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RVCTA Volumen 8 - Número 2

117 Rev. Venez. Cienc.

117 Rev. Venez. Cienc. Tecnol. Aliment. 8(2):116-129. Abstract The reference methodology to investigate Salmonella is traditional culture, however, it is a laborious technique and requires several days of processing. Genotypic methods are an effective alternative to this problem. The aim of this study was to develop a Salmonella detection method based on Polimerase Chain Reaction in lettuce samples (Lactuca sativa L. var. Capitata) for its implementation in a microbiology laboratory in the city of Rosario, Argentina. The Polimerase Chain Reaction technique was used for the detection of the invA gene because it is specific to the Salmonella genus. Validation was performed by the determination of inclusivity, exclusivity, and limit of detection. The limit of detection was 1.0 µg/mL DNA. The technique presented an inclusivity and exclusivity of 100 %, and showed a very good degree of agreement with respect to the cultivation technique. This work allowed us to demonstrate the feasibility of using Polimerase Chain Reaction to detect Salmonella in lettuce samples; however, it is necessary to standardize this methodology according to the conditions of each laboratory and of the food to be processed to ensure its diagnostic validity. Key words: invA , lettuce, PCR, Salmonella, screening, validation. INTRODUCCIÓN Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) han sido catalogadas por expertos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) como el problema de salud pública más diseminado en el mundo contemporáneo. La OMS estimó que, en el año 2005, murieron aproximadamente 1,8 millones de personas debido a enfermedad diarreica asociada a la ingesta de agua o alimentos contaminados (Barrantes y Achí, 2011). La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. La tasa de incidencia de la infección es mayor en los lactantes, en niños de corta edad y en ancianos, por lo que se la considera de alto impacto para la salud pública. La transmisión de Salmonella ocurre a través de aguas, alimentos contaminados y de persona a persona (Eley, 1994; Caffer et al., 2008). La presencia de Salmonella en un alimento se considera peligrosa y, por lo tanto, no apto para el consumo humano. A pesar de los controles que se han puesto en práctica, las infecciones por Salmonella, debidas al consumo de alimentos contaminados, continúan siendo un problema serio con millones de casos que ocurren anualmente en todo el mundo, provocando grandes pérdidas económicas (Parra et al., 2002; Caffer et al., 2008). En Estados Unidos, en el período 1996- 2006, Salmonella fue uno de los patógenos frecuentemente relacionado con ETA. En este país, durante el 2005 y el 2006 se registraron 4 brotes por consumo de tomate, con 459 casos de salmonelosis confirmados por cultivo, mientras que en el año 2006 se registraron 121 brotes, con más de 3300 casos (Barrantes y Achí, 2011). En Europa, entre 1990-1992, Salmonella fue responsable del 83 al 87 % de los brotes de ETA registrados. Su presencia se detectó en vegetales frescos de exportación (lechugas, mostaza, albahaca, tubérculos, entre otros), con una frecuencia de 1,9 a 8,0 % (Barrantes y Achí, 2011). En Argentina, entre las bacterias frecuentemente asociadas a ETA se encuentran Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Clostridium perfringens. En nuestro país, durante el período 2010-2012, en el Laboratorio Nacional de Referencia se

Casabonne, Cecilia et al. 118 caracterizaron y subtipificaron aislamientos relacionados con 11 brotes alimentarios causados por Salmonella spp. (64 % por Salmonella Typhimurium) (DB-INEI et al., 2012). Por ello, la vigilancia de Salmonella spp. en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los alimentos constituye un elemento importante en la investigación de la epidemiología de la salmonelosis transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementación de estrategias eficientes de control de esta enfermedad (Caffer et al., 2008). En los programas de monitoreo y control es esencial contar con métodos de laboratorio eficientes para el aislamiento, identificación y tipificación de Salmonella spp. Tradicionalmente, los métodos microbiológicos empleados para detectar patógenos en los alimentos han sido métodos basados en el cultivo microbiológico. Puntualmente, el método tradicional de detección de Salmonella comprende 4 fases: una primera fase de preenriquecimiento no selectivo, una segunda fase de enriquecimiento selectivo, un paso adicional de aislamiento en medios sólidos selectivos, y una última fase de confirmación mediante pruebas bioquímicas y serológicas. Estos procesos tradicionales de cultivo son laboriosos y complejos en su procesamiento y prolongan la obtención de los resultados hasta una semana (Li y Mustapha, 2004; Jasson et al., 2010). Como una alternativa a esta problemática, el desarrollo de las técnicas de biología molecular para la detección de microorganismos, fundamentalmente los métodos basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (‘Polimerase Chain Reaction’), o PCR, por sus siglas en inglés, proporcionan una estrategia rápida y sensible para la detección de diferentes patógenos (Feng et al., 2001; Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004; Jasson et al., 2010). La detección de Salmonella mediante técnicas moleculares se basa fundamentalmente en la detección del gen invA, específico para el género Salmonella (Singer et al., 2006). Este gen, codificado en el cromosoma bacteriano en una región conocida como isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI1), se encuentra directamente relacionado con el proceso de invasión al epitelio intestinal (Chacón et al., 2010). El objetivo de este trabajo fue evaluar un método basado en la PCR para la detección de Salmonella spp. en muestras de lechuga (Lactuca sativa L. var. Capitata) para su implementación en un laboratorio de microbiología de alimentos de la ciudad de Rosario, Argentina. MATERIALES Y MÉTODOS Muestra de alimento Para el desarrollo de esta metodología se empleó lechuga (Lactuca sativa L. var. Capitata), adquiridas en locales comerciales de la ciudad de Rosario, Argentina. Las hojas de lechuga fueron sometidas a un proceso de lavado-desinfección con solución acuosa de cloro para reducir la carga microbiana. Bacterias utilizadas Se utilizaron las cepas control de calidad Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC 25922, 50 aislamientos de Salmonella spp. de origen humano, animal y alimentario, y 30 cepas de microorganismos diferentes a Salmonella spp. de origen humano, animal y alimentario, provenientes de la colección de cepas perteneciente al grupo de investigación del Área Bacteriología, Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la Universidad Nacional de Rosario (Argentina). Se siguieron lineamientos de la AOAC International (2012). Técnica de cultivo A 225 mL de caldo lactosado (Oxoid,

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