trasferenciahorizontal y cuyas patologías adyacentesson de mal pronóstico clínico (Ray et al.,2003), razón por la cual, las cepas quemanifestaron resistencia a los antibióticosfueron excluidas del estudio.Actividad de la enzima BSHLas cepas 1_1, K72 y el control L.fermentum ATCC 9338 no mostraronactividad de la enzima BSH, probablementepresenta actividad frente a otrossustratos como taurodeoxicolato de sodio ono poseen el gen, el cual se trasfiere deforma horizontal entre cepas de la mismaespecie (Elkins et al., 2001). La cepa conmayor actividad total y específica fue K75;la cepa control L. acidophilus ATCC 4356,presentó las menores actividades.El análisis estadístico mostró que no haydiferencias estadísticamente significativasentre las muestras al medir las proteínastotales, pero sí existen entre la actividadtotal y la actividad específica halladas,para un α = 0.05 (Tabla 2).Tabla 2Actividad enzimática BSH.aCepaActividadtotal(U mL -1 )Actividadespecífica(U mg -1 )1_1 N/A N/AaK11 1.08±0.13a1.41±0.01K72 N/A N/AaK73 1.73±0.22aK75 2.02±0.06L. fermentumN/AATCC 9338L. acidophilusaATCC 4356 1.02±0.09a3.20±0.10a3.5±0.10N/Aa1.54±0.14Los valores con la misma letra no presentandiferencias estadísticamente significativas paraα=0.05.-48-

C. Cueto y S. Aragón / Scientia Agropecuaria 1(2012) 45 - 50Las sales biliares son uno de losprincipales compuestos de la bilis y elproducto final de la degradación delcolesterol. Durante su tránsito por elintestino, entre el 5 y 10% de las salesbiliares son desconjugadas por la acción dela enzima BSH, producida intracelularmentepor los microorganismos pertenecientesa la flora intestinal, el ser humanono es capaz de producir la enzima (Jeun etal., 2010). Al existir mayor cantidad demicroorganismos productores de la enzimaBSH, como las cepas estudiadas, habrámayor influencia sobre el metabolismo delcolesterol y posterior reducción decolesterol sérico (Huang et al., 2011).Los resultados obtenidos son comparablesa los reportados por Liong y Shah (2005),obteniendo actividades enzimáticas superioresal comparar los valores de la cepacontrol L. acidophilus ATCC 4356, quemostró ser la de menor actividadenzimática, 0.45±0.22 U mL -1 ; en esteestudio se observó la misma cepa conactividad de 1.02±0.09 U mL -1 ; esto puededeberse a las modificaciones realizadas a latécnica para medición de aminoácidos.Adsorción de colesterolLas cinco cepas presentaron la capacidadde adsorber el colesterol en diferentesproporciones, siendo concordante con elanálisis estadístico que mostró diferenciasestadísticamente significativas entre lasmuestras con un α=0.05. La cepa queadsorbió en mayor porcentaje el colesterol(70µg.mL -1 ) presente en el medio decultivo fue K73 y la de menor capacidadde adsorción fue K75. La totalidad de lascepas evaluadas adsorbieron el colesterolen diferentes proporciones: la K73removiendo un 53.06±2.69 µg.mL -1 delmedio de cultivo y la de menor capacidadfue K75 removiendo 7.23± 2.69 µg.mL -1 .Los resultados muestran que no existerelación entre la actividad enzimática y lacapacidad de adsorber el colesterol entrelas cepas estudiadas. La capacidad deadsorber el colesterol es un proceso físicoy se ve limitado por las necesidades defortalecimiento de la membrana dadas porla adversidad del medio (Kimoto et al.,2002), razón por la cual se hace mayorénfasis en este estudio a la producciónenzimática; aun así, microorganismos conambas capacidades tendrían un mayorefecto sobre los niveles de colesterol delhospedero, puesto que se vería tratado pordos mecanismos complementarios.4. ConclusionesEl estudio mostró que la cepa con mayorpotencial hipocolesterolémico y con máscaracterísticas probióticas, aisladas a partirde suero costeño colombiano, fue K73.