XLI Congreso Anual de la Asociación Española para el Estudio del Hígado

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XLI Congreso Anual de la Asociación Española para el Estudio del Hígado 31

te 16-30 semanas para obtener ratas en las diferentes fases de

progresión de la fibrosis hepática, y 15 ratas sanas fueron utilizadas

como control. Se recogieron muestras de suero, hígado y otros órganos.

Se determinó el nivel de fibrosis hepática mediante tinción

Sirius Red, y se evaluaron los parámetros hemodinámicos y los parámetros

bioquímicos de función hepática en suero. Se analizó la

expresión génica y proteica de DLK1 y de factores profibrogénicos

y proinflamatorios en los diferentes tejidos de rata recolectados,

mediante Real-Time PCR y Western Blot respectivamente. Asimismo,

se determinaron los niveles séricos de DLK1 mediante ELISA.

Resultados: Se clasificaron las ratas en 4 grupos en función del

contenido hepático de fibra: 1) ratas control, 2) ratas con fibrosis

moderada, 3) ratas con fibrosis grave y 4) ratas cirróticas. Los parámetros

hemodinámicos y bioquímicos confirmaron el empeoramiento

progresivo de la función hepática al avanzar la fibrosis hepática

en estos animales. Se observó un incremento progresivo de

la expresión génica de DLK1 en hígado, aumentando 90 veces en los

cirróticos respecto a los controles, sin embargo no se observaron

cambios en la expresión de DLK1 en el resto de órganos analizados

(corazón, riñón, pulmón, cerebro, aorta y bazo). Se observó también

un aumento progresivo de proteína DLK1 en hígado al avanzar

la fibrosis. La expresión proteica de DLK1 en los hígados evoluciona

de manera paralela a la expresión de otros factores profibrogénicos

(AII y TGF-b). Además, se determinó que los niveles circulantes de

DLK1 estaban incrementados en el suero de animales con fibrosis y

cirrosis, existiendo una estrecha relación entre la intensidad de la

fibrosis hepática y los niveles circulantes de DLK1.

Conclusiones: Los resultados de este estudio muestran que la

expresión de DLK1 está estrechamente relacionada con la severidad

de la fibrosis hepática, y que el aumento de expresión de DLK1

en hígado da lugar a un incremento de la proteína soluble, que

actúa como factor profibrogénico en el proceso de la fibrosis hepática.

Agradecimiento: Este estudio ha sido financiado por el Ministerio

de Economía y Competitividad (SAF2012-35979).

P-5. EL INFLAMASOMA NLRP3 EN LA ENFERMEDAD

HEPÁTICA. MODULACIÓN POR MEDIADORES LIPÍDICOS

DE RESOLUCIÓN

A. Lopategi a , B. Rius a , C. López-Vicario a , J. Alcaraz-Quiles a ,

V. García-Alonso a , E. Titos a,b y J. Clària a,b,c

a

Servicio de Bioquímica y Genética Molecular, Hospital Clínic-

IDIBAPS, Barcelona. b Centro de Investigación Biomédica en Red de

Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd). c Departamento

de Ciencias Fisiológicas I, Universidad de Barcelona.

El inflamasoma es un complejo multiproteico que promueve la

maduración de pro-interleucina (IL)-1beta e IL-18, mediante el

procesamiento proteolítico mediado por caspasa-1. Aunque existe

una gran variedad de inflamasomas que se activan en respuesta a

diferentes estímulos, el más estudiado y de mayor interés es el inflamasoma

NLRP-3, formado por NLRP-3, ASC y caspasa-1. Este inflamasoma

se expresa en células inmunes, mayormente macrófagos,

pero también en otras células, incluso epiteliales. En nuestro

laboratorio hemos observado recientemente que el inflamasoma

juega un papel esencial en la propagación y cronicidad del componente

inflamatorio existente en un amplio espectro de las enfermedades

hepáticas. En este sentido hemos observado un distinto

grado de activación del inflamasoma NLRP3, ASC y caspasa-1 en

leucocitos polimorfonucleares y monocitos circulantes procedentes

de pacientes con enfermedad hepática crónica dependiendo de su

grado de descompensación y de la presencia o no de fallo hepático

agudo sobre crónico. También hemos observado diferencias en la

expresión de los componentes del inflamasoma in vivo en un modelo

experimental de enfermedad hepática por hígado graso de origen

no alcohólico e in vitro en hepatocitos primarios sometidos a

un modelo de hipoxia. Con el objetivo de proponer una nueva estrategia

de modulación del componente inflamatorio en las enfermedades

hepáticas crónicas, en el presente estudio investigamos la

posibilidad de desactivar el inflamasoma mediante mediadores lipídicos

anti-inflamatorios y pro-resolutivos. Para ello, exploramos

el efecto de la resolvina D1 (RvD1) y la RvD2 a nivel in vitro, en

macrófagos derivados de medula ósea expuestos a LPS y ATP, modelo

clásico de activación del inflamasoma NLRP3, e in vivo, en un

modelo de peritonitis inducida por zimosano. Los resultados obtenidos

indican que ambas moléculas (RvD1 y RvD2) son capaces de

modular la expresión de componentes del inflamasoma NLRP3, resultando

en una disminución de la expresión de IL-1beta tanto a

nivel de RNA como de proteína. De manera similar, RvD1 y RvD2

atenuaron la activación del inflamasoma in vitro en respuesta a LPS

y ácido palmítico. Igualmente, RvD1 y RvD2 disminuyeron la expresión

de NLRP3 y de ASC en macrófagos intra-peritoneales, mientras

que aumento la expresión de caspasa-1 en la primera fase de este

proceso inflamatorio. Como consecuencia, se redujo en estos macrófagos

la secreción de IL-1beta. Otros genes inflamatorios, como

MCP-1, aparecieron reducidos; mientras que los marcadores de macrófagos

resolutivos M2 como Arg1, CD206 y Ym1 aparecieron sobre-expresados

con el tratamiento con RvD1 y RvD2. En su conjunto,

los resultados del presente estudio proporcionan los primeros

datos que indican que es posible regular tanto en células inmunes

como en células hepáticas, el inflamasoma mediante el uso de mediadores

lipídicos pro-resolutivos.

P-6. DIFERENCIACIÓN DIRECTA DE CÉLULAS MADRE

PLURIPOTENTES (IPSC) HUMANAS A CÉLULAS

ESTRELLADAS HEPÁTICAS

M. Coll a , L. Perea a , R. Boon b , D. Rodrigo-Torres a , D. Blaya a ,

M. Llopis a , I. Graupera a , B. Aguilar a , C. Vefaillie b , P. Ginès c

y P. Sancho-Bru a

a

Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer

(IDIBAPS), Barcelona. b Department of Development and

Regeneration, Stem Cell Institute, Leuven, Bélgica. c Unidad de

Hepatología, Hospital Clínic, Universidad de Barcelona, IDIBAPS,

CIBERehd, Barcelona.

Introducción y objetivos: En un hígado sano, las células estrelladas

hepáticas (HSC) son las responsables de la homeóstasis de la

matriz extracelular y del almacenamiento de vitamina A. Distintos

estudios demuestran que los co-cultivos de hepatocitos y HSC representan

un buen sistema in vitro para realizar ensayos fibrogénicos

y toxicológicos. Recientemente, se han propuesto diferentes

protocolos de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas

(iPSC) a hepatocitos, en cambio, no existe ninguna fuente

renovable para las HSC. El presente estudio tiene como objetivo

desarrollar un protocolo para generar HSC derivadas de iPSC humanas.

Métodos: El protocolo de diferenciación que se ha optimizado se

basa en el desarrollo embrionario del hígado. Las poblaciones celulares

intermedias se caracterizaron mediante el análisis de la expresión

génica y por FACS. La población final obtenida se caracterizó

por qPCR, inmunostoquímica y por un análisis transcriptómico.

Además, se realizó un estudio funcional de las células diferenciadas.

Resultados: Mediante la estimulación secuencial con citoquinas

que participan en el desarrollo embrionario del hígado, células iPSC

fueron diferenciadas a una población enriquecida con células parecidas

a las HSC. Las poblaciones intermedias obtenidas durante el

proceso de diferenciación fueron caracterizadas: células multipotentes

derivadas de mesodermo (NCAM+, KDR+), mesenquimales

hepáticas (PDGFRa+, CD73+), mesoteliales (DESMIN+, P75NTR+,