Éste resultado constituye una alternativapara personas que presentando nivelesaltos de colesterol sérico se encuentran enriesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares.Referencias bibliográficasBao, Y; Zhang, Y; Liu, Y; Wang, S; Dong, X; Wang, Y;Zhang, H. 2010. Screening of potential probioticproperties of Lactobacillus fermentum isolated fromtraditional dairy products. Food Control 21(5): 695-701.Belviso, S.; Giordano, M.; Dolci, P.; Zeppa, G. 2009. Invitro cholesterol-lowering activity of Lactobacillusplantarum and Lactobacillus paracasei strains isolatedfrom the Italian Castelmagno PDO cheese. DairyScience Technology 89(2): 169-176.Cueto, C.; García, D.: Garcés, F.; Cruz, J. 2007.Preliminary studies on the microbiologicalcharacterization of lactic acid bacteria in Suerocosteño, a Colombian traditional fermented milkproduct. Revista latinoamericana de microbiología 49:11-17.Elkins, C. A.; Moser, S. A.; Savage, D.C. 2001. Genesencoding bile salt hydrolases and conjugated bile salttransporters in Lactobacillus johnsonii 100-100 andother Lactobacillus species. Microbiology 147(12):3403-3412.Gardiner, G. E.; Heinemann, C.; Bruce, A. W.; Beuerman,D.; Reid, G. 2002. Persistence of Lactobacillusfermentum RC-14 and Lactobacillus rhamnosus GR-1but not L. rhamnosus GG in the human vagina asdemonstrated by randomly amplified polymorphicDNA. Clinical and Vaccine Immunology 9(1): 92-96.Guo, X. H.; Kim, J. M.; Nam, H. M.; Park, S.Y. 2010.Screening lactic acid bacteria from swine origins formultistrain probiotics based on in vitro functionalproperties. Anaerobe 16(4): 321-326.-49-

C. Cueto y S. Aragón / Scientia Agropecuaria 1(2012) 45 - 50Huang, X.; Auinger, P.; Eberly, S.; Oakes, D.;Schwarzschild, M.; Ascherio, A.; Investigators, P. S.G. D. 2011. Serum cholesterol and the progression ofParkinson's disease: results from DATATOP. PLoSOne, 6(8), e22854.Hummel, A.; Hertel, C.; Holzapfel, W.; Franz, C. 2007.Antibiotic Resistances of Starter and Probiotic Strainsof Lactic Acid Bacteria. Applied and EnvironmentalMicrobiology 73 (3): 730–739.Jeun, J.; Kim, S.; Cho, S.Y.; Jun, H.; Park, H.J.; Seo, J.G.;Lee, S.J. 2010. Hypocholesterolemic effects ofLactobacillus plantarum KCTC3928 by increased bileacid excretion in C57BL/6 mice. Nutrition 26(3): 321-330.Kimoto, H.; Ohmomo, S.; Okamoto, T. 2002. Cholesterolremoval from media by lactococci. Journal of dairyscience 85(12): 3182-3188.Liong, M.T.; Shah, N.P. 2005. Bile salt deconjugationability, bile salt hydrolase activity and cholesterol coprecipitationability of lactobacilli strains. InternationalDairy Journal 15(4): 391-398.Lye, H.S.; Rusul, G.; Liong, M.T. 2010. Removal ofcholesterol by lactobacilli via incorporation andconversion to coprostanol. Journal of Dairy Science93(4): 1383-1392.Ministerio de la Protección Social. República de Colombia2007. Situación de Salud en Colombia IndicadoresBásicos. Disponible en: http://www.minproteccionsocial.gov.co/VBeContent/NewsDetail.asp?ID=15895&IDCompany=3.Mori, K.; Yamazaki, K.; Ishiyama, T.; Katsumata, M.;Kobayashi, K.; Kawai, Y.; Shinano, H. 1997.Comparative sequence analyses of the genes codingfor 16S rRNA of Lactobacillus casei-related taxa. Int JSyst Bacteriol 47(1): 54-57.Pereira, D.I.A.; McCartney, A.L.; Gibson, G.R. 2003. Anin vitro study of the probiotic potential of a bile-salthydrolyzingLactobacillus fermentum strain, anddetermination of its cholesterol-lowering properties.Applied and environmental microbiology 69(8): 4743-4752.Ray, A.; Pultz, N.; Bhalla, A.; Aron, D.; Donskey, C. 2003.Coexistence of vancomycin-resistant enterococci andStaphylococcus aureus in the intestinal tracts ofhospitalized patients. Clin Infect Dis. 37(7): 875-881.Roth, G. F; Mokdad S.; Aekplakorn A.; Hasegawa W.; LimT. 2011. High total serum cholesterol, medicationcoverage and therapeutic control: an analysis ofnational health examination survey data from eightcountries. Bulletin of the World HealthOrganization 89: 92-101.Urbanska, A.M., Chen, H., Prakash, S. 2007. Investigationof microencapsulated BSH active Lactobacillus in thesimulated human GI tract. Journal of Biomedicine andBiotechnology, 13684.Vizoso-Pinto, M.G.; Franz, C.M.A.P.; Schillinger, U.;Holzapfel, W.H. 2006. Lactobacillus spp. with in vitroprobiotic properties from human faeces and traditionalfermented products. International journal of foodmicrobiology 109(3): 205-214.-50